miR-302b在結腸癌組織中的表達及意義

崔曼莉，葉文廣，王景杰，張明鑫 （第四軍醫大學唐都醫院消化內科，陜西西安710038）

miR-302b在結腸癌組織中的表達及意義

崔曼莉，葉文廣，王景杰，張明鑫 （第四軍醫大學唐都醫院消化內科，陜西西安710038）

目的：檢測不同結腸組織（結腸癌、癌旁組織、結腸腺瘤性息肉組織）中miR-302b的表達差異，明確其與結腸癌臨床病理參數的關系．方法：采用實時熒光定量PCR（qRTPCR）檢測30例結腸腺瘤組織和60對結腸癌及其癌旁組織中miR-302b的表達，分析結腸癌中miR-302b表達與臨床病理特征之間的關系．結果：miR-302b在結腸癌組織、腺瘤性息肉、癌旁組織的表達依次升高，且各組間表達的差異有統計學意義（P＜0．05）．在結腸癌中，miR-302b在不同腫瘤分化程度、淋巴結是否轉移、有無遠處轉移組間表達有顯著差異（P＜0．05）．結論：miR-302b在結腸癌中低表達，提示其可能發揮抑癌基因的功能．

miR-302b；結腸癌；表達；臨床相關性

0 引言

microRNA（miRNA）在多種生理及病理過程中發揮重要作用，是近年來研究的熱點［1-2］．其在腫瘤也發揮重要作用，通過調控不同的靶基因在增殖、凋亡、生長、侵襲、轉移、耐藥等中扮演癌基因或者抑癌基因的角色［3-4］．課題組前期研究發現在食管鱗癌中miR-302b表達顯著下調，生存分析顯示其低表達是食管鱗癌不良預后的獨立風險因子，功能學分析證實miR-302b可通過結合ERBB4的3’-非編碼區下調ERBB4的表達，進而抑制增殖和侵襲，并促進凋亡，從而發揮抑癌基因功能．miRNAs在不同類型腫瘤中可能靶向不同的靶基因，從而發揮不同的生物學功能，而未見在結腸癌中有關miR-302b的文獻報道．因此，本研究通過應用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測結腸癌、癌旁組織、腺瘤性息肉組織中miR-302b的表達變化，同時分析miR-302b的表達變化與結腸癌患者的分化程度、淋巴轉移、性別等臨床病理參數的關系，從而探討miR-302b在結腸癌中的可能作用．

1 材料和方法

1．1 材料本研究收集2013-01／2015-12第四軍醫大學唐都醫院行結腸癌根治術或者腸鏡下結腸息肉切除術的標本，術后病理診斷證實為結腸癌或腺瘤性息肉．所有患者均簽署知情同意書，且術前均未接受化療、放療及其他針對腫瘤的特殊治療．共收集結腸癌患者60例，其中男39例，女21例，平均年齡40歲，腺瘤性息肉患者30例，其中男20例，女10例，平均年齡47歲．對診斷為結腸癌的病例切除原發灶后，在距結腸癌組織邊緣＞5 cm處切取組織，記為癌旁組織．所有標本切除后室溫放置時間不超過10 min，均經DEPC-PBS沖洗后迅速置于液氮中保存．

1．2 方法

1．2．1 組織總RNA的提取及濃度測定 按照TRIzol總RNA抽提方法提取組織的總 RNA，然后通過RNeasy mini kit RNA試劑盒分離純化總RNA溶液．所提取總 RNA均經 NanoDrop?ND-1000測定在260 nm、280 nm和230 nm的分光光度吸收值，應用公式計算RNA濃度并評估純度．

1．2．2 qRT-PCR檢測miR-302b在不同組織中的表達變化 應用qRT-PCR進行miR-302b表達的定量檢測［5］，以U6作為內參，引物序列見文獻［5］，每個樣本設置4個復孔，實驗重復3次．應用2-△△GT法對qRT-PCR的結果進行分析．以結腸癌為例，癌miR-302b／癌旁組織miR-302b的相對含量（%）＝2-△△CT，-△△GT＝［miR-302bCt-U6Ct］癌旁-［miR-302bCt-U6Ct］結腸癌．

1．3 統計學處理用獨立樣本t檢驗分析不同結腸組織中miR-302b的表達差異變化．對于結腸癌中miR-302b的表達變化，通過平均表達值作為截點將結腸癌患者分為低表達組和高表達組，應用χ2檢驗法分析miR-302b在不同臨床病理指標中的表達差異．所有的檢驗均為雙側，P＜0．05表示差異有統計學意義．

2 結果

2．1 腺瘤性息肉、結腸癌組織及癌旁組織的病理結果所有腺瘤性息肉、結腸癌組織及癌旁組織的診斷均通過手術后病理報告確診或經結直腸鏡病理活檢證實，部分患者病理結果見圖1．

圖1 部分患者病變組織的病理結果（HE染色×200）

2．2 miR-302b在不同結腸組織內的表達變化通過RT-PCR檢測miR-302b在腺瘤性息肉、結腸癌組織內與癌旁組織內的表達，結果顯示：miR-302b在腺瘤性息肉中的表達顯著低于癌旁組織（P＜0．05），而結腸癌組織中的表達則顯著低于癌旁組織和腺瘤性息肉（P＜0．05，圖2）．

圖2 miR-302b在不同組織的表達

2．3 結腸癌中miR-302b在不同臨床病理參數間的表達差異結腸癌患者60例中，低表達組45例，高表達組15例．結果表明：miR-302b在更低分化、有淋巴轉移、有遠處轉移組中的表達顯著低于分化較好、無淋巴轉移、無遠處轉移組（P＜0．05）；而在不同年齡、性別、腫瘤大小和T分期組間表達差異無統計學意義（P＞0．05，表2）．

表2 miR-302b的表達與臨床病理指標的相關性

3 討論

miRNAs在腫瘤中的作用及意義受到了越來越多的關注和報道．miR-302b屬于 miR-302基因簇，miR-302基因簇共有5個成員，分別為miR-367、miR-302a、miR-302b、miR-302c和 miR-302d，由于miR-302a-d含有共同的種子區（5’-aagugcu-3’），故最初的研究常將miR-302a-d放在一起研究．研究表明，miR-302-367簇主要通過抑制靶基因蛋白質的翻譯，通過促進間質上皮化、調控細胞分化等方式誘導體細胞轉化為多能干細胞，在維持干細胞干性中發揮重要作用［7-8］．最新研究表明，miR-302-367簇的靶基因主要為干細胞相關蛋白OCT4、NANOG、SOX1和SHH，通過轉錄后抑制上述蛋白的表達進而抑制膠質瘤干細胞的集落形成，發揮抑癌基因功能［9］．進一步的研究證實miR-302s在多種腫瘤細胞中發揮抑制細胞增殖并誘導凋亡的功能［10］．但后續的研究發現，miR-302s家族在不同腫瘤中功能存在差異，主要是因為一個miRNA可靶向多個靶基因，而不同腫瘤類型中靶基因的表達豐度存在差異，而且miR-302a-d序列仍存在差異，靶基因雖然有很多重疊，但是還存在一些差異．因此，有必要將四者區分開來．

課題組持續關注miR-302b在腫瘤中的作用，首次發現食管鱗癌中miR-302b表達下調，是不良預后的獨立風險因子，且可通過靶向ErbB4抑制增殖和侵襲并促進凋亡［5］．我們還發現miR-302b在非小細胞肺癌中表達下調，其他研究也顯示miR-302b在胃癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌等腫瘤中發揮抑癌基因功能，但其在結腸癌中的表達及意義未見相關報道［11-15］．

結腸癌常經歷結腸炎-息肉-腺瘤性息肉-結腸癌的進展過程，本研究通過比較miR-302b在不同結腸組織的表達水平，發現隨著組織的異性程度的加重，即從正常-腺瘤-癌的過程中miR-302b表達呈進行性的下調，提示miR-302b的低表達可能與結腸癌的發生發展密切相關．進一步研究發現，miR-302b的表達水平越低，腫瘤分化程度越差，存在淋巴結和遠處轉移可能性越大，TNM分期越晚．提示miR-302b是腫瘤抑制因子，在結腸癌可能發揮抑癌基因功能．

根據已經明確的miR-302b的靶基因，如E2F1、CDK2、ERBB4等，均在結腸癌中發揮癌基因功能，結腸癌miR-302b表達下調，導致其靶向的大量癌基因表達上調，通過一系列信號通路誘導腫瘤的發生［15-17］．此外，結腸癌及結腸腺瘤中miR-302b的表達是否具有診斷及預后意義，也需要進一步的研究和臨床驗證．

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The expression and significance of miR-302b in colon cancer tissues

CUI Man-Li，YE Wen-Guang，WANG Jing-Jie，ZHANG Ming-Xin Department of Gastroenterology，Tangdu Hospital，Fourth Military Medical University，Xi’an 710038，China

AIM：To analyze the expression of miR-302b in adenomatous polyps（AP）and colon cancer（CC）compared with non-tumor adjacent tissues（NAT），and to investigate the clinical relevance of miR-302b expression in CC．METHODS：Expression of miR-302b was detected by quantitative real time PCR（qRT-PCR）in 30 AP patients and 60 paired CC patients with NAT．In CC tissues，the relationship between miR-302b expression and clinical features were analyzed．RESULTS：The expression level of miR-302b in CC was significantly lower than that of AP，and the expression of miR-302b in AP was lower than that of NAT，with statistically significant differences（P＜0．05）．Then，the low expression of miR-302b was significantly related to tumor differentiation，lymph node metastasis，distant metastasis，and TNM stage．CONCLUSION：miR-302b lowly expressed in CC，which revealed that implicating it might play as a tumor suppressor gene in the CC development．

miR-302b；colon cancer；expression；clinical relevance

R735．3

A

2095-6894（2017）05-34-03

2017-04-03；接受日期：2017-04-26

國家自然基金項目（81302055）

崔曼莉．碩士，主治醫師．研究方向：消化道腫瘤．E-mail：cuiml1587＠163．com

張明鑫．博士，副主任醫師．研究方向：消化道腫瘤．E-mail：zmx3115＠163．com