解淀粉芽孢桿菌高密度發(fā)酵條件的優(yōu)化

王濤，劉健，左建英，張俊，侯永春，龔驍，孫群

（1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610064；2.四川龍蟒福生科技有限責(zé)任公司，四川 眉山 620036）

解淀粉芽孢桿菌高密度發(fā)酵條件的優(yōu)化

王濤1，2，劉健1，左建英2，張俊2，侯永春2，龔驍2，孫群1

（1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610064；2.四川龍蟒福生科技有限責(zé)任公司，四川 眉山 620036）

該文探討解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）1841的高密度工業(yè)發(fā)酵工藝優(yōu)化，為解淀粉芽孢桿菌的工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。以平板菌落直徑、及培養(yǎng)后的活菌濃度為指標(biāo)，對(duì)種子的保存方法、活化方式和培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基中的酵母粉和大豆蛋白粉用量以及發(fā)酵的后期調(diào)控進(jìn)行篩選和優(yōu)化。篩選出最佳的工業(yè)菌種保存條件為30%甘油為保護(hù)劑，-64℃保存；最佳活化方法為采用PDA培養(yǎng)基活化，并經(jīng)過(guò)一次48h活化和24h二次活化；最佳的轉(zhuǎn)菌時(shí)間為在種子培養(yǎng)后17～18h。最佳的酵母粉和大豆蛋白粉濃度分別為20g/L和40g/L，發(fā)酵的后期調(diào)控需要進(jìn)行補(bǔ)料和流加氨水將pH控制在7.0±0.2，發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)至72h。通過(guò)對(duì)發(fā)酵的基本條件進(jìn)行篩選和優(yōu)化，得到可在100L發(fā)酵罐上進(jìn)行高密度發(fā)酵的體系，發(fā)酵濃度可達(dá)常規(guī)發(fā)酵的100倍（＞1×1014CFU/mL）。

解淀粉芽孢桿菌；保存；活化；高密度發(fā)酵

0 引言

近年來(lái)，由于化學(xué)農(nóng)藥的過(guò)渡使用導(dǎo)致了嚴(yán)重的食品安全和環(huán)境問(wèn)題，生物農(nóng)藥的使用已成為一種新的趨勢(shì)。目前產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用較多的主要包括地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌等[1]。其中解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）是與枯草芽孢桿菌親緣性很高的一個(gè)近緣種，具有廣泛的抑制真菌和細(xì)菌活性。目前已開(kāi)發(fā)的解淀粉芽孢桿菌制劑主要為Subtilex，由美國(guó)Microbiol Ltd.公司開(kāi)發(fā)，根部施用或拌種可防治鐮刀菌、曲霉、交鏈孢和絲核菌引起的豆類、麥類、棉花和花生根部病害。馮金龍[2]通過(guò)試驗(yàn)證明解淀粉芽孢桿菌對(duì)馬鈴薯枯萎病菌（Fusarium tricinctum），馬鈴薯絲核病菌（Rhizoctonia solani），蘋果輪紋病菌[3]和馬鈴薯炭疽病菌（Colletotrichum coccodes）都有良好的抑制作用，可致病原菌菌絲膨大、斷裂及溶解等[4]。研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌是通過(guò)產(chǎn)生芽孢菌毒素和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素抑制土傳病害[5-6]；Wang等[7]研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌可以誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生抗性；Srivastava等[8]發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌可以增加在生物脅迫下水稻的產(chǎn)量。除此之外，解淀粉芽孢桿菌甚至還可以應(yīng)用在養(yǎng)殖和畜產(chǎn)品加工領(lǐng)域[9]。

目前國(guó)內(nèi)關(guān)于解淀粉芽孢桿菌的工業(yè)高密度發(fā)酵研究較少，車曉曦[10]從最佳碳源、氮源、初始pH值、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、接菌量和裝液量的確定出發(fā)，針對(duì)一株新發(fā)現(xiàn)的解淀粉芽孢桿菌SAB-1進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)及發(fā)酵條件的優(yōu)化。該條件下發(fā)酵后菌體產(chǎn)量為4.6×1010CFU/mL。已報(bào)道的市場(chǎng)同類型解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵單位約為1×1012CFU/mL，發(fā)酵水平相對(duì)偏低，不利于制劑開(kāi)發(fā)和田間應(yīng)用。本研究利用實(shí)驗(yàn)室前期獲得的對(duì)灰霉菌、尖孢鐮刀菌、鏈格孢菌、玉米尾孢菌等多種植物病原菌的拮抗菌株B.amyloliquefaciens 1841為研究對(duì)象，通過(guò)研究菌種最佳保存和活化條件、最適接種時(shí)期，以及發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化，發(fā)酵后期調(diào)控條件的摸索，旨在提高工業(yè)發(fā)酵的菌體濃度，達(dá)到高密度發(fā)酵。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)菌種

解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）菌株1841引進(jìn)自俄羅斯，由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

種子活化培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基及NA培養(yǎng)基。

一級(jí)種子搖瓶培養(yǎng)基為酵母浸粉2%、糖蜜2%、玉米蛋白粉1%、磷酸二氫鉀0.05%、硫酸鎂0.05%、碳酸鈣0.3%、氯化鈉0.03%、pH自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基在種子搖瓶培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加不同量酵母粉、大豆蛋白粉。

1.3 發(fā)酵罐

100L發(fā)酵罐：容積100L，型號(hào)15R102-1，上海國(guó)強(qiáng)生化工程裝備有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 種子保存

將解淀粉芽孢桿菌種子在4種不同的甘油濃度和溫度組合（15%甘油+-20℃、15%甘油+-64℃、30%甘油+-20℃、30%甘油+-64℃）下保存。3個(gè)月后，將保存的種子取出進(jìn)行平板活化，培養(yǎng)48 h后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，判斷最適宜的保存方法。

2.2 種子活化

對(duì)比不同培養(yǎng)基（NA和PDA）、不同活化方式（活化48h、活化48 h后再轉(zhuǎn)接活化24 h），培養(yǎng)48 h后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，用活菌計(jì)數(shù)法測(cè)定培養(yǎng)后的菌體濃度，以此為依據(jù)判斷最佳活化培養(yǎng)基及活化時(shí)間。

2.3 確定種子生長(zhǎng)曲線，判斷最佳的轉(zhuǎn)種時(shí)間

種子搖瓶接種后從0～24 h每2 h取0.5mL樣品進(jìn)行OD值測(cè)定[11]。其中，種子搖瓶使用帶擋板的500mL三角瓶（裝液量50mL），接種量2環(huán)，30℃，200 r/min培養(yǎng)24h。

2.4 不同氮源對(duì)解淀粉芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響

1）以一級(jí)種子搖瓶培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中加入酵母粉，使其含量分別為10，15，20，25g/L。搖床300 r/min、28～32℃、通氣條件下培養(yǎng)72h，測(cè)定活菌數(shù)確定最佳酵母粉含量[12]。

2）以一級(jí)種子搖瓶培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，分別在培養(yǎng)基中加入大豆蛋白粉，使其含量為0，10，20，40 g/L，搖床300 r/min、28～32℃、通氣條件下培養(yǎng)72h，測(cè)定活菌數(shù)，確定最佳大豆蛋白粉含量。

2.5 發(fā)酵后期調(diào)控

以前期試驗(yàn)優(yōu)化的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵過(guò)程，確定最佳的發(fā)酵調(diào)控路線。其中，對(duì)照組基礎(chǔ)培養(yǎng)基滅菌前pH調(diào)為7.0，發(fā)酵過(guò)程不補(bǔ)料。試驗(yàn)組1基礎(chǔ)培養(yǎng)基滅菌前pH調(diào)為7.0，發(fā)酵過(guò)程連續(xù)流加C源（糖蜜）。試驗(yàn)組2基礎(chǔ)培養(yǎng)基滅菌前pH調(diào)為7.0，發(fā)酵過(guò)程連續(xù)流加C源（糖蜜），用氨水控制pH 7.0。

發(fā)酵過(guò)程根據(jù)菌體生長(zhǎng)曲線情況取樣，分別測(cè)定OD值、活菌濃度，以及對(duì)主要抑菌代謝產(chǎn)物[13]進(jìn)行過(guò)程監(jiān)控。通過(guò)不同時(shí)間的取樣結(jié)果確定發(fā)酵過(guò)程各指標(biāo)的變化趨勢(shì)。

3 結(jié)果與分析

3.1 保存條件對(duì)菌種活化的影響

對(duì)不同的甘油濃度和保存溫度組合條件下的菌種進(jìn)行活化培養(yǎng)試驗(yàn)，結(jié)果如圖1所示，相對(duì)于15%的甘油，30%甘油能更好地保護(hù)菌種在低溫下的存活，提高菌種復(fù)蘇后的生長(zhǎng)速度，菌落直徑和發(fā)酵后的菌體濃度明顯提高；相對(duì)-20℃的溫度，-64℃溫度能極大地降低細(xì)胞代謝，提高菌種活力。因而最佳的保存條件為30%甘油為保護(hù)劑，-64℃保存。

3.2 培養(yǎng)基及活化方式對(duì)菌種活化的影響

以圖1中最優(yōu)的保存條件（30%甘油，-64℃）下的菌種，在不同培養(yǎng)基（NA和PDA）經(jīng)過(guò)不同活化時(shí)間，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。PDA培養(yǎng)基活化效果更好，經(jīng)過(guò)一次48 h活化和24 h二次活化后，菌落直徑和培養(yǎng)后的菌體濃度明顯提高，更利于后期的發(fā)酵放大。

3.3 種子生長(zhǎng)曲線和最佳轉(zhuǎn)種時(shí)間

處于對(duì)數(shù)期的菌種進(jìn)行工業(yè)發(fā)酵接種具有產(chǎn)品一致性好、發(fā)酵周期短、節(jié)約成本等優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)測(cè)定解淀粉芽孢桿菌的種子生長(zhǎng)曲線（如圖3所示），初步確定種子培養(yǎng)時(shí)間為17～18h。

3.4 不同氮源對(duì)解淀粉芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響

3.4.1 酵母粉濃度篩選

通過(guò)對(duì)比試驗(yàn)不同濃度酵母粉，確定當(dāng)酵母粉濃度達(dá)到25g/L時(shí)，發(fā)酵單位最佳，為1.8×1010CFU/mL（結(jié)果如圖4所示）。但與酵母粉濃度20g/L時(shí)相比，差異不大，考慮發(fā)酵成本選擇添加酵母粉濃度20g/L。

圖1 不同甘油濃度、溫度組合的菌落直徑和活菌濃度

圖2 不同培養(yǎng)基、活化時(shí)間組合的菌落直徑、活菌濃度

圖3 種子生長(zhǎng)曲線

3.4.2 大豆蛋白粉濃度篩選

在確定酵母粉添加量為20g/L的基礎(chǔ)上，通過(guò)添加不同濃度大豆蛋白粉，確定當(dāng)大豆蛋白粉濃度達(dá)到40g/L時(shí)，發(fā)酵單位最高（如圖5所示）。并且當(dāng)大豆蛋白粉添加量大于40g/L時(shí)，由于發(fā)酵氣泡嚴(yán)重，實(shí)驗(yàn)無(wú)法繼續(xù)。因此，大豆蛋白粉的最佳添加量為40g/L。

3.4.3 發(fā)酵調(diào)控優(yōu)化

圖4 不同酵母粉濃度下的活菌數(shù)

圖5 不同大豆蛋白粉濃度下的活菌數(shù)

在上述試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)前期發(fā)酵摸索，確定在實(shí)驗(yàn)室100L發(fā)酵實(shí)驗(yàn)罐上設(shè)定最佳參數(shù)：接種量為0.3%，裝液量為50 L，攪拌轉(zhuǎn)速為300 r/min，發(fā)酵溫度為（30±0.2）℃，運(yùn)行罐壓：0.04～0.06MPa，空氣流量為1 vvm，滅菌前使用液體NaOH將培養(yǎng)基pH調(diào)至7.0±0.2，發(fā)酵周期為發(fā)酵72h下罐，過(guò)程取樣檢測(cè)。

對(duì)照組（未進(jìn)行補(bǔ)料及pH調(diào)整）：發(fā)酵水平最低，活菌數(shù)為4.5×1012CFU/mL。

試驗(yàn)組1（過(guò)程補(bǔ)料，但未對(duì)pH調(diào)整）：活菌數(shù)為8.3×1013CFU/mL。

試驗(yàn)組2（過(guò)程補(bǔ)料，流加氨水將pH控制在7.0±0.2）：發(fā)酵單位最高，活菌數(shù)為4.0×1014CFU/mL。

通過(guò)上述發(fā)酵調(diào)控過(guò)程，結(jié)果顯示在酵母粉20g/L、大豆蛋白粉40g/L，過(guò)程補(bǔ)料、流加氨水將pH控制在7.0±0.2，發(fā)酵水平是對(duì)照組的100倍，初步判斷氨水作為調(diào)節(jié)pH的同時(shí)起到補(bǔ)充氮源的作用（見(jiàn)圖6）。

圖6 不同發(fā)酵控制下的活菌濃度

4 結(jié)束語(yǔ)

已有研究表明，低溫條件和甘油保護(hù)劑有利于菌種保存，-20℃不能完全抑制細(xì)胞代謝，但-80℃和液氮低溫環(huán)境不利于工業(yè)發(fā)酵過(guò)程中的周期性保存復(fù)蘇，因而工業(yè)菌種保存采用-64℃更好。

培養(yǎng)基中各種營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)芽孢桿菌發(fā)酵具有重要影響，如金敏等[14]發(fā)現(xiàn)地衣芽孢桿菌最佳碳源為蔗糖，氮源為明膠。舒丹等[15]發(fā)現(xiàn)一株芽孢桿菌最佳發(fā)酵溫度高達(dá)50℃。本實(shí)驗(yàn)菌株最佳發(fā)酵氮源為酵母粉和大豆蛋白粉。由于發(fā)酵氣泡的限制，高濃度的大豆蛋白粉的效果并不好，但發(fā)現(xiàn)菌株的生長(zhǎng)量與氮源的添加量成正相關(guān)。在發(fā)酵調(diào)控方面，研究表明氨水的添加可給解淀粉芽孢桿菌1841菌株最適pH，同時(shí)起到了緩慢添加氮源的作用，使其調(diào)控朝著高密度發(fā)酵的方向進(jìn)行。

本研究只是在100L發(fā)酵實(shí)驗(yàn)罐條件下開(kāi)展解淀粉芽孢桿菌1841的發(fā)酵調(diào)控進(jìn)行的優(yōu)化，還需在后續(xù)的中試環(huán)節(jié)驗(yàn)證完善、優(yōu)化發(fā)酵控制，同時(shí)在培養(yǎng)基篩選方面還需考察無(wú)機(jī)鹽、消泡劑等對(duì)發(fā)酵的影響，以獲得合適的發(fā)酵工藝，在實(shí)際的發(fā)酵工業(yè)化放大、生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)發(fā)酵條件、補(bǔ)料物質(zhì)的篩選、補(bǔ)料方式等有待更加深入的研究。以達(dá)到降低阻遏發(fā)生，提高菌體生物量。

[1]杜春梅.芽孢桿菌在農(nóng)業(yè)中的研究與應(yīng)用[M].黑龍江：黑龍江大學(xué)出版社，2013：62.

[2]馮金龍，楊成德，陳秀蓉，等.解淀粉芽孢桿菌S27D的鑒定、生物學(xué)功能測(cè)定及其對(duì)馬鈴薯病原真菌的拮抗作用研究[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，48（4）：56-61.

[3]CHEN X，ZHANG Y，F(xiàn)U X，et al.Isolation and characterization of Bacillus amyloliquefaciens PG12 for the biological control of apple ring rot[J].Postharvest Biology and Technology，2016（115）：113-121.

[4]陳哲，黃靜，趙佳，等.解淀粉芽孢桿菌抑菌機(jī)制的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào)，2015，31（6）：37-41.

[5]JASIM B，BENNY R，SABU R，et al.Metabolite and mechanistic basis of antifungal property exhibited by endophytic Bacillus amyloliquefaciens[J].Applied biochemistry and biotechnology，2016，179（5）：1-16.

[6]NAM H，OH B J，KIM Y C.Biological control potential of Bacillus amyloliquefaciens KB3 isolated from the feces of allomyrinadichotoma larvae[J].The Plant Pathology Journal，2016，32（3）：273-280.

[7]WANG N，LIU M，GUO L，et al.A novel protein elicitor（PeBA1）from Bacillus amylolique faciens NC6 Induces systemic resistance in tobacco[J].International Journal of Biological Sciences，2016，12（6）：757-767.

[8]SRIVASTAVA S，BIST V，SRIVASTAVA S，et al. Unraveling aspects of Bacillus amyloliquefaciens mediated enhanced production of rice under biotic stress of Rhizoctonia solani[J].Frontiers in Plant Science，2016（7）：587.

[9]王美玲，吳駿晨，朱赟程.解淀粉芽孢桿菌在動(dòng)物生產(chǎn)中應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].2017，53（2）：19-23.

[10]車曉曦，李社增，李校堃，等.1株解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)及發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（18）：9402-9405，9437.

[11]王卉，游成真，秦宇軒，等.解淀粉芽孢桿菌L-S60生物學(xué)特性及其固態(tài)發(fā)酵工藝研究[J].2016，21（9）：133-142.

[12]LIU X Y，REN B，GAO H.Optimization for the production of surfactin with a new Syner gistic antifungal activity[J].PLoS One，2012，7（5）：1-9.

[13]王帥，高圣風(fēng)，高學(xué)文，等.枯草芽孢桿菌脂肽類抗生素發(fā)酵和提取條件[J].2007，23（4）：342-347.

[14]金敏，王忠彥.產(chǎn)膠原酶地衣芽孢桿菌菌種的分離，篩選及發(fā)酵條件研究[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2000，37（5）：764-767.

[15]舒丹，李宏，嚴(yán)建華，等.高溫芽孢桿菌堿性蛋白酶發(fā)酵條件及酶性質(zhì)研究[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2004，41（4）：856-860.

（編輯：莫婕）

Optim ization of high-density fermentation for Bacillus amyloliquefaciens

WANG Tao1，2，LIU Jian1，ZUO Jianying2，ZHANG Jun2，HOU Yongchun2，GONG Xiao2，SUN Qun1
（1.College of Life Sciences，Sichuan University，Chengdu 610064，China；2.Sichuan Lomon Bio Technology Co.，Ltd.，Meishan 620036，China）

This study explored the high-density fermentation conditions of Bacillus amyloliquefaciens 1841 by using colony diameter and culturing concentration as index.The optimal strain persevation conditions were using 30%glycerol as protective agent stored at-64℃.The optimal strain activation was on the PDA medium with the first activation for 48 hours followed by the second for 24 hours.By taking into accounting of fermentation cost and the product concentration，the culture after 17-18 hours of seed fermentation was transferred to the fermentation tank of the optimal industrial fermentation medium，in which 20 g/L yeast and 40 g/L soy protein powder were added into the basic medium.By feeding ammonia water to maintain pH at 7.0±0.2 in the late fermentation stage and fermentation time extended to 72 hours，high-density fermentation could be achieved in the 100 L fermentation tank with cells>1×1014CFU/mL，more than 100 times of the conventional fermentation.

Bacillus amyloliquefaciens；preservation；activation；high-density fermentation

A

1674-5124（2017）05-0049-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2017.05.011

2017-03-04；

2017-04-20

科技部國(guó)際合作專項(xiàng)（2015DFR31060）

王濤（1980-），男，江蘇徐州市人，高級(jí)工程師，主要從事生物源農(nóng)藥領(lǐng)域的原料藥工藝技術(shù)開(kāi)發(fā)研究。