華蟾素注射液對乳腺癌MDA-MB-231細胞E-cad、N-cad表達的影響

許雷來郎雅麗謝璐帆謝小紅

華蟾素注射液對乳腺癌MDA-MB-231細胞E-cad、N-cad表達的影響

許雷來1郎雅麗1謝璐帆1謝小紅

目的觀察華蟾素注射液對乳腺癌MDA-MB-231細胞E-cad、N-cad表達的影響，探討華蟾素注射液對乳腺癌細胞上皮間質轉化（EMT）的影響，探討華蟾素注射液抑制乳腺癌轉移機制。方法采用四氮唑藍（MTT）比色法觀察高、中、低劑量華蟾素注射液（100mg/L、25mg/L、6.25mg/L）對MDA-MB-231細胞增殖的影響；實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測法檢測MDA-MB-231細胞中E-cad/N-cad mRNA表達水平；蛋白印跡法（Westernblot）檢測MDA-MB-231細胞中E-cad/N-cad蛋白表達水平。結果高濃度組華蟾素注射液48h對MDA-MB-231細胞抑制率較中、低劑量組明顯（54.54%比50.20%、37.80%），差異有統計學意義（P<0.05），qRT-PCR實驗結果顯示空白對照組、華蟾素注射液高劑量組、中劑量組、低劑量組E-cad相對表達量依次為（1.05±0.04）%、（8.77± 1.54）%、（3.74±1.56）%、（1.64±0.30）%，N-cad相對表達量依次為（1.18±0.19）%、（0.34±0.19）%、（0.79± 0.20）%、（0.84±0.07）%。華蟾素可以上調E-cad表達，下調N-cad表達，與空白對照組比較差異有統計學意義（P<0.01）。Westernblot結果顯示華蟾素注射液能降低N-cad蛋白的表達，上調E-cad蛋白的表達。結論華蟾素能通過上調E-cad表達和下調N-cad表達，抑制MDA-MB-231細胞的上皮間質轉化（EMT）轉變，從而降低乳腺癌MDA-MB-231細胞的轉移能力。

乳腺癌；MDA-MB-231細胞；華蟾素注射液；E-cad/N-cad

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，乳腺癌經手術治療后5年內仍然有50%的患者出現復發轉移。腫瘤的轉移或侵襲是復發轉移的主要原因，而其中上皮間質轉化（EMT）的發生起到至關重要的作用[1]。EMT過程中主要分子標志的改變包括細胞黏附相關基因E-鈣黏蛋白（E-cadherin）表達下調，間葉細胞標志物N-鈣黏蛋白（N-cadherin）表達上調[2]。華蟾素注射液主要成分是蟾毒靈和吲哚生物堿等，為干蟾皮的水化萃取物，有研究發現華蟾素對乳腺癌細胞侵襲和轉移具有抑制作用[3]，但其作用機制是否與EMT相關尚未見報導。本實驗通過觀察華蟾素注射液對乳腺癌MDA-MB-231細胞E-cad、N-cad表達的影響，探討華蟾素注射液抑制乳腺癌轉移的作用機制。

1 實驗材料

1.1 細胞及試劑乳腺癌MDA-MB-231細胞株，購自上海優選生物科技有限公司。華蟾素注射液購自安徽金蟾生化股份有限公司，每支5mL，批號1504 08-1。鼠抗E-cad單克隆抗體、兔抗N-cad單克隆抗體購自英國Abcam公司；單克隆兔抗人β-actin抗體、二抗山羊抗兔抗體購自武漢博士德生物工程有限公司。逆轉錄試劑盒購自加拿大MBI Fermentas公司，實時熒光定量PCR試劑盒購自美國ABI公司。

1.2 主要儀器Realtime-PCR儀（ABI 7900型），水平電泳槽（北京君意東方儀器公司，JY-SPC），DG-Ⅲ雙穩數顯電泳儀（北京鼎國生物技術發展中心），高速離心機（SIGMA，1-13），蛋白質印跡成像和定量分析系統（型號：FluorChem Q）。

2 實驗方法

2.1 細胞毒性實驗（MTT比色法）將MDA-MB-23細胞以1×104/mL濃度接種于96孔板細胞制成單細胞懸液后接種至96孔板，每孔200μL，每組5個復孔，培養1天后吸棄培養液，分別用華蟾素注射液（按1:5、1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320稀釋）處理。繼續培養至相應時間點（3h、6h、12h、24h、36h、48h、72h）后，每孔加MTT（5mg/ml）20μL，37℃繼續孵育4h后棄上清液，每孔加入150μL DMSO（二甲基亞砜）。酶標儀測定490nm吸光度值（A490），并計算細胞相對存活率。相對存活率=實驗組吸光度值平均值/對照組吸光度值平均值×100%。

2.2 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）實驗通過qRT-PCR檢測各組細胞N-cad、E-cad mRNA的表達水平。常規培養細胞，制備細胞懸液，平均分瓶，待細胞長滿時按實驗分組加藥干預，48h時后按試劑盒說明書逐步提取總RNA，紫外分光光度儀測定RNA樣品純度，各組樣品吸光度比值均在1.8～2.1之間，按試劑盒說明書逐步合成cDNA，再以cDNA為模板，與基因特異性引物，通過PCR擴增E-cad和N-cad。對解離曲線進行分析，確保只有單一產物被擴增。最終進行測定分析。實驗重復3次。內參選用GAPDH，由上海優選生物科技有限公司設計合成引物。引物序列見表1。E-CAD、N-cad mRNA表達水平的計算方法：以GAPDH作為內參照，以△Ct=△Ct目的基因-Ct內參基因；△△Ct=△Ct最低樣本-△Ct其他個樣本，推導計算相對表達量（RQ）=2-△△Ct。

表1 各基因PCR引物序列

2.3 蛋白印跡法（Westernblot）實驗通過Westernblot檢測各組細胞N-cad、E-cad蛋白表達量。設空白對照及低、中、高濃度華蟾素注射液（6.25mg/L、25mg/L、100mg/L）處理細胞24h，裂解細胞，分別取30μg蛋白量的細胞總蛋白樣品上樣。60V電泳積聚蛋白，90V電壓使蛋白分離，110V轉膜，5%脫脂牛奶封閉2h。用單克隆兔抗人β-actin抗體（1∶400）、單克隆鼠抗人的E-cadherin（1∶50）、單克隆兔抗人的N-cadherin（1∶500）分別與膜接觸4℃孵育過夜。TBS-T洗滌6次，每次10min；羊抗兔HRP（武漢博士德，1∶1000）；Rabbit Anti-Mouse IgG H&L（HRP）（ab6728）1:5000.TBS-T稀釋至1mL，置于parafilm封口膜上，室溫孵育2h。TBST洗滌3三次，每次10min。ECL顯色液（millipor）溶液A 0.5mL溶液B 0.5mL。混合均勻后顯色。凝膠成像，蛋白質印跡成像和定量分析系統（quantitative gel and western blot imaging system）（型號：FluorChem Q）顯色，曝光。以E-cad、N-cad與β-actin的比值代表蛋白相對表達水平。實驗重復3次。

2.4 統計學方法應用SPSS19.0軟件，組間差異采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 對細胞毒性的影響MTT實驗發現，12、24、48h時各濃度華蟾素注射液對MDA-MB-231細胞增殖具有顯著的抑制作用。以48h時最為明顯，高劑量（1∶5稀釋，終濃度為100mg/L）組MDA-MB-231抑制率為54.54%，高于中劑量組（1∶20稀釋，終濃度為25mg/L）的50.20%和低劑量組（1∶80稀釋，終濃度為6.25mg/L）的37.80%（P<0.05）。見圖1。

圖1 各濃度華蟾素華蟾素注射液對MDA-MB-231細胞毒性作用

3.2 對E-cad、N-cad mRNA表達的影響qRTPCR實驗結果顯示，空白對照組及華蟾素注射液高、中、低劑量組E-cad相對表達量依次為（1.05±0.04）%、（8.77±1.54）%、（3.74±1.56）%、（1.64±0.30）%，N-cad相對表達量依次為（1.18±0.19）%、（0.34±0.19）%、（0.79±0.20）%、（0.84±0.07）%。結果顯示，華蟾素上調E-cad表達，與空白對照組比較差異有統計學意義（P=0.000<0.01）；華蟾素下調N-cad表達，與空白對照組比較有統計學意義（P=0.002<0.01）。見圖2。

3.3 對E-cad、N-cad蛋白表達的影響Western blot結果經灰度值分析后顯示，隨著華蟾素注射液濃度的提高，MDA-MB-231細胞中E-cad蛋白表達逐漸上調，N-cad的表達逐漸下調，見圖3。

4 討論

研究表明，華蟾素對乳腺癌細胞侵襲具有抑制作用[4]。目前以其療效確切，毒副作用小而廣泛運用于臨床，成為我國臨床上應用較廣的一種中藥抗腫瘤制劑[5]。本實驗在此基礎上，以EMT作為研究切入點，進一步觀察華蟾素注射液對乳腺癌MDA-MB-231細胞E-cad、N-cad表達的影響，明確其對乳腺癌細胞EMT的調控作用，從而初步闡述華蟾素注射液抑制乳腺癌轉移的機制。

圖2 各組細胞E-cad及N-cad表達情況

圖3 各組細胞E-cad、N-cad蛋白表達

E-cadherin和N-cadherin都屬于鈣黏附素(Cadherin）家族，E-cad分子之間通過胞外的免疫球蛋白結構域相互形成鏈接，并通過胞漿內的α、β連接素與肌動蛋白骨架相連，從而形成穩定的細胞間接觸，因此E-cad水平的下降可以導致細胞黏附力降低[6-7]。N-cad可以克服E-cad介導的細胞間牢固的黏附而影響上皮細胞的形態和行為，誘導其向間質轉化，直接促進腫瘤細胞的浸潤，使癌細胞轉為具有浸潤性的惡性表型[8]。EMT中E-cad表達下降而N-cad表達上升的過程被稱為鈣黏蛋白轉化，這可能是癌細胞向間質侵襲轉移的原因[9]。

本研究通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測和蛋白印跡法（Westernblot）檢測結果表明，華蟾素注射液可以通過上調E-cad的表達和下調N-cad的表達，增加細胞的黏附，抑制鈣黏蛋白轉化的發生，從而延緩EMT的發生，與文獻報道相符[10]。

綜上所述，華蟾素注射液可以通過上調E-cad的表達和下調N-cad的表達從而延緩乳腺癌MDAMB-231細胞發生EMT，在抑制乳腺癌細胞的基礎上降低乳腺癌細胞的侵襲力和遷移力。但華蟾素抑制EMT現象的實現是否與現在正在研究的TGF-β信號通路、Wnt信號通路、Notch信號通路等相關[11]仍需要進一步的研究，這也為我們后續的研究提供了良好的研究思路。

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（收稿：2016-08-28修回：2016-10-10）

Effect of Huachansu Injection on E-cad and N-cad in Breast Cancer Cell Line MDA-MB-231

XU Leilai1, LANG Yali1,XIE Lufan1,XIE Xiaohong2.1 Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China;2 Department of Breast Surgery,the First Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310006), China

ObjectiveTo investigate the effect of huachansu injection on the expressions of E-cad and N-cad in breast cancer cell line MDA-MB-231,in order to explore the inhibiting effect of huachansu injection on the metastasis of breast cancer.MethodsMTT assay was applied to observe the proliferation of MDA-MB-231 cells after treatment with high,medium and low doses of huachansu injection（100mg/L,25mg/L and 6.25mg/L）.The expressions of E-cad and N-cad mRNA and protein in test cells were detected by qRT-PCR and western blot,respectively.ResultsThe high dose group of huachansu injection had a higher cell inhibition effect at 48 hours compared with the medium dose group and low dose group（54.54%vs 50.20%,37.80%,P<0.05）.qRT-PCR results showed that the expressions of E-cad mRNA in high,medium and low doses of huachansu injection groups were up-regulated and the expression of N-cad mRNA was up-regulated compared with those in blank control group[E-cad:（8.77±1.54）%,（3.74±1.56）%,（1.64±0.30）%vs（1.05±0.04）%,P<0.01;N-cad:（0.34±0.19）%,（0.79±0.20）%,（0.84±0.07）%vs（1.18±0.19）%,P<0.01]and the similar results in E-cad and N-cad proteins were observed by western blot（P<0.05）.ConclusionHuachansu injection can inhibit the EMT transition of MDA-MB-231 cells through down-regulating N-cad and up-regulating E-cad,so as to decreasing the migration and invasive ability of the cancer cells.

breast cancer;MDA-MB-231 cells;huachansu injection;E-cad/N-cad

浙江省自然科學基金資助項目（No.LY12H16008)；浙江省大學生科技創新活動計劃暨新苗人才計劃（No.2015R410026）

1浙江中醫藥大學（杭州310053）；2浙江中醫藥大學附屬第一醫院乳腺外科（杭州310006）

謝小紅，Tel：15990149351；E-mail：xxh666857@163.com