利濕活血方對高尿酸血癥大鼠尿酸及腎臟抗氧化能力的影響

吳麗 王林元 王小花 王成龍 劉暢 張建軍 王淳

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·論著·

利濕活血方對高尿酸血癥大鼠尿酸及腎臟抗氧化能力的影響

吳麗 王林元 王小花 王成龍 劉暢 張建軍 王淳

目的 探討不同劑量的利濕活血方對酵母膏合腺嘌呤誘導的高尿酸血癥大鼠尿酸生成、腎臟抗氧化能力的影響。方法 將70只雄性SD大鼠隨機分成空白組、模型組、四妙丸組、苯溴馬隆組及利濕活血方高、中、低(7.74 g/kg、3.87 g/kg、1.935 g/kg)劑量組，共7組，每組10只。除空白組外，其余各組利用酵母膏聯合腺嘌呤連續灌胃14天，制備高尿酸血癥大鼠模型。造模成功后，各藥物組給予相應藥物，空白組和模型組給予等體積蒸餾水，連續灌胃14天后取材，檢測各組大鼠血清中尿酸(uric acid，UA)、黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase, XOD)、腺苷脫氨酶(adenosine deaminase, ADA)，血清及腎臟組織中過氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)水平。 結果 與模型組比較，利濕活血方高劑量組、利濕活血方中劑量組可減少血清中UA含量，降低XOD、ADA活性，差異有統計學意義(P<0.001、P<0.01、P<0.05)；利濕活血方高、中、低劑量組均可升高血清及腎臟組織中SOD、T-AOC活性，降低MDA含量，差異有統計學意義(P<0.001、P<0.01、P<0.05)。 結論 中藥利濕活血方有顯著的減少高尿酸血癥大鼠血尿酸的生成，增強高尿酸血癥大鼠腎臟抗氧化和清除氧自由基能力的作用，對高尿酸血癥的綜合治療有較好的效果。

高尿酸血癥； 尿酸； 腎臟； 抗氧化； 利濕活血方

高尿酸血癥是嘌呤代謝障礙引起的代謝性疾病，尿酸作為嘌呤代謝的終產物主要由細胞代謝分解的核酸和其他嘌呤類化合物以及食物中的嘌呤經酶的作用分解而來，人體尿酸水平在37℃的飽和濃度約為420 μmol/L(7 mg/dL)，高于此值即為高尿酸血癥[1]。隨著人們生活水平的提高，飲食結構的改變，嘌呤飲食的增多，機體嘌呤的代謝發生紊亂，從而引起高尿酸血癥的發生。國內外許多研究表明，長期持續的高尿酸血癥是引起腎臟損害的重要原因之一[2]。利濕活血方是課題組針對高尿酸血癥屬于濕熱濁瘀蘊阻的病機并結合臨床用藥經驗所創制，前期研究表明，其具有降低高尿酸血癥模型大鼠血清尿酸含量，保護主動脈形態的功能[3]。本課題利用酵母膏合腺嘌呤制備高尿酸血癥大鼠模型，研究利濕活血方對高尿酸血癥模型大鼠血清尿酸(uric acid，UA)、黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase, XOD)、腺苷脫氨酶(adenosine deaminase, ADA)，血清及腎臟過氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)的影響，探討中藥利濕活血方對高尿酸血癥模型大鼠的尿酸生成、血清及腎臟抗氧化能力的影響，為臨床綜合治療高尿酸血癥及其并發癥提供更合理的治法及科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級健康雄性SD大鼠，70只，體質量230～250 g，由斯貝福(北京)生物技術有限公司提供，生產許可證號：SCXK(京)2014-0006。

1.2 藥物及試劑

利濕活血方：由金錢草6 g、土茯苓3 g、粉防己3 g、黃柏3 g、萆薢3 g、三七2 g、川牛膝3 g、赤芍3 g、青風藤3 g配伍組成，藥材均經北京中醫藥大學中醫學院科研實驗中心李偉老師鑒定為合格，由北京中醫藥大學中醫學院臨床中藥室制備，其中金錢草、土茯苓、萆薢、川牛膝、赤芍用水提取，粉防己、黃柏、三七、青風藤用醇提取；酵母膏：國藥集團化學試劑有限公司，生產批號：20140216；腺嘌呤：國藥集團化學試劑有限公司，生產批號：20140414；四妙丸(6 g/袋)：吉林紫馨藥業股份有限公司，生產批號：150406；苯溴馬隆片/立加利仙(50 mg/片，有效期5年)：德國赫曼大藥廠，生產批號：1207036，分裝企業為昆山龍燈瑞迪制藥有限公司，分裝批號：130519；UA、ADA試劑盒：中生北控股份有限公司，生產批號：20160715、20160815；SOD、T-AOC、MDA試劑盒：南京建成生物工程研究所，生產批號：20160718、20160716、20160721。

1.3 實驗儀器

臺式高速冷凍離心機Neofuge15R，Heal Force；日本日立7160全自動生化儀；紫外分光光度儀，UV-7504pc。

1.4 實驗分組與給藥

大鼠適應性飼養7天后(自由飲食、飲水，室溫20±2℃，相對濕度65%～70%)，將其隨機分成空白組、模型組、四妙丸組、苯溴馬隆組及利濕活血方高、中、低(7.74 g/kg、3.87 g/kg、1.935 g/kg)劑量組，共7組，每組10只。除空白組外，其余六組灌胃酵母膏10 g/(kg·d)、腺嘌呤100 mg/(kg·d)，連續14天，制備高尿酸血癥大鼠模型。造模成功后，各給藥組每天灌胃相應藥物，四妙丸組每天灌胃四妙丸1.6 g/kg(相當于成人每日臨床用量的8倍)，苯溴馬隆組灌胃苯溴馬隆10 mg/(kg·d)(相當于成人每日臨床用量7倍)；利濕活血方高、中、低各劑量組按生藥分別為7.74 g/kg、3.87 g/kg、1.935 g/kg(分別相當于成人每日臨床用量的16倍、8倍、4倍)灌胃，空白組和模型組給予等體積蒸餾水，連續14天。按每100 g體重灌胃1 mL給藥，每日1次。本實驗所用給藥劑量為根據《中藥藥理研究方法學》人與大鼠用藥量的等效劑量折算[4]，并在預試驗中加以探索所得。

1.5 實驗指標檢測

末次給藥2小時后，大鼠稱重，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，腹主動脈采血，分離血清，檢測大鼠血清中UA、MDA含量及XOD、ADA、SOD、T-AOC活性；取出右腎，勻漿檢測其SOD、T-AOC活性及MDA含量。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 利濕活血方對高尿酸血癥模型大鼠血清UA含量及XOD、ADA活性的影響

與空白組比較，模型組動物血清UA含量及XOD、ADA活性升高，差異有統計學意義(P<0.001)。與模型組比較，四妙丸組、苯溴馬隆組、利濕活血方高、中劑量組大鼠血清UA降低，差異有統計學意義(P<0.05、P<0.001、P<0.001、P<0.01)；四妙丸組、利濕活血方高、中劑量組血清XOD活性降低，差異有統計學意義(P<0.001、P<0.001、P<0.05)；苯溴馬隆組、利濕活血方高劑量組血清ADA活性降低，差異有統計學意義(P<0.001、P<0.01)。見表1。2.2 利濕活血方對高尿酸血癥模型大鼠血清SOD、T-AOC活性及MDA含量的影響

與空白組相比，模型組血清SOD、T-AOC活性降低而MDA水平升高，差異有統計學意義(P<0.001)。與模型組相比，苯溴馬隆組、利濕活血方高、中、低劑量組血清SOD活性升高，差異有統計學意義(P<0.001、P<0.001、P<0.01、P<0.01)；四妙丸組、苯溴馬隆組、利濕活血方高、中劑量組血清T-AOC活性升高，差異有統計學意義(P<0.01、P<0.01、P<0.05、P<0.05)；苯溴馬隆組、利濕活血方高劑量組血清MDA水平明顯降低差異有統計學意義(P<0.01、P<0.05)。見表2。

2.3 利濕活血方對高尿酸血癥模型大鼠腎臟SOD、T-AOC活性及MDA含量的影響

與空白組相比，模型組腎臟SOD、T-AOC活性降低,差異有統計學意義(P<0.001、P<0.01)，而MDA的含量升高，差異有統計學意義(P<0.001)。與模型組相比，苯溴馬隆組、利濕活血方高劑量組SOD活性升高，差異有統計學意義(P<0.05)；苯溴馬隆組、利濕活血方高劑量組T-AOC活性升高，差異有統計學意義(P<0.05)；四妙丸組、苯溴馬隆組、利濕活血方高、中劑量組的腎臟MDA水平降低，差異有統計學意義(P<0.001、P<0.01、P<0.01、P<0.05)。見表3。

表1 利濕活血方對高尿酸血癥模型大鼠血清UA含量及XOD、ADA活性的影響±s， n=10)

注： 與空白組比較，aP<0.001；與模型組比較，bP<0.05，cP<0.01，dP<0.001。

表2 利濕活血方對高尿酸血癥模型大鼠血清SOD、T-AOC活性及MDA含量的影響±s， n=10)

注： 與空白組比較，aP<0.001；與模型組比較，bP<0.05，cP<0.01，dP<0.001。

表3 利濕活血方對高尿酸血癥大鼠腎臟SOD、T-AOC活性及MDA含量的影響

注： 與空白組比較，aP<0.01，bP<0.001；與模型組比較，cP<0.05，dP<0.01，eP<0.001。

3 討論

尿酸是機體內嘌呤代謝的終產物，體內尿酸生成增多和(或)排泄減少時出現循環血尿酸含量增高，所以從病因上分析，尿酸產生過多和(或)經腎排泄不足是高尿酸血癥發生的主要病因。若高尿酸血癥長期得不到緩解，尿酸鹽沉積于四肢關節就會誘發痛風的發作，并會導致冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、腦血管疾病、腎功能不全以及代謝綜合征等多種疾病[5-6]，其中高尿酸血癥引起的腎損害最為常見。如果尿酸性腎損害得不到及時治療，將最終發展為尿毒癥，使病情惡化。因此，對高尿酸血癥及其早期腎損害的防治尤為重要。

XOD、ADA是體內嘌呤代謝的關鍵酶，有研究表明，XOD主要存在于肝臟中，隨著機體的高嘌呤飲食的增加，XOD活性逐漸增強，從而導致肝細胞膜的通透性增加，使細胞中XOD釋放入血中而致血清中XOD活性升高[7]。在尿酸的生成過程中，嘌呤核苷酸先在單核苷酸酶的催化下代謝生成嘌呤核苷(鳥苷和腺苷)，其中的腺苷在ADA的催化下轉化成次黃嘌呤核苷，次黃嘌呤核苷和鳥苷在嘌呤核苷磷酸酶的催化下，分別生成次黃嘌呤和鳥嘌呤。其中次黃嘌呤經過XOD的催化生成黃嘌呤。黃嘌呤進一步經過XOD的氧化轉化為尿酸，可見機體尿酸水平的高低與ADA、XOD活性的變化密切相關。

高尿酸血癥的發生、發展與機體氧化應激存在著密切關系。有研究發現，血清尿酸水平升高可導致氧化應激損傷增加，從而使機體抗氧化能力的降低[8-9]。SOD的主要作用是清除機體的超氧陰離子，使氧自由基進一步生成H2O2，是天然的抗氧化酶，在機體的氧化與抗氧化平衡中發揮重要作用，其活性的強弱是評價組織器官抗氧化能力的關鍵指標之一。T-AOC是一個體系內各種抗氧化物質和酶的總體水平的體現，其活性可反映機體自由基代謝以及機體對外來刺激的代償能力，是用來衡量機體組織非酶促和酶促防御體系對活性氧自由基分解和清除的總體能力[10]。MDA作為脂質過氧化程度的評價指標，是生物膜不飽和脂肪酸與氧自由基脂質過氧化反應的重要代謝產物，能夠定量評價反應細胞受自由基攻擊氧化損傷的程度。SOD、T-AOC活性的增強，可加強機體內對氧自由基的清除，減少脂質過氧化損傷，從而可使MDA含量降低。

中醫學認為，高尿酸血癥多因過食肥甘厚膩傷及脾胃，致使中焦運化失職，導致中滿而出現濕蘊濁郁，瘀血阻滯而引發。利濕活血方是課題組根據高尿酸血癥的病因病機結合臨床用藥特點創制的以清熱利濕化瘀散結為治法的經驗方[3]。方中金錢草清熱利尿，消石化堅，黃柏可增強其清熱除濕之功；三七、赤芍、川牛膝三者配伍，活血通脈，化瘀消腫；土茯苓、粉防己、萆薢、青風藤利尿除濕，通利經絡，全方共奏清熱利尿除濕、活血化瘀散結之功，切中病機。本實驗研究顯示，利濕活血方能有效降低高尿酸血癥大鼠血清XOD、ADA活性，減少黃嘌呤分解，從而使生成UA減少；升高血清及腎組織SOD、T-AOC活性，清除體內氧自由基，減少腎臟MDA含量；利濕活血方保護腎臟的作用機制可能與其抗氧化效應有關。

課題組前期研究結果表明[11]，利濕活血方在降低高尿酸血癥大鼠血清尿酸的同時，還對腎臟功能和形態的損傷具有一定的保護作用。本實驗基于前期的實驗結果，進一步研究了利濕活血方對高尿酸血癥模型大鼠的尿酸生成相關酶及腎臟抗氧化能力等方面的影響，表明利濕活血方能降低尿酸生成相關酶水平，增強高尿酸血癥大鼠的腎臟抗氧化能力，清除過量的活性氧自由基。因此，利濕活血方在降低高尿酸血癥模型大鼠血清尿酸的同時，還能保護腎臟，抗氧化應激損傷可能是其機制之一，本方的組方法則和用藥經驗可為臨床綜合治療高尿酸血癥及其并發癥提供思路與借鑒。

[1] 葛均波,徐永健.內科學[M].8版.北京:人民衛生出版社,2013:790.

[2] 谷現恩.高尿酸血癥與腎臟損害[J].中醫臨床醫生,2011,39(3):3-5.

[3] 劉暢,王淳,鄭媛,等.利濕活血方對高尿酸血癥模型大鼠血管內皮功能的影響[J].北京中醫藥大學學報,2016,39(1):10-15.

[4] 陳奇.中藥藥理研究方法學[M] .3版.北京:人民衛生出版社,2011:1261-1263.

[5] Khanna D, Fitzgerald JD, Khanna PP, et al.2012 American College of Rheumatology guidelines for management of gout.Part1:systematic nonpharmacologic and pharmacologic therapeutic approaches to hyperuricemia [J].Arthritis Care Res (Hoboken),2012,64(10):1431-1446.

[6] Zhu Y, Pandya BJ, Choi HK. Comorbidities of gout and hyperuricemia in the US general population: NHANES 2007-2008 [J]. Am J Med, 2012,125(7):679-687.

[7] 孔悅,張冰,劉小青,等.黃嘌呤氧化酶活性在高尿酸血癥動物模型中的變化[J].北京中醫藥大學學報,2004,27(6):38-40.

[8] 徐玉龍,劉兆陽,丁琪．血尿酸水平與氧化應激在急性腦梗死發生中的關系探討[J]．卒中與神經疾病,2010,17(1):9-19．

[9] Kurra V, Eraranta A, Jolma P, et al．Hyperuricemia, oxidative stress and carotid artery tone in experimental renal insufficiency[J].Am JHypertens,2009,22(9): 964-970．

[10] 張先平,王乾興,陳斌,等.當歸多糖抑制氧化損傷延緩造血干細胞衰老[J].中國中藥雜志,2013,38(3):407-412.

[11] 鄭媛,王淳,李偉,等.復方痛風康對高尿酸血癥模型大鼠腎功能的保護作用及影響IL-1β、TNF-α、TGF-β1的研究[J].中國中西醫結合腎病雜志,2015,16(7):575-578.

(本文編輯： 韓虹娟)

Effects ofLishiHuoxueprescription on uric acid and renal antioxidant capacity in hyperuricemia rats

WULi,WANGLinyuan,WANGXiaohua，etal.

CollegeoftraditionalChinesemedicine,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China

WANGChun,E-mail:chunwang_2008@163.com

Objective To study the effects and mechanism of different doses ofLishiHuoxueprescription on uric acid, renal antioxidant capacity in hyperuricemia rats induced by yeast extract and adenine. Methods Male SD rats were randomly divided into 7 groups: the blank group, model group,Simiaowangroup, Benzbromarone groupLishiHuoxuehigh, medium, and low-dose( 7.74 g/kg、3.87 g/kg、1.935 g/kg ) group. In addition to the blank group, the rest groups were intragastric administration with yeast extract and adenine for two weeks. After the model was established successfully, the appropriate drugs were administered to the rats of the administration groups, the blank group and model group were given distilled water for 14 days. uric acid(UA), xanthine(XOD), adenosine deaminase(ADA), superoxide dismutase(SOD), total antioxidant capacity(T-AOC), malondialdehyde(MDA) were detected. Results Compared with the model group, the UA, XOD and ADA ofLishiHuoxuehigh and medium groups were obviously reduced(P<0.01,P<0.05); SOD, T-AOC activity inLishiHuoxuehigh, medium and low-dose groups were increased in serum and renal while MDA content was decreased, results had significant difference (P<0.01,P<0.05). Conclusion TheLishiHuoxueprescription can reduce the production of serum uric acid, and can improve the renal antioxidant capacity in hyperuricemia rats. TheLishiHuoxuecan achieve the good therapeutic effect in the treatment of hyperuricemia.

Hyperuricemia； UA； Renal； Antioxidant capacity；LishiHuoxueprescription

國家自然科學基金(81273632)

100029 北京中醫藥大學中醫學院[吳麗(碩士研究生)、王成龍(碩士研究生)、劉暢(碩士研究生)、張建軍、王淳]；北京中醫藥大學中藥學院[王林元、王小花(碩士研究生)]

吳麗(1990- )，女，2015級在讀碩士研究生。研究方向：中醫臨床藥學。E-mail：15811286527@163.com

王淳(1970- )，博士，副教授，碩士生導師。研究方向：中醫藥治療高尿酸血癥和痛風。E-mail：chunwang_2008@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.06.002

2016-10-27)