BMP9通過ERK5信號(hào)通路調(diào)控根尖牙乳頭干細(xì)胞成骨/成牙本質(zhì)分化

孔令姣，王金華

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔疾病與生物醫(yī)學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市高校市級(jí)口腔生物醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶401147）

BMP9通過ERK5信號(hào)通路調(diào)控根尖牙乳頭干細(xì)胞成骨/成牙本質(zhì)分化

孔令姣，王金華

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔疾病與生物醫(yī)學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市高校市級(jí)口腔生物醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶401147）

目的研究骨形成蛋白9（BMP9）是否通過激活ERK5信號(hào)通路調(diào)控永生化根尖牙乳頭干細(xì)胞（iSCAP）成骨/成牙本質(zhì)向分化。方法首先使用ERK5抑制劑BIX02189作用于BMP9的腺病毒轉(zhuǎn)染iSCAP，采用Western blotting檢測(cè)ERK5蛋白的磷酸化水平變化；然后通過堿性磷酸酶（ALP）染色、RT-PCR及茜素紅染色檢測(cè)成骨/成牙本質(zhì)相關(guān)基因Runx2、OCN、OPN和DMP1的表達(dá)，研究BMP9對(duì)iSCAP成骨/成牙本質(zhì)分化的影響。結(jié)果BMP9可以上調(diào)ERK5磷酸化水平，BIX02189干預(yù)后ERK5磷酸化下降；ALP染色，RT-PCR檢測(cè)表達(dá)及茜素紅染色均發(fā)現(xiàn)BMP9可以促進(jìn)Runx2、OCN、OPN、DMP1陽性表達(dá)，而BIX02189則抑制成骨/成牙本質(zhì)分化。結(jié)論BMP9可以通過激活ERK5信號(hào)通路促進(jìn)根尖牙乳頭干細(xì)胞成骨/成牙本質(zhì)分化。

永生化根尖牙乳頭干細(xì)胞；骨形成蛋白9；ERK5；成骨/成牙本質(zhì)分化

年輕恒牙常發(fā)生牙外傷或根尖周炎使牙根發(fā)育不足，而目前的治療方案并不能解決牙根發(fā)育問題。所以通過組織再生工程促進(jìn)骨重建和牙根再生是目前研究熱點(diǎn)之一［1］。根尖牙乳頭干細(xì)胞（stem cells from the apical papilla，SCAP）是由SONOYAMA［2］等從未發(fā)育完全的人牙根尖乳頭中獲得的，并發(fā)現(xiàn)它強(qiáng)大的自我更新、增殖和多向分化的能力。有學(xué)者［3］認(rèn)為在牙髓壞死和根尖周炎癥的病例中，SCAP是牙根再生最主要的成牙本質(zhì)前體細(xì)胞。骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）在牙齒發(fā)生、形成、分化、基質(zhì)分泌等過程中有著重要的作用［4］。本課題組前期已發(fā)現(xiàn)BMP9可以促進(jìn)永生化根尖牙乳頭干細(xì)胞（immortalized stem cells from the apical papilla，iSCAP）成骨/成牙本質(zhì)分化，但具體機(jī)制尚不清楚。以往研究認(rèn)為，BMP主要通過BMP-Smad信號(hào)通路發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和分化等生物學(xué)功能。但是有學(xué)者［5-6］認(rèn)為，BMP也可通過絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）等非經(jīng)典途徑進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。MAPK信號(hào)途徑主要有p38、ERK1/2、JNK和ERK5 4種途徑［7］，其中ERK5是最新發(fā)現(xiàn)的，其生物學(xué)作用也遵循三級(jí)激酶逐級(jí)放大模式［8］。但是ERK5信號(hào)通路在BMP9促進(jìn)iSCAP成骨/成牙本質(zhì)分化過程中的具體作用機(jī)制尚不清楚。

因此，本研究將利用ERK5抑制劑BIX02189作用于BMP9的腺病毒（adenovirus of bone morphogenetic protein 9，Ad-BMP9）轉(zhuǎn)染的iSCAP，通過Western blotting，堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色，RT-PCR及茜素紅染色檢測(cè)其對(duì)iSCAP成骨/成牙本質(zhì)分化的影響，初步探究ERK5信號(hào)通路在BMP9誘導(dǎo)iSCAP成骨/成牙本質(zhì)分化過程中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠iSCAP、HEK 293細(xì)胞、Ad-BMP9、對(duì)照腺病毒（adenovirus of green fluorescent protein，Ad-GFP）均由實(shí)驗(yàn)室保存。DMEM養(yǎng)基和胎牛血清（Gibco公司），BIX02189（Selleck公司）。ERK5一抗和磷酸化ERK5（P-ERK5）一抗（CST公司），ALP染色試劑盒（碧云天公司），RNA提取試劑盒、PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR熒光定量試劑盒（TaKaRa公司），茜素紅S染色液（索萊寶公司）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組：首先，培養(yǎng)目的細(xì)胞iSCAP并將其分為空白組，對(duì)照組（加入適量Ad-GFP），BMP9組（加入適量Ad-BMP9）和實(shí)驗(yàn)組（iSCAP感染Ad-BMP9后加入適量的ERK5抑制劑BIX02189）。

1.2.2 Western blotting檢測(cè)：將iSCAP接種到10 cm培養(yǎng)皿中，36 h后提取目的蛋白，BCA法測(cè)蛋白濃度，按照Western blotting檢測(cè)方法上樣，轉(zhuǎn)膜，封閉，孵育一抗、二抗，顯影，保存圖像。

圖1 Western blotting檢測(cè)各組P-ERK5蛋白的表達(dá)Fig.1 Western blotting analysis results of BMP9-induced phosphorylation of ERK5

1.2.3 ALP染色：將iSCAP接種到24孔板，于第5天染色。清洗固定，染色，清洗，掃描并用顯微鏡拍照。

1.2.4 RT-PCR：將iSCAP接種到6 cm培養(yǎng)皿中，于第7天提取目的細(xì)胞RNA，檢測(cè)樣本濃度和純度。按照試劑盒說明書行RT-PCR，檢測(cè)成骨/成牙本質(zhì)相關(guān)基因Runx2、OPN、OCN、DMP1的mRNA的表達(dá)。所用引物序列見表1。

表1 PCR引物序列Tab.1 The sequence of primer for RT-PCR

1.2.5 茜素紅染色：將iSCAP接種到24孔板中，第14天進(jìn)行茜素紅染色。棄舊培養(yǎng)基，清洗固定，加入茜素紅染液，清洗，采集各組細(xì)胞染色后圖像。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)均用SPSS 19.0軟件包分析處理，使用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，兩組間比較使用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMP9可激活ERK5信號(hào)通路

Western blotting檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4組的ERK5的總蛋白表達(dá)水平基本相同，而P-ERK5蛋白表達(dá)差異明顯。P-ERK5蛋白表達(dá)水平BMP9組最強(qiáng)，而實(shí)驗(yàn)組則明顯低于BMP9組，但高于對(duì)照組，提示BMP9可激活iSCAP中ERK5信號(hào)通路，且BIX02189明顯抑制了BMP9誘導(dǎo)的P-ERK5的表達(dá)。見圖1。

2.2 BIX02189可抑制早期成骨/成牙本質(zhì)分化

ALP染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)BMP9組ALP染色較其他3組深，實(shí)驗(yàn)組的ALP陽性染色與BMP9組相比明顯減少，提示BIX02189可以抑制BMP9誘導(dǎo)的iSCAP早期成骨/成牙本質(zhì)分化。見圖2。

2.3 BIX02189可抑制成骨/成牙本質(zhì)相關(guān)基因的表達(dá)

圖2 BIX02189可抑制BMP9誘導(dǎo)的iSCAP的早期成骨分化Fig.2 Inhibitory effect of the ERK5 inhibitor BIX02189 on BMP9-induced early osteogenic differentiation of iSCAP

RT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BMP9組的成骨/成牙本質(zhì)相關(guān)基因Runx2、OPN、OCN和DMP1的表達(dá)水平最高，而實(shí)驗(yàn)組則明顯低于BMP9組，提示BMP9誘導(dǎo)的成骨/成牙本質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)受到抑制。見圖3。

2.4 BIX02189可抑制晚期成骨/成牙本質(zhì)分化

圖3 BIX02189可抑制BMP9誘導(dǎo)的相關(guān)成骨/成牙本質(zhì)基因表達(dá)Fig.3 BIX02189 reduces BMP9-induced RUNX2 and target gene expression

茜素紅染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)BMP9組的鈣鹽沉積最多，染色效果最強(qiáng)；實(shí)驗(yàn)組鈣鹽沉積顆粒明顯少于BMP9組，提示BIX02189能夠抑制BMP9誘導(dǎo)iSCAP細(xì)胞晚期成骨/成牙本質(zhì)分化。見圖4。

圖4 BIX02189可抑制BMP9誘導(dǎo)的鈣鹽沉積Fig.4 Inhibitory effect of BIX02189 on BMP9-induced calcium deposition

3 討論

ERK5作為MAPK家族的一個(gè)新成員，分子結(jié)構(gòu)有別于家族其他成員，且存在于轉(zhuǎn)錄激活區(qū)，可通過自身的磷酸化來調(diào)控轉(zhuǎn)錄過程，參與細(xì)胞的生物學(xué)活動(dòng)［9］。研究［10］表明，特定條件流體剪切力能激活ERK5通路，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖和分化。耿雪靜等［11］研究發(fā)現(xiàn)，BMP9可以通過ERK5信號(hào)通路誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化成心肌樣細(xì)胞。但是ERK5信號(hào)通路在BMP9促進(jìn)iSCAP成骨/成牙本質(zhì)分化過程中的具體作用機(jī)制尚不清楚。因此，本研究對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了初步研究。

首先，為了研究BMP9能否激活iSCAP細(xì)胞中的ERK5信號(hào)通路，本研究用Ad-BMP9感染iSCAP，Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，BMP9可以增強(qiáng)PERK5表達(dá)，加入抑制劑的實(shí)驗(yàn)組P-ERK5蛋白的表達(dá)水平明顯低于BMP9組，但高于對(duì)照組，而ERK5總蛋白表達(dá)沒有明顯變化，提示ERK5信號(hào)通路參與了BMP9誘導(dǎo)iSCAP成骨/成牙分化過程。為了進(jìn)一步探索ERK5信號(hào)通路的作用機(jī)制，本研究組通過ALP染色，RT-PCR檢測(cè)及茜素紅染色進(jìn)一步檢測(cè)其成骨/成牙本質(zhì)分化的變化。成牙本質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞均能夠在一定條件下形成硬組織，也可以表達(dá)許多成骨/成牙本質(zhì)相關(guān)基因，如Runx2、OPN、OCN、DMP1等［12］。Runx2是間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的重要標(biāo)志［13］；OPN、OCN是成骨成熟的重要標(biāo)志物［14-15］；DMP1則是形成牙本質(zhì)和礦化過程中的重要非膠原基質(zhì)蛋白，在骨組織和牙本質(zhì)中都大量表達(dá)［16］。通過RT-PCR檢測(cè)，證實(shí)BIX02189抑制ERK5通路后，BMP9誘導(dǎo)的相關(guān)成骨/成牙本質(zhì)基因Runx2、OPN、OCN、DMP1轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平均明顯下調(diào)，并且BMP9誘導(dǎo)的ALP活性也明顯降低，茜素紅染色也顯示鈣鹽沉積顆粒顯著減少。通過一系列體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明抑制ERK5信號(hào)通路可抑制BMP9誘導(dǎo)iSCAP細(xì)胞的早/中/晚期成骨/成牙本質(zhì)分化作用。

綜上所述，本研究初步證實(shí)了BMP9可以通過激活ERK5信號(hào)通路促進(jìn)iSCAP成骨/成牙本質(zhì)分化的過程，其具體作用機(jī)制有待后續(xù)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究探索。

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（編輯 北辰）

BMP9 Regulates Osteogenic/Odontogenic Differentiation of Immortalized Stem Cells from the Apical Papilla via the ERK5 Pathway

KONG Lingjiao，WANG Jinhua

（Chongqing Key Laboratory of Oral Diseases and Biomedical Sciences，Stomatology Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing Municipal Key Laboratory of Oral Biomedical Engineering of Higher Education，Chongqing 401147，China）

Objective The aim of this study was to investigate the effects of the ERK5 pathway on bone morphogenetic protein-9（BMP9）-regulated osteogenic/odontogenic differentiation of immortalized stern cells from the apical papilla（iSCAP）.MethodsBMP9 was introduced into the iSCAP by using recombinant adenoviruses，and the P-ERK5 protein expression was measured via western blotting.Then，the osteogenic/odontoblastic changes were analyzed by alkaline phosphatase（ALP）staining and Alizarin red staining，and the expression of osteogenic/odontoblast-associated genes，such asRunx2，OCN，OPN，andDMP1was measured by RT-PCR.ResultsBMP9 could up-regulate the phosphorylation of ERK5 in iSCAP.After using BIX02189，which was an inhibitor of ERK5，the phosphorylation of ERK5；the activity of ALP；the expression ofRunx2，OCN，OPN，andDMP1；and the calcium deposition were all significantly inhibited.ConclusionThe ERK5 signaling pathway plays an important role in BMP9-regulated osteogenic/odontogenic differentiation of iSCAP.

immortalized stern cells from the apical papilla；bone morphogenetic protein-9；ERK5；osteogenic/odontogenic differentiation

R78

A

0258-4646（2017）06-0527-05

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.06.011

重慶市渝北區(qū)科研項(xiàng)目［2014（社）14號(hào)］；重慶高校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)計(jì)劃（2016）

孔令姣（1988-），女，碩士研究生.

王金華，E-mail：dentistwjh@163.com

2016-07-06

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：