低濃度雷公藤甲素聯合順鉑對肝癌細胞HepG2活性的影響

趙東曉 陳弘磊 孟冠敏 李芳瓊 王偉

低濃度雷公藤甲素聯合順鉑對肝癌細胞HepG2活性的影響

趙東曉1陳弘磊2孟冠敏2李芳瓊2王偉2

目的探討低濃度雷公藤甲素與順鉑聯合用藥對人肝癌細胞HepG2活性的影響，及其逆轉順鉑耐藥的可能機制。方法將人肝癌細胞HepG2分為順鉑單用組和雷公藤甲素加順鉑聯合用藥組。順鉑單用組分別用濃度為0、2.5、5、10、20、40μg/mL的順鉑處理，聯合用藥組同時聯合低濃度雷公藤甲素（12.5ng/mL）處理HepG2。CCK-8法檢測HepG2細胞增殖的抑制率；流式細胞術檢測細胞凋亡率和細胞內P糖蛋白的表達。結果順鉑單用組各濃度（0、2.5、5、10、20、40μg/mL）對肝癌細胞HepG2細胞活力24h的抑制率分別為0、（4.0±1.0）%、（9.7±1.1）%、（29.4±2.4）%、（47.5±2.5）%、（62.9±1.2）%，聯合用藥組24h抑制率分別為（4.7±1.0）%、（37.1±3.1）%、（44.1±3.5）%、（57.9±3.0）%、（66.9±2.0）%、（74.9±2.0）%，兩組比較，細胞活力抑制率差異有統計學意義（P<0.01）；Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡后發現，順鉑單用組（0、5、10、40μg/mL）誘導HepG2肝癌細胞早期凋亡率分別為（4.3±0.3）%、（8.4±0.3）%、（9.6±0.3）%、（32.3±2.0）%，而聯合用藥組細胞早期凋亡率分別增加至（9.6±0.4）%、（16.2±0.2）%、（23.2±0.5）%、（53.0±3.6%），兩組比較，細胞凋亡率差異有統計學意義（P<0.01）；PE單染檢測P糖蛋白后發現，順鉑單用組（0、5、10、40μg/mL）細胞內P糖蛋白表達率分別為（37.3±0.4）%、（34.2±0.5）%、（30.1±1.1）%、（34.2±2.3）%，無明顯變化，而聯合用藥組P糖蛋白的表達率分別降低至（25.0±1.8）%、（18.6±0.7）%、（8.9±0.3）%、（1.8±0.1）%，兩組P糖蛋白表達差異有統計學意義（P<0.01）。結論雷公藤甲素與順鉑聯合用藥可以顯著抑制人肝癌HepG2的增殖并誘導凋亡，同時調節HepG2的順鉑耐藥性，其作用機制可能與P糖蛋白下調相關，從而對肝癌細胞HepG2發揮抗腫瘤作用。

肝癌細胞；HepG2；雷公藤甲素；順鉑；耐藥；P糖蛋白

肝癌是死亡率僅次于胃癌、食道癌的第三大常見惡性腫瘤。肝癌患者對于化療藥物的耐藥是導致治療失敗、影響肝癌治愈率和遠期生存率的主要原因[1]。順鉑作為肝癌的基本化療藥，是一種作用于細胞周期的非特異性藥物，但易產生耐藥性，其有效率只有20%～40%[2]。研究證明，由多藥耐藥蛋白P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）介導的藥物泵出增多、細胞內藥物濃度降低在多種抗腫瘤藥物耐藥中存在，順鉑耐藥也與P-gp的表達有著一定的關系[3]。雷公藤甲素（triptolide，TP）是從雷公藤中提取的活性較高的環氧二萜內酯化合物，具有良好的抗炎和抗腫瘤效果，它與目前臨床應用的一些抗腫瘤藥物具有協同效應，可以多靶點、多途徑、交叉發揮抗腫瘤作用[4-5]。聯合用藥可以降低化療藥的使用量，且在保證療效的同時，減少化療后的不良反應，提高癌癥患者的生活質量。本文研究低濃度雷公藤甲素與順鉑聯合用藥對人肝癌細胞HepG2活性的影響，并探討其聯合用藥能否降低或逆轉肝癌細胞HepG2的順鉑耐藥性。

1 實驗材料

1.1 細胞株及其培養肝癌細胞株HepG2由浙江省醫學科學院提供，生長于含有10%小牛血清的DMEM高糖培養基；置37℃濕度飽和，含有5%CO2的培養箱中培養。

1.2 試劑與儀器雷公藤甲素購于上海源葉生物有限公司，純度＞98%（批號YY90104）；順鉑購于南京制藥廠有限公司（批號H20103216）；胎牛血清購于杭州四季青生物工程有限公司（批號141013）；DMEM高糖培養基購于美國Gibco公司（批號1694270）；胰蛋白酶購于吉諾生物醫藥技術有限公司（批號15111801）；雙抗（青霉素和鏈霉素混合液）購于天津市灝洋生物制品科技有限責任公司（批號：20150624-078）；Cell Counting Kit-8（CCK-8）購于東仁化學科技（上海）有限公司（批號GC762）；Annexin V-FITC細胞凋亡試劑盒購于北京康為世紀生物科技有限公司（批號00101507）；PE Mouse Anti-Human P-glycoprotein購于BD pharmingen公司（批號4269786）；其它試劑均為國產或進口，純度為分析純。

2 實驗方法

2.1 CCK-8法測定細胞活力將HepG2細胞接種于96孔板中，待細胞完全貼壁后，順鉑單用組分別加入順鉑0、2.5、5、10、20、40μg/mL，聯合用藥組再分別加12.5ng/mL的雷公藤甲素，共12個組，每組設3個復孔，每孔總體積200μL，培養24、48h，另設對照組不加藥物培養。之后每孔加入20μL的CCK-8，繼續培養3h，酶標儀570nm波長下測定吸光度（OD）值。細胞生長抑制率按以下公式計算：抑制率（%）=（對照組OD值-藥物組OD值）/對照組OD值× 100%。

2.2 細胞凋亡檢測在HepG2細胞中加入0、5、10、40μg/mL的順鉑或12.5ng/mL的雷公藤甲素單獨及聯合用藥，對照組不加藥物，培養24h。收集細胞，按照說明書將Annexin-V和PI加入細胞中孵育20min后，采用流式細胞術檢測腫瘤細胞的凋亡。凋亡率為Annexin-V陽性細胞占所有細胞的比例。

2.3 細胞內P-gp表達的檢測細胞分組、培養、加藥同細胞凋亡檢測步驟，不同加藥處理的細胞均培養24h后收集細胞，按照說明書加入10μL PE Mouse Anti-Human P-glycoprotein后孵育15min，采用流式細胞儀檢測P-gp百分比。

2.4 統計學方法每個實驗重復3次，實驗數據用均數±標準差（） 表示，應用SPSS19.0統計軟件進行處理，采用非配對雙邊t檢驗以及單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 細胞增殖抑制試驗順鉑和低濃度雷公藤甲素對人肝癌HepG2細胞均具有不同程度的抑制增殖作用，低濃度（12.5ng/mL）雷公藤甲素與順鉑聯合用藥后對細胞的抑制增殖作用更強，隨著順鉑濃度的增加和作用時間的延長抑制率呈明顯上升趨勢。順鉑單用組與聯合用藥組細胞活力抑制率比較差異有統計學意義（P<0.01），順鉑和雷公藤甲素兩藥聯用有較好的協同作用，見表1～2。

表1 兩組HepG2腫瘤細胞抑制作用比較（）

表1 兩組HepG2腫瘤細胞抑制作用比較（）

注：與順鉑單用組比較，**P<0.01；DDP：順鉑；TP：雷公藤甲素

組別順鉑單用組聯合用藥組順鉑單用組聯合用藥組順鉑單用組聯合用藥組順鉑單用組聯合用藥組順鉑單用組聯合用藥組順鉑單用組聯合用藥組孔數3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 DDP濃度（μg/mL）0 0 2.5 2.5 5 5 1 0 10 20 20 40 40 TP濃度（ng/mL）0 12.5 0 12.5 0 12.5 0 12.5 0 12.5 0 12.5 24h抑制率（%）0 4.7±1.0** 4.0±1.0 37.1±3.1** 9.7±1.1 44.1±3.5** 29.4±2.4 57.9±3.0** 47.5±2.5 66.9±2.0** 62.9±1.2 74.9±2.0** 48h抑制率（%）0 18.5±2.0** 16.1±3.9 58.1±2.1** 36.9±3.4 69.1±1.2** 59.4±2.3 77.5±1.2** 67.4±2.7 83.9±2.0** 78.9±2.1 90.3±1.2**

表2 CCK-8方差分析表

3.2 細胞凋亡試驗采用Annexin V/PI雙染法流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況，Annexin V+/PI（-）表示早期凋亡細胞，Annexin V+/PI（+）表示晚期凋亡細胞。用濃度分別為5、10、40μg/mL的順鉑對人肝癌細胞HepG2作用24h后均可引起HepG2細胞的凋亡（P<0.01）；加入12.5ng/mL的雷公藤甲素與順鉑聯合用藥24h后，人肝癌細胞HepG2的凋亡比單獨順鉑用藥更顯著，兩組細胞凋亡率比較差異有統計學意義（P<0.01），見表3～4。

表3 兩組HepG2細胞凋亡率比較（）

表3 兩組HepG2細胞凋亡率比較（）

注：與順鉑單用組比較，**P<0.01；DDP：順鉑；TP：雷公藤甲素

組別順鉑單用組聯合用藥組順鉑單用組聯合用藥組順鉑單用組聯合用藥組順鉑單用組聯合用藥組孔數DDP濃度（μg/mL）3 3 3 3 3 3 3 3 0 0 5 5 1 0 10 40 40 TP濃度（ng/mL）0 12.5 0 12.5 0 12.5 0 12.5早期凋亡率（%）4.3±0.3 9.6±0.4** 8.4±0.3 16.2±0.2** 9.6±0.3 23.2±0.5** 32.3±2.0 53.0±3.6**晚期凋亡率（%）0.8±0.2 0.8±0.1 1.0±0.1 3.5±0.5** 2.1±0.1 4.8±0.8** 7.0±0.2 10.7±0.5**

3.3 P糖蛋白（P-gp）的表達用濃度分別為5、10、40μg/mL的順鉑對耐順鉑人肝癌細胞HepG2作用24h后，隨著順鉑濃度的增加，P-gp的表達沒有發生明顯變化。加入濃度為12.5ng/mL雷公藤甲素后，與順鉑聯合用藥24h，采用流式細胞儀檢測熒光強度檢測P-gp表達。結果表明，雷公藤聯合順鉑聯合用藥可以降低P-gp表達，并且隨著順鉑濃度的增加，P-gp表達逐漸減弱，兩組間細胞P-gp表達比較差異有統計學意義（P<0.01），見表5～6。

表4 細胞凋亡檢測方差分析表

表5 兩組HepG2細胞內P-gp表達率比較（

表5 兩組HepG2細胞內P-gp表達率比較（

注：與順鉑單用組比較，**P<0.01；DDP：順鉑；TP：雷公藤甲素；P-gp：多藥耐藥蛋白；P-gp：P糖蛋白

組別順鉑單用組聯合用藥組順鉑單用組聯合用藥組順鉑單用組聯合用藥組順鉑單用組聯合用藥組P-gp表達（%）37.3±0.4 25.0±1.8** 34.2±0.5 18.6±0.7** 30.1±1.1 8.9±0.3** 34.2±2.3 1.8±0.1**孔數DDP濃度（μg/mL）3 3 3 3 3 3 3 3 0 0 5 5 1 0 10 40 40 TP濃度（ng/mL）0 12.5 0 12.5 0 12.5 0 12.5

表6 P-gp表達方差分析表

4 討論

肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，肝癌患者對于化療藥物的耐藥是導致治療失敗、影響肝癌治愈率和遠期生存率的主要原因。順鉑是肝癌的基本化療藥，長期大劑量應用順鉑常造成嚴重的腎損傷，且肝癌細胞逐漸耐藥，失去對順鉑的敏感性[6]。

雷公藤甲素對多種腫瘤細胞具有較強的抑制作用，能明顯抑制癌細胞的增殖和侵襲，其與順鉑聯合用藥可以逆轉某些癌細胞的順鉑耐藥性，如膀胱癌[7]、卵巢癌[8]、胰癌[9]和胃癌[10]等，增強其治療效率。而順鉑和雷公藤甲素的抗癌機制不同，它們從不同方面影響腫瘤細胞的增殖和凋亡，由于兩藥都有毒副作用，故我們考慮是否能通過兩藥聯用，在減少劑量的同時不減弱療效，有效解決順鉑的耐藥現象?？紤]到當藥物作用時間太長或者藥物濃度太高時，細胞存活率普遍較低，無法體現藥物的作用效果，故在藥物聯合用藥中，選用順鉑的濃度為5、10、40μg/mL，雷公藤甲素濃度為12.5ng/mL。本研究中我們發現，無論作用24h還是48h，聯合用藥對HepG2細胞生長的抑制作用均比順鉑單藥用藥顯著增強，表明低劑量的雷公藤甲素可以加強順鉑對肝癌HepG2細胞的細胞毒作用（P<0.01）。

腫瘤細胞對凋亡的耐受是也是腫瘤多藥耐藥的重要機制之一。腫瘤細胞的抗藥性可阻止腫瘤細胞死亡程序，導致癌細胞的生存和治療失敗[11-12]。本研究發現，聯合用藥能夠引起肝癌HepG2細胞的凋亡，呈現出明確的濃度依賴性，與順鉑單藥用藥比較，差別有統計學意義（P<0.01）。這一結果說明，雷公藤甲素對HepG2細胞化療耐受的抑制作用可能是通過誘導其凋亡實現的。

膜轉運蛋白是介導各種腫瘤及細菌多藥耐藥的最經典機制，也是目前研究較透徹的機制之一，其中P-gp外排泵的研究最為深入和廣泛。P-gp能夠轉運諸如蒽環類、長春堿類、紫杉烷類以及表鬼臼毒素類等多數抗腫瘤藥物，在多種人類腫瘤中引起了先天性與獲得性的多藥耐藥作用[13-15]。因此，下調P-gp的功能與表達可以對P-gp相關的腫瘤多藥耐藥作用產生逆轉，進而增加腫瘤對化療藥物的療效。本研究發現，單用順鉑對P-gp的表達沒有明顯影響，而加入濃度為12.5ng/mL的雷公藤甲素與順鉑聯合用藥24h后，P-gp的表達隨著藥物濃度的增加明顯減弱，說明雷公藤甲素可以逆轉順鉑的耐藥現象，差異有統計學意義（P<0.01）。P-gp低表達可能是雷公藤甲素誘導肝癌細胞HepG2逆轉順鉑耐藥的機制之一。

本研究證實低濃度雷公藤甲素聯合順鉑可明顯抑制肝癌細胞增殖，誘導肝癌細胞凋亡，逆轉肝癌化療多藥耐藥，其作用機制與抑制P-gp的表達相關。提示雷公藤甲素可能提高順鉑肝癌治療療效，為雷公藤甲素成為新型抗腫瘤藥提供一定的理論及實驗依據。但中醫藥抗腫瘤是多靶點、多途徑的，是否還存其它靶點，有待今后進一步研究。

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（收稿：2016-08-30修回：2016-11-20）

Effect of Low Concentration of Triptolide Combined with Cisplatin on the Activity of Liver Cancer HepG2 Cells

ZHAO Dongxiao1,CHEN Honglei2,MENG Guanmin2,LI Fangqiong2,WANG Wei2.
1 College of Medical Technology,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China;2 Department of Clinical Laboratory, Tongde Hospital of Zhejiang Province,Hangzhou(310012),China

ObjectiveTo investigate the synergistic effect of combination regimen of triptolide and cisplatin and to explore its chemo-resistance reversal mechanism in human liver cancer cell line HepG2.MethodsThe HepG2 cells were divided to two groups:cisplatin group（2.5,5,10,20,40μg/mL）and triptolide（12.5ng/mL）combined cisplatin group.The CCK-8 test was used to estimate the inhibition of cell proliferation.Flow cytometry was applied to analyze the cell apoptosis and the expression of P-glycoprotein.ResultsCompared with the single cisplatin treated group, triptolide combined with cisplatin depressed the proliferation of HepG2 cells significantly.Cell viability inhibitory rate of HepG2cells in cisplatin group were0,（4.0±1.0）%,（9.7±1.1）%,（29.4±2.4）%,（47.5±2.5）%,（62.9±1.2）%, and combination therapy increased the inhibition rate to（4.7±1.0）%,（37.1±3.1）%,（44.1±3.5）%,（57.9±3.0）%,（66.9±2.0）%,（74.9±2.0）%,with a significant difference among them（P<0.01）.Triptolide combined with different doses of cisplatin（0,5,10,40μg/mL）significantly induced cell apoptosis in HepG2.The rate of cell apoptosis was increased from（4.3±0.3）%,（8.4±0.3）%,（9.6±0.3）%,（32.3±2.0）%to（9.6±0.4）%,（16.2±0.2）%,（23.2±0.5）%,（53.0±3.6）%,respectively,with a significant difference among them（P<0.01）.After combined use of triptolide,theexpression of P-glycoprotein was decreased from（37.3±0.4）%,（34.2±0.5）%,（30.1±1.1）%,（34.2±2.3）%in cisplatin group to（25.0±1.8）%,（18.6±0.7）%,（8.9±0.3）%,（1.8±0.1）%,with a significant differenceamong groups（P<0.01）.ConclusionTriptolide combined with cisplatin could substantially suppress proliferation,induce apoptosis on HepG2 cellsand modulate cisplatin resistance of the human liver cancer cell line HepG2.The mechanism maybe related to the decrease of P-glycoprotein expression.

liver cancer cell;HepG2;triptolide;cisplatin;drug resistance;P-glycoprotein

浙江省科技計劃項目（No.2014F10014）

1浙江中醫藥大學醫學技術學院（杭州310053）；2浙江省立同德醫院檢驗科（杭州310012）

王偉，Tel：13857101427；E-mail：wangweihz8@163.com