髓樣分化因子88基因rs7744多態性與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病易感性及嚴重程度的關系

孫丹丹，吳玉鵬，劉文，閆虹，王紅鵠，楊軍

（中國醫科大學附屬第一醫院1.心血管超聲科；2.神經外科，沈陽110001）

髓樣分化因子88基因rs7744多態性與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病易感性及嚴重程度的關系

孫丹丹1，吳玉鵬2，劉文1，閆虹1，王紅鵠1，楊軍1

（中國醫科大學附屬第一醫院1.心血管超聲科；2.神經外科，沈陽110001）

目的探討中國北方漢族人群髓樣分化因子88（MyD88）基因3’非編碼區（3’-UTR）rs7744多態性與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（CAD）發病風險及嚴重程度的關系。方法收集2013年9月至2015年9月中國醫科大學附屬第一醫院血液標本810例。CAD組540例，對照組270例，采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性（PCR-RFLP）技術檢測rs7744多態性，并收集臨床資料。結果MyD88基因rs7744符合Hardy-Weiberg平衡（P＞0.1）。對MyD88基因rs7744多態性與CAD發病風險的關系進行總體和分層分析。MyD88基因rs7744多態位點，年齡＜50歲，AG突變雜合型攜帶者CAD的發病風險是AA野生純合型攜帶者的0.38倍（95%CI:0.17～0.93；P=0.029）。對MyD88基因rs7744多態性與CAD嚴重程度的關系進行冠狀動脈病變支數及改良Gensini評分分析。在改良Gensini評分分析中，MyD88基因rs7744多態位點，GG突變純合型攜帶者的改良Gensini評分顯著低于AA野生純合型攜帶者（5.23±3.85 vs 7.49±4.96；P=0.011）。結論MyD88基因3’-UTR區rs7744多態性與CAD發病風險及嚴重程度存在關聯關系。攜帶rs7744突變基因型的年齡＜50歲人群，CAD的發病率比較低。rs7744突變基因型攜帶者的改良Gensini評分顯著低于野生型攜帶者。

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病；發病風險或易感性；改良Gensini評分；髓樣分化因子88；基因多態性

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（coronary artery disease，CAD）是冠狀動脈發生粥樣硬化，形成斑塊，造成血管狹窄或阻塞，從而導致心肌缺血、缺氧［1］。慢性炎癥反應是其發生的主要機制之一［2］。髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）是炎癥反應通路中的重要配體，參與Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）和白細胞介素1受體（interleukin-1 receptor，IL-1R）介導的免疫反應，上調炎性細胞因子（IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α、干擾素和黏附因子等）的表達［3-5］。研究［6］表明，MyD88基因rs7744多態性與動脈粥樣硬化的發生相關。因此推測MyD88基因rs7744多態性可能也與CAD的發生發展相關。本研究以中國北方漢族人群為對象，探討MyD88基因3’非編碼區（3’-untranslated region，3’-UTR）rs7744多態性與CAD易感性及嚴重程度的關系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

采用以醫院為基礎的病例-對照研究，收集2013年9月至2015年9月中國醫科大學附屬第一醫院810例血液標本。所有入選者均行冠狀動脈造影術，并簽署知情同意書。CAD組540例（男239例，女301例），年齡27～84（59.14±9.51）歲，CAD診斷均符合1997年國際心臟病學會、協會及WHO臨床命名及診斷標準。對照組270例（男115例，女155例），年齡26～87（58.58±10.47）歲，冠狀動脈造影結果顯示冠狀動脈狹窄＜50%。所有研究對象均排除嚴重的肝腎疾病、血液病、自身免疫性病、急性腦血管疾病及急性外周血管血栓病。以電話咨詢或病歷記錄方法收集入選者性別、年齡及其他相關臨床資料（吸煙史、飲酒史、高血壓史、糖尿病史、血壓、血脂、血糖和冠狀動脈造影等）。

1.2 冠狀動脈病變程度評價

1.2.1 冠狀動脈病變支數：一支病變，一支主要冠狀動脈（左前降支、回旋支、右冠狀動脈）阻塞≥50%；兩支病變，兩支主要冠狀動脈阻塞≥50%；三支病變，三支主要冠狀動脈阻塞≥50%。左主干阻塞≥50%歸為兩支病變。

1.2.2 改良Gensini評分系統：冠狀動脈分為8個主要節段，對每個節段中最重的狹窄病變進行定量評分。0分，無任何狹窄；1分，1%～＜50%狹窄；2分，50%～＜75%狹窄；3分，75%～＜100%狹窄；4分，100%狹窄。各段評分之和為總積分。

1.3 基因組DNA提取及基因分型

5 mL外周靜脈血置于促凝試管內，分離血清和凝血塊。酚-氯仿法提取血凝塊中人基因組DNA。采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）技術對MyD88基因rs7744進行基因分型。上游引物為5’-AGGGAGCCTAACCA TGTCACTGA-3’，下游引物為5’-AGGGTCTGTCGTG GGGCACA-3’。PCR反應體系包括：10×Buffer 2.5 μL（含MgC l 225 nmol/L），4種dNTP混合物2 μL，10 μmol/L的上下游引物各0.5 μL，2.5 U的Taq DNA酶0.25 μL，模板DNA 0.5 μL，最后加去離子水至25 μL。PCR反應條件：94℃預變性3 min，然后按94℃30 s，61℃30 s，72℃30 s，進行35個循環，72℃延伸10 min。取10 μL PCR產物與限制性核酸內切酶37℃過夜。全部酶切產物于3.0%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統分析電泳結果。

1.4 統計學分析

采用應用SPSS 13.0統計學軟件進行數據處理。計量資料以x±s表示，組間計量資料比較采用ANOVA檢驗；計數資料以頻率表示，組間計數資料比較采用χ2檢驗；MyD88基因rs7744多態性與CAD發病風險及與CAD病變支數的關聯關系采用多因素logistic回歸模型。不同基因型之間，改良Gensini評分的比較采用ANOVA檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床資料比較

CAD組及對照組，年齡、性別、飲酒與否均無統計學差異（P＞0.05）。與對照組相比，CAD組吸煙、高血壓、糖尿病、高血脂均增加（P＜0.05），見表1。

MyD88基因rs7744 3種基因型之間，年齡、性別、吸煙、飲酒、高血壓、高血脂、糖尿病均無統計學差異（P＞0.05），見表2。

表1 CAD組與對照組一般臨床資料比較Tab.1 Clinical data of subjects in the CAD and control groups

表2 MyD88 rs7744 3種基因型一般臨床資料比較Tab.2 Clinical data of subjects carrying the three genotypes of MyD88 rs7744

2.2 MyD88基因rs7744多態性分型

MyD88基因rs7744野生型AA為1個片段，291 bp；突變雜合型AG為3個片段，分別為291 bp、172 bp和119 bp；完全突變型GG為2個片段，172 bp和119 bp（圖1）。3種基因型在對照組中的分布為AA型99例（36.6%），AG型126例（46.8%），GG型45例（16.6%）；在CAD組中的分布為：AA型212例（39.3%），AG型256例（47.4%），GG型72例（13.3%）；rs7744符合Hardy-Weiberg平衡（P＞0.1）。

2.3 MyD88基因rs7744多態性與CAD發病率的關系

對MyD88基因rs7744多態性與CAD發病風險的關系進行總體和分層分析。總體分析結果顯示，rs7744多態性與CAD的發病風險無統計學意義（P＞0.05），見表3。在年齡分層中，年齡＜50歲人群，MyD88基因rs7744多態性AG突變雜合型攜帶者CAD的發病風險是AA野生純合型攜帶者的0.38倍（95%CI：0.17～0.93；P=0.029），見表4。

圖1 MyD88 rs7744多態性的PCR-RFLP瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.1 PCR-RFLP assay for analyzing MyD88 rs7744 polymorphism

表3 MyD88基因rs7744多態性與CAD發病風險的關系Tab.3 Relationship of the MyD88 rs7744 polymorphism with CAD risk

2.4 MyD88基因rs7744多態性與CAD嚴重程度的關系

對MyD88基因rs7744多態性與CAD嚴重程度的關系進行冠狀動脈病變支數及改良Gensini評分。總體分析結果顯示，rs7744多態性與冠狀動脈病變支數無統計學意義（P＞0.05，表5）。在改良Gensini評分分析中，MyD88基因rs7744多態位點，GG突變純合型攜帶者的改良Gensini評分顯著低于AA野生純合型攜帶者（5.23±3.85 vs 7.49±4.96；P= 0.011），見表6。

表4 MyD88基因rs7744多態性與CAD發病風險關系的分層分析Tab.4 Stratification analysis of the association between MyD88 rs7744 and CAD risk

3 討論

研究［7］發現中國CAD發病率逐年增加，已經成為我國人口死亡的主要原因。近來研究［8］表明，多種分子機制參與CAD的發生發展，如炎癥細胞因子損害、心肌細胞代謝障礙、細胞內Ca2+超載、氧自由基損傷、興奮性氨基酸毒性損傷等，其中，炎癥反應是重要的機制之一。MyD88分子是TLR介導的先天免疫反應以及IL-1受體和IL-8受體介導的信號通路中一個重要的接頭蛋白，參與活化NF-κB信號通路及RAS/ERK信號通路，誘導炎性細胞因子（IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α、干擾素和黏附因子等）的表達［5，9］，在炎癥反應中發揮重要作用。本研究發現，MyD88基因rs7744多態性與CAD的易感性相關，并參與影響CAD的嚴重程度。

表5 MyD88基因rs7744多態性與冠狀動脈病變支數的關聯關系Tab.5 Relationship of the MyD88 rs7744 polymorphism with the number of coronary stenosis

表6 MyD88基因rs7744多態性與改良Gensini評分的關聯關系Tab.6 Relationship of the MyD88 rs7744 polymorphism with the modified Gensini score

有研究［10］表明MyD88基因敲除或基因突變與動脈粥樣硬化及其并發癥密切相關。FAN等［11］研究顯示敲除MyD88基因或者抑制MyD88基因表達后可起到減少大鼠缺血大腦炎癥反應；DOWNES等［12］研究報道敲除MyD88基因后大鼠腦梗死面積擴大。古聯等［13］研究表明MyD88基因rs7744多態性與缺血性中風患者LDL水平顯著相關。而CHEN等［6］對131例動脈粥樣硬化閉塞癥患者及270例健康對照者的研究中發現，MyD88基因rs7744多態性與動脈粥樣硬化閉塞癥的發生相關。其分子機制可能是：（1）基因3’-UTR區轉錄后的mRNA可以與小RNA結合，從而使靶標的mRNA降解或翻譯抑制，該區域發生變異可能會通過影響靶基因的表達而改變其生物學功能［14］。rs7744位點位于MyD88基因的3’-UTR區，在該位點100 bp范圍內，具有與miR-150-3p和miR-1236結合的位點［15］。因此推測在rs7744位點由A等位基因突變為G等位基因時，miR-150-3p和miR-1236與MyD88mRNA結合能力發生改變，使MyD88表達受到影響。（2）MyD88基因rs7744多態位點與ACAA1基因rs156265多態位（啟動子區）點高度連鎖不平衡（r2=0.9）。ACAA1基因rs156256多態位點可以影響內毒素的生成［16］。rs7744多態位點與rs156256多態位點相互作用，可能影響基因的表達，進而影響CAD的易感性及嚴重程度。

本研究表明，在年齡＜50歲人群中，MyD88基因rs7744多態位點AG突變雜合型的攜帶者發生CAD概率顯著低于AA野生純合型的攜帶者。FU等［17］研究表明，血清中MyD88的表達隨著年齡的增長逐漸降低。這可以部分解釋本研究的結果，MyD88基因rs7744多態性可能對年齡較小人群CAD的易感性影響更為顯著。本研究還表明，MyD88基因rs7744多態位點，GG突變純合型攜帶者的改良Gensini評分顯著低于AA野生純合型攜帶者。改良Gensini評分不但能評價CAD患者血管阻塞的數目，還可以評價血管阻塞的程度及范圍。以往的研究［18］表明，MyD88與動脈血管重構、內膜增生及脂質沉積有關。因此，MyD88基因rs7744多態位點突變型可能會通過影響冠狀動脈內膜增生及重構來影響CAD的嚴重程度，即改良Gensini評分。

綜上所述，本研究首次報道了MyD88基因3’-UTR區rs7744多態性與CAD發病風險存在關聯關系。其中，攜帶rs7744突變基因型的年齡＜50歲人群CAD的發病率比較低。rs7744多態性與CAD的嚴重程度相關。rs7744突變基因型攜帶者的改良Gensini評分顯著低于野生型攜帶者。本研究為臨床易發生CAD的人群提供早期預警，并對CAD進展的治療提供理論基礎；但樣本量相對較小，仍需要大樣本多中心的相關研究來進一步驗證結果。

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（編輯 武玉欣）

Relationship of MyD88 rs7744 Polymorphism with the Risk and Severity of Coronary Artery Disease

SUN Dandan1，WU Yupeng2，LIU Wen1，YAN Hong1，WANG Honghu1，YANG Jun1

（1.Department of Cardiovascular Ultrasound，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Department of Neurosurgery，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

Objective To investigate the association between rs7744 polymorphism in the 3’-untranslated region（3’-UTR）of myeloid differentiation factor 88（MyD88）gene and the risk and severity of coronary artery disease（CAD）in a North Chinese Han population.MethodsThe CAD and control groups consisted of 540 patients and 270 subjects，respectively.The genotypes of rs7744 were detected by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism（PCR-RFLP），and clinical data were collected.ResultsThe distributions ofMyD88rs7744 were in HWE（P＞0.1）.In the＜50-year-old age group，a lower risk of CAD was observed for subjects carrying the variant AG genotype in comparison to subjects carrying the wild AA genotype（OR=0.38，95%CI:0.17-0.93，P=0.029）.TheMyD88rs7744 polymorphism was also related to the modified Gensini score（P=0.011），which was lower in subjects carrying the variant GG genotype than the wild AA genotype（5.23±3.85 vs 7.49± 4.96）.ConclusionOur results revealed thatMyD88rs7744 polymorphism in the 3’-UTR is correlated with the risk and severity of CAD.

coronary artery disease；disease risk or susceptibility；modified Gensini score；myeloid differentiation factor 88；polymorphism

R541.4

A

0258-4646（2017）06-0519-05

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.06.009

遼寧省自然科學基金（2015020506）

孫丹丹（1983-），女，主治醫師，博士.

楊軍，E-mail：yangjun@cmu1h.com

2017-01-06

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