反應型香豆素N2H4熒光探針的生物成像研究

侯鵬，董玉晶，李爽，許鳳

（齊齊哈爾醫(yī)學院藥學院，黑龍江 齊齊哈爾 161000）

反應型香豆素N2H4熒光探針的生物成像研究

侯鵬，董玉晶，李爽，許鳳

（齊齊哈爾醫(yī)學院藥學院，黑龍江 齊齊哈爾 161000）

為合成適用于生物監(jiān)測的水合肼熒光探針，該文基于水合肼誘導乙酰基脫保護生成7-羥基-4-甲基香豆素的原理，設計合成一種具有高靈敏度、高選擇性的水合肼熒光增強型有機分子探針。采用光譜學測試及細胞熒光成像的方法，對探針的性能進行表征。實驗結果表明：在緩沖溶液中，加入N2H4后，探針溶液的熒光光譜在451nm處產生一個顯著的熒光增強峰（33倍），定量分析檢測限為9×10-8mol/L（y=20.316 7+25.177 8x，r=0.9996），與其他測試物相比，探針表現出對N2H4較高的選擇性和專一性（F水合肼=787，F其他=22～24）；此外，細胞內的熒光成像實驗，證明該熒光探針具有潛在檢測細胞內N2H4的能力。

水合肼；合成；香豆素；熒光探針

0 引言

水合肼（N2H4·H2O）作為一種重要的精細化工原料，廣泛應用于工農業(yè)生產、醫(yī)藥行業(yè)和航空領域中[1]。然而，水合肼本身具有一定的毒性，研究表明，空氣中泄漏高濃度的水合肼可能會誘發(fā)人體的病變，若皮膚長時間接觸水合肼，可引起積累性中毒；肼的液體和蒸氣對眼有刺激作用，嚴重者會引起暫時性失明、血液異常，并對人體的肝臟、肺、腎和中樞神經系統(tǒng)造成不可治愈的傷害[2]。美國環(huán)境保護局定義環(huán)境中的水合肼濃度上限值為1×10-8[3]。2014年，上海理工大學崔磊等[4]設計合成了一種基于比色、光學比率以及化學發(fā)光的新型水合肼探針。2015年，Ugo小組利用TiO2納米線作為光電化學傳感器對水合肼進行檢測，同年，沈偉國教授課題組利用普魯士藍@納米銀/石墨的協(xié)同作用修飾電極檢測水合肼。現有的水合肼測試方法包括色譜法、電化學方法、熒光法和滴定法[5-6]；其中，熒光光譜法具有操作簡便、靈敏度高、選擇性好以及可以實時檢測的優(yōu)點，成為對物質定量研究的重要分析手段[7-8]。目前，國內外文獻已報道的用于檢測環(huán)境及生物體中水合肼含量的熒光探針主要基于乙酰丙酰基的脫保護[9]、Gabriel反應[10]、4-溴丁酰基脫保護[11]等機制；但是，針對水合肼檢測的熒光探針報道則為數不多，并且在實施過程還受到各種因素的限制，如較低的pH條件、合成過程復雜、反應時間長、靈敏度低、以及不能應用于生物成像等缺點。

香豆素類衍生物具有較高的光學特性、良好的穩(wěn)定性、較大的Stokes位移以及較好的水溶性，目前，針對不同離子的香豆素類熒光探針不斷被開發(fā)出來[12-13]。本文利用香豆素作為熒光信號表達基團，基于水合肼選擇性地脫去乙酰基保護，開發(fā)出新型的N2H4熒光探針并將其應用于細胞生物成像中（見圖1）。

圖1 N2H4熒光探針分子1的合成路線及N2H4識別機理

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

BRUKER AV600光譜儀（600MHz）（美國Bruker）；Bruker ultraflex II基質輔助時間飛行質譜（美國Bruker）；LS45-熒光分光光度計（美國Perkin）；UV2450型紫外-可見分光光度計（日本島津）。

乙酰乙酸乙酯，阿拉丁試劑公司；間苯二酚，上海國藥試劑有限公司；4-溴丁酸，天津市福晨化學試劑廠；乙酸酐，天津市東麗區(qū)天大化學試劑廠；香豆素，質量分數99%，武漢遠成共創(chuàng)科技有限公司；水合肼，質量分數80%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；試驗所用陰離子氯化鹽和陽離子鈉鹽均購置于上海國藥試劑有限公司。

1.2 熒光探針分子1的合成

將7-羥基-4-甲基香豆素176mg溶解在10mL二氯甲烷溶液中，加入0.3mL三乙胺，室溫攪拌15min后，向混合液中加入乙酸酐3mL，繼續(xù)室溫攪拌6h，終止反應，將反應液倒入含有40mL水的燒杯中，二氯甲烷萃取，飽和氯化鈉洗滌，有機層無水硫酸鈉干燥。旋轉蒸干溶劑，柱層析分離（石油醚∶乙酸乙酯= 8∶1，ν∶ν），得到白色固體即為產物（收率：87%）。1H NMR（600MHz，DMSO）δ7.82（d，J=8.6 Hz，1H），7.27（d，J= 2.1Hz，1H），7.19（dd，J=8.6，2.2Hz，1H），6.40（s，1H），2.44（s，3H），2.32（s，3H）。HRMS（EI）m/z calcd for [C12H10O4+H]+：219.0579，Found：219.0592。

1.3 光譜性質測試

將適量探針分子1經乙腈溶解配制成1×10-3mol/L儲備液，4℃冷藏保存，將待分析物（K+，Na+，Mn2+，Mg2+，Ca2+，Zn2+，Al3+，Fe2+，Fe3+，Hg2+，F-，Cl-，Br-，I-，N3-，SO42-，CO32-，AcO-，P2O74-，ClO4-，Cys，GSH，Hcy，NH2OH，NH3，NH2（CH2）2NH2，TEA，尿素，硫脲）用去離子水溶解，配制成1×10-2mol/L被測物溶液。將0.03mL探針1儲備液加入到0.87mL乙腈中，再加入0.03mL被測物質溶液，最后用緩沖液定容至3mL，混合均勻后，進行光譜測定。熒光分光光度計設定參數為λex=365nm，λem=451nm，狹縫寬度為10nm和10nm，電壓為700V，靈敏度為2。

2 結果與討論

2.1 光譜性質

探針1的光學信號行為如圖2所示，由于探針分子結構中的酚羥基被乙酰基保護，導致分子熒光淬滅，所以將探針分子溶解在HEPES（pH 7.4）緩沖溶液中時，單獨的探針分子（10μmol/L）不會呈現出熒光發(fā)射峰；但是，當加入N2H4（1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，20，30，40，50，60，80，100，150，200μmol/L）后，水合肼將進攻探針分子中的保護基團，使保護基團乙酰基脫去，釋放出供電子基團羥基，此時溶液在451nm處出現一個明顯的熒光發(fā)射峰，并且這個發(fā)射峰強度的變化與N2H4濃度變化成正相關，當N2H4的濃度達到200μmol/L時，在451nm處溶液的熒光強度是探針溶液本底熒光強度的33倍。并且探針分子對低濃度的N2H4也能產生明顯的響應，向探針溶液中加入1μmol/L N2H4，溶液在451nm處仍然可以顯示出相對于探針本底2倍的熒光增強。同時，在紫外燈照射下，將N2H4加入到探針溶液中，探針溶液的熒光由無色變?yōu)樗{色。

圖2 探針分子1（10μmol/L）與不同物質量濃度（0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，20，30，40，50，60，80，100，150，200μmol/L）N2H4反應的熒光響應

2.2 定量檢測

研究表明，水合肼的毒性與濃度成正比，低劑量的肼會抑制中樞神經系統(tǒng)，而高劑量的肼則會引起驚厥，大鼠在225×10-6濃度下，4.5 d便會致死[3]。文中選取不同物質量濃度的水合肼（0～200μmol/L）加入到探針1（10μmol/L）溶液中進行定量分析實驗。以熒光強度為縱坐標，N2H4物質量濃度為橫坐標，熒光強度-濃度曲線如圖3所示，擬合后得到的方程為y=20.3167+25.177 8x，相關系數r=0.999 6。根據IUPAC[14]規(guī)定，計算得到探針分子對水合肼的檢測限為9×10-8mol/L，上述結果表明，由于N2H4可以選擇性地脫去乙酰基的保護，釋放出熒光團，熒光恢復，因此探針對N2H4表現出高度靈敏的定量識別能力。與目前已報到的檢測肼的方法相比[5-6]，本文中合成的探針分子具有非常低的檢測限（9×10-8mol/L），適用于美國環(huán)保局定義的環(huán)保標準。

圖3 探針1（10μmol/L）與N2H4（0～200μmol/L）反應的熒光強度-物質量濃度曲線

2.3 選擇性和干擾實驗

本文選取一些典型的離子（K+，Na+，Mn2+，Mg2+，Ca2+，Zn2+，Fe2+，Fe3+，Hg2+，Al3+，F-，Cl-，Br-，I-，AcO-，P2O74-，ClO4-，N3-，SO42-，CO32-）、常見的生物分子（Cys，GSH，Hcy）以及相關物質（NH2OH，NH3，NH2（CH2）2NH2，TEA，尿素，硫脲）作為分析物對探針與N2H4之間選擇性識別能力進行評價。研究表明，只有探針1與N2H4作用后光譜中表現出顯著的熒光增強。相同條件下，向探針溶液中加入其他測試物時，探針1的熒光行為只產生輕微變化（F水合肼=787，F其他=22～24，F表示熒光強度），這種響應與水合肼比起來極其微小。為了進一步驗證探針的實際應用能力，將上述干擾物質加入到探針與N2H4的反應體系中，結果顯示，探針1對N2H4的檢測幾乎沒有受到干擾物質的影響（如圖4、圖5所示）。以上研究結果表明，探針1對N2H4具有一定的選擇性。

2.4 pH的影響

當人體長期接觸水合肼，積累的水合肼就會引起中毒，導致組織或器官病變，因此實現生理條件下對N2H4的檢測具有十分重要的意義。文中測試了在不同pH值下探針1以及探針1與N2H4反應溶液的熒光強度。如圖6所示，在pH 2.0～8.0范圍內，探針1溶液的熒光強度基本恒定（F=17.13～21.28），表明探針在此pH范圍內具有較好的穩(wěn)定性。當pH值繼續(xù)增大，此時探針1溶液的熒光強度不斷增大，這種變化是由于堿性條件下，探針1中的乙酰基斷裂，熒光強度恢復。同樣的pH環(huán)境，向探針溶液中加入N2H4，結果顯示，在pH 2.0～7.0之間反應溶液的熒光強度隨pH值的增大而增強，在pH 7.0～10.0之間，反應溶液的熒光強度相對比較恒定，表明探針1與N2H4的反應可以在此范圍內的生理條件下完成。因此，本文選擇pH 7.4作為研究體系的pH值。

2.5 穩(wěn)定性

在實際樣品的檢測中，探針分子以及反應產物分子的光學穩(wěn)定性會對測定結果產生較大的影響。探針分子以及探針與N2H4作用后產物隨時間的變化情況由圖7可見，當探針溶液中加入N2H4，隨時間延長熒光強度不斷增強，說明探針分子結構中的保護基不斷被N2H4進攻，釋放出熒光團，熒光恢復，二者完全反應大約需要40min，并且完全轉化為產物后，產物的熒光非常穩(wěn)定，熒光強度不會隨時間發(fā)生改變。同時，文中探討了單獨的探針分子溶液的穩(wěn)定性，結果顯示，探針1分子在測試體系中的熒光強度不會隨時間變化，具有很好的光學穩(wěn)定性。

圖4 探針1（10μmol/L）與200μmol/L干擾離子反應的熒光響應（黑色柱）以及對探針1（10μmol/L）與N2H4（200μmol/L）反應的熒光行為的影響（條狀柱）

圖5 探針1（10μmol/L）與200μmol/L生物分子及相關物的熒光響應（黑色柱）以及對探針1（10μmol/L）與N2H4（200μmol/L）反應的熒光行為的影響（條狀柱）

圖6 不同pH條件下，探針分子1（10μmol/L）及探針分子與N2H4（200μmol/L）反應的熒光響應

圖7 探針分子1（10μmol/L）及探針分子1（10μmol/L）加入N2H4（200μmol/L）后熒光強度隨時間的變化情況

2.6 細胞成像研究

本文選擇了存活率較高的人乳腺癌231細胞作為載體進行實驗。如圖8所示，在盛有人乳腺癌231細胞的6孔板中加入N2H4（50μmol/L）溶液，生理溫度培養(yǎng)30min，緩沖液沖洗3次，再加入探針（5μmol/L）溶液，生理溫度培養(yǎng)30min，經緩沖液沖洗3次，此時放置于熒光顯微鏡下觀察，細胞內呈現出強烈的藍色熒光，作為對比，實驗中將人乳腺癌231細胞中只加入探針（5μmol/L）溶液，生理溫度培養(yǎng)30min，緩沖液沖洗3次后，放置在顯微鏡下觀察，此時的細胞沒有呈現出任何的熒光。對比結果，細胞成像實驗與該化合物的光學行為是一致的，因此，探針可以實現細胞內的N2H4檢測。

3 結束語

本文以香豆素為母體，基于水合肼誘導乙酰基脫保護原理，合成了一種高靈敏的檢測水合肼的熒光探針。相對于其他待測物，該方法可以在生理條件下完成水合肼進攻乙酰基，使其脫去保護，熒光團熒光恢復，光譜呈現明顯的增強（33倍）。同時，細胞熒光成像實驗證明了該探針具有檢測生物體系內水合肼的能力。

[1]IKUMI Y，KIDA T，SAKUMA S，et al.Polymer-phloridzin conjugates as an anti-diabetic drug that Inhibits glucose absorption through the Na+/glucose cotransporter（SGLT1）in the small intestine[J].Journal of Controlled Release，2008，125（1）：42-49.

[2]ZELNICK S D，MATTIE D R，STEPANIAK P C.Occupational exposure to hydrazines:treatment of acute central nervous system toxicity[J].Aviation Space and Environmental Medicine，2003，74（12）：1285-1291.

[3]ZHANG J，NING L，LIU J，et al.Naked-eye and near-infrared fluorescence probe for hydrazine and its application in vitro and in vivo biomiaging[J].Analytical chemistry，2015，87（17）：9101-9107.

[4]CUI L，JI C，PENG Z，et al.Unique tri-output optical probe for specific and ultrasensitive detection of hydrazine[J].Analytical Chemistry，2014（86）：4611-4617.

[5]LEE J Y，NGUYEN T L，PARK J H，et al.Electrochemical detection of hydrazine using poly（dopamine）-modified electrodes[J].Sensors，2016（16）：647-656.

[6]ONGARO M，SIGNORETTOM，Trevisan V，et al.Arrays of TiO2nanowires as photoelectrochemical sensors for hydrazine detection[J].Chemosensors，2015（3）：146-156.

[7]GRYNKIEWICZ G，POENIE M，TSIEN R Y.A new generation of Ca2+indicators with greatly improved fluorescence properties[J].The Journal of Biological Chemistry，1985，260（6）：3440-3450.

[8]DU J，HU M，FAN J，et al.Fluorescent chemodosimeters using mild chemical events for the detection of small anions and cations in biological and environmental media[J].Chemical Society Reviews，2012（41）：4511-4535.

[9]LI K，XU H R，YU K K，et al.A coumarin-based chromogenic and ratiometric probe for hydrazine[J]. Analytical Methods，2013（5）：2653-2656.

[10]CUI L，PENG Z，JI C，et al.Hydrazine detection in te gas state and aqueous solution based on the Gabriel mechanism and its imaging in living cells[J].Chemical Communications，2014（50）：1485-1487.

[11]CHEN S，HOU P，WANG J，et al.A highly selective fluorescent probe based on coumarin for imaging of N2H4in living cells[J].Spectrochimica Acta Part A：Molecular and biomolecular Spectroscopy，2017（173）：170-174.

[12]MA Q J，ZHANG X B，ZHAO X H，et al.A highly selective fluorescent probe for Hg2+based on a rhodamine-coumarin conjugate[J].Analytica Chimica Acta，2010，663（1）：85-90.

[13]LEE D N，KIM G J，KIM H J.A fluorescent coumari nylalkyne probe for the selective detection of mercury（II）ion in water[J].Tetrahedron Letters，2009，50（33）：4766-4768.

[14]IRVING H，FREISER H，WEST T.IUPAC compendium of analytical nomenclature,definitive rules[M].Oxford：Pergamon Press，1981：3.

圖8 細胞成像

（編輯：莫婕）

Biological imaging study of reactive coumarin N2H4fluorescent probe

HOU Peng，DONG Yujing，LI Shuang，XU Feng
（College of Pharmacy，Qiqihar Medical University，Qiqihar 161000，China）

This paper introduces an enhanced type of hydrazine hydrate organic molecular fluorescence probe of high sensitivity and selectivity for biological monitoring.Its mechanism of action is based on the N2H4-triggered cleavage of the acetyl moiety to give 7-hydroxy-4-methylcoumarin.The properties of probe were characterized by means of spectroscopical test and fluorescent cell imaging.Results show that after adding N2H4to the buffer solution，a significant fluorescence enhancement peak（33 times）appears at 451 nm of the fluorescence spectrum of probe solution.The quantitative analysis of detection limit is 9×10-8mol/L（y=20.316 7+25.177 8x，r=0.999 6）.The probe demonstrates high selectivity and specificity for N2H4compared with other test samples（FN2H4=787，Fothers=22-24）.In addition，the intracellular fluorescence imaging experiment shows that the fluorescence probe has the potential for N2H4detection in vivo.

hydrazine；synthesis；coumarin；fluorescence probe

A

1674-5124（2017）05-0053-05

10.11857/j.issn.1674-5124.2017.05.012

2016-10-09；

2016-11-20

齊齊哈爾市科學技術計劃項目（SFGG-201546）

侯鵬（1982-），女，黑龍江齊齊哈爾市人，講師，博士，研究方向為有機小分子熒光探針的合成與應用。