燈盞花素對大鼠動脈粥樣硬化保護作用的研究

武迎磊 趙天 李明

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·論著·

燈盞花素對大鼠動脈粥樣硬化保護作用的研究

武迎磊 趙天 李明

目的 研究燈盞花素(breviscapine，Bre)對大鼠動脈粥樣硬化的保護作用。方法 采用高脂飼料喂養結合腹腔注射維生素D3(VD3)的方法建立動脈粥樣硬化大鼠模型，分別于造模過程同步灌胃給予Bre 6、12、24 mg·(kg·d)-1和辛伐他汀SV 1.8 mg·(kg·d)-1，共12周，并設模型組和正常對照組。計算各組大鼠心臟指數(cardiac index，CI)，通過HE染色觀察主動脈形態變化并進行病變分級，生化分析法測定血清血脂指標，比色法測定血漿炎癥細胞因子含量水平和血清中抗氧化酶活性及丙二醛(MDA)含量。結果 與模型組比較發現Bre 12、24 mg·(kg·d)-1組動脈粥樣硬化大鼠CI顯著降低(P<0.05)；Bre各組大鼠主動脈病變呈不同程度改善，Bre 24 mg·(kg·d)-1組大鼠主動脈病變分級水平顯著降低(P<0.05)；Bre 12、24 mg·(kg·d)-1組血清血脂指標TC、TG、LDL-C含量顯著降低(P<0.05)，血漿炎癥細胞因子CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6含量明顯降低(P<0.05)，血清抗氧化酶SOD、CAT活性顯著升高且MDA含量顯著降低(P<0.05)；Bre 24 mg·(kg·d)-1組血清血脂指標HDL-C含量和抗氧化酶GSH-Px活性均顯著升高(P<0.05)，血漿中炎癥細胞因子IL-10含量顯著升高(P<0.05)。結論 Bre對大鼠動脈粥樣硬化具有一定的保護作用，其機制可能與Bre能夠有效調節血脂、抑制炎癥反應和降低氧化應激損傷有關。

燈盞花素； 動脈粥樣硬化； 血脂； 炎癥； 氧化應激

隨著生活水平的提高、飲食結構的改變以及老齡化的加劇，中國動脈粥樣硬化發病率逐年升高；動脈粥樣硬化是高血壓、冠心病、心肌梗死等多種心血管系統疾病的病理基礎，其病理機制非常復雜，與多種因素有關，其中血脂代謝紊亂、炎癥反應以及氧化應激損傷是動脈粥樣硬化發生發展的核心機制[1-3]。燈盞花素(breviscapine，Bre)是中國傳統中藥品種燈盞花(首載于《滇南本草》)的主要活性成分，屬于黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、改善血液循環等多種生物學活性[4-6]，但Bre是否對動脈粥樣硬化具有一定的保護作用尚未見文獻報道，本實驗通過建立大鼠動脈粥樣硬化模型并同步給予Bre進行干預治療，研究Bre對動脈粥樣硬化大鼠的保護作用并初步探討其機制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

燈盞花素片(breviscapine，Bre)購自廣州彼迪藥業有限公司(規格：20 mg/片，生產批號：20150917)；辛伐他汀片(simvastatin，SV)購自山東羅欣藥業集團股份有限公司(規格：20 mg/片，生產批號：1511024)；總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglycerides，TG)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL-C)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL-C)試劑盒均購自深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、過氧化氫酶(Catalase，CAT)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；蘇木精-尹紅(hematoxylin-Eosin，HE)試劑盒，C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)試劑盒購自北京博奧森科技有限公司。

1.2 實驗動物

實驗用SD大鼠(清潔級，雄性，鼠齡6周齡，體質量180～220 g)購自河北省實驗動物中心，許可證號：SCXK(冀)2013-1-003。

1.3 動物模型的制備與分組

參照楊宏輝等[7]報道的實驗方法制備動脈粥樣硬化大鼠模型：除正常對照組外，其余各組大鼠均通過喂養高脂飼料結合腹腔注射維生素D3(VD3)的方法建立大鼠動脈粥樣硬化模型，共12周；造模過程及主動脈大體解剖圖片見圖1：與正常對照組比較，模型組大鼠呈現精神萎靡、毛發脫落等狀態，主動脈大體解剖呈現血管萎縮、血管壁增厚、多處鈣化等病理現象；選取80只模型大鼠隨機分為模型組、Bre 6、12、24 mg·(kg·d)-1組和SV 1.8 mg·(kg·d)-1組，各組均16只(n=16)，造模過程中各治療組同步灌胃給藥(12周)，另設正常對照組和模型組(同步給予等體積生理鹽水)。

1.4 心臟指數(cardiac index，CI)的計算

分別稱量各組大鼠體質量，麻醉后取各組大鼠心臟組織并稱量其質量，然后計算CI：CI(%)=(心臟質量/體質量)×100%。

1.5 主動脈形態結構改變的觀察及病變分級

麻醉后剝取全長主動脈，經4%多聚甲醛液中固定、常規脫水、石蠟包埋、切片、常規HE染色、復染和封片處理后，通過顯微鏡觀察主動脈形態結構改變；主動脈病變標準：0級：結構正常；1級：內膜有少量泡沫細胞積聚，無明顯的凸起斑塊；2級：內膜可見大量泡沫細胞積聚，有明顯的粥樣斑塊，部分斑塊融合成片；3級：內膜表面幾乎全被粥樣斑塊覆蓋，斑塊內可見組織壞死、鈣化，斑塊底部肌層萎縮變薄。

圖1 造模過程照片及主動脈大體解剖圖片

1.6 血清血脂指標水平、炎癥細胞因子含量、抗氧化酶活性及MDA含量的測定

麻醉后經腹主動脈取血，通過酶標儀測定血漿中炎癥細胞因子(CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10)含量水平；經離心(1500 r/min，10分鐘)處理后取血清，通過全自動生化分析儀測定血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C含量水平；通過紫外-可見分光光度計測定血清中抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)活性和MDA含量。

1.7 統計學處理

采用SPSS 13.0軟件進行數理統計分析，計量資料多組間均數比較采用one-way ANOVA檢驗，主動脈病變分級采用秩和檢驗；P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠CI計算結果

與正常對照組比較，發現模型組大鼠CI顯著升高(P<0.05)，與模型組比較發現經Bre 12、24 mg·(kg·d)-1或SV 1.8 mg/(kg·d)干預能夠顯著降低動脈粥樣硬化大鼠CI(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠

注： 與正常對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

2.2 各組大鼠主動脈形態結構改變及病變分級結果

如圖2所示：模型組大鼠主動脈較正常對照組呈現內皮細胞受損、慢性炎癥病變、泡沫細胞形成并伴有粥樣硬化斑塊形成等明顯的病理性形態結構改變；與模型組比較發現經Bre干預能夠明顯減輕動脈粥樣硬化病變程度，以Bre 24 mg·(kg·d)-1組效果最為顯著。評價主動脈病變分級：模型組大鼠主動脈病變2級及以上共14例(87.5%)，其病變分級較正常對照組顯著升高(P<0.05)；Bre 24 mg·(kg·d)-1組和SV 1.8 mg·(kg·d)-1組主動脈病變分級較模型組均顯著降低(P<0.05)。見表2。

A：正常對照組；B：模型組；C：Bre 6 mg·(kg·d)-1組；D：Bre 12 mg·(kg·d)-1組；E：Bre 24 mg·(kg·d)-1組；F：SV 1.8 mg·(kg·d)-1組

圖2 各組大鼠主動脈形態結構變化(HE×400) 表2 各組大鼠主動脈病變分級結果±s)

注： 與正常對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

2.3 各組大鼠血清中血脂指標

與正常對照組比較，模型組大鼠血清中血脂指標TC、TG、LDL-C含量顯著升高且HDL-C含量顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，Bre 12、24 mg·(kg·d)-1組動脈粥樣硬化大鼠血清中TC、TG、LDL-C含量顯著降低(P<0.05)，Bre 24 mg·(kg·d)-1組HDL-C含量顯著升高(P<0.05)。見表3。

2.4 各組大鼠血漿中炎癥細胞因子含量測定結果

與正常對照組比較發現模型組大鼠血漿中炎癥細胞因子(CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6)含量水平顯著升高(P<0.05)，炎癥細胞因子IL-10含量水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較發現經Bre12、24 mg·(kg·d)-1干預能夠顯著降低動脈粥樣硬化大鼠血漿中CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6含量(P<0.05)，經Bre 24 mg·(kg·d)-1干預能夠顯著升高IL-10含量(P<0.05)。見表4。

2.5 各組大鼠抗氧化酶活性和MDA含量

與正常對照組比較發現模型組大鼠血清中抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)活性顯著降低(P<0.05)，MDA含量顯著升高(P<0.05)；與模型組比較發現，經Bre 12、24 mg·(kg·d)-1干預能夠顯著提高動脈粥樣硬化大鼠血清SOD、CAT活性(P<0.05)，顯著降低MDA含量(P<0.05)；經Bre 24 mg·(kg·d)-1干預能夠顯著提高GSH-Px活性(P<0.05)。見表5。

3 討論

血脂代謝異常以及由其所引發的血流動力學指標、血液流變學指標改變是動脈粥樣硬化疾病的重要發病機制[8-9]。血脂水平升高致使血液黏稠度升高，影響血液流變學指標和血液動力學指標[8]；并且血脂代謝失調將導致血管內膜脂質沉積、形成“斑塊”而逐漸發展成為動脈粥樣硬化[9]。鄭楚等[10]和王苑銘等[11]研究發現通過藥物調節血脂以及改善血液流變學能夠有效緩解動脈粥樣硬化疾病的發生和發展。

表3 TGP對動脈粥樣硬化大鼠血清中血脂水平的影響±s)

注： 與正常對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

表4 各組大鼠血漿中炎癥細胞因子含量±s)

注： 與正常對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

表5 各組大鼠抗氧化酶活性和MDA含量±s)

注： 與正常對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C含量水平是臨床血脂分析的常用指標；其中TG、LDL-C含量增高將損害血管內皮光滑性，從而增加引發動脈粥樣硬化甚至誘發急性心肌梗死的危險性；而HDL-C能夠促進TC代謝而表現出對機體的保護作用。病理生理學研究發現[12]，動脈粥樣硬化的發生及進展程度與血漿中TC、TG、LDL-C含量密切相關。血液中TC、TG含量增加會附著于紅細胞膜而致使紅細胞膜硬化，而影響紅細胞的變形能力，導致細胞膜流動性下降，進而引發血液流變學指標異常，這也可能是導致動脈粥樣硬化疾病發生的重要病理機制之一[13-15]。

氧化應激損傷也是動脈粥樣硬化疾病的重要病理機制[2-3,16]，Considine MJ等[17]研究發現活性氧簇(ROS)生成的活性氧和NO將破壞血管壁的光滑性，從而形成斑塊、破裂與形成血栓。常態下ROS的產生與清除處于動態平衡，其中體內抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)在維持ROS平衡中發揮著重要的作用[18-19]；抗氧化酶活性低下則會導致ROS過剩，進而引發動脈血管的過氧化損傷；所以過氧化終產物MDA的含量也能夠間接反映動脈血管氧化應激損傷程度。

燈盞花素是一種具有多種藥理學作用的天然黃酮類化合物[3-5]，本實驗研究發現：經Bre干預能夠有效降低動脈粥樣硬化大鼠CI，抑制主動脈病變，改善血脂(降低TC、TG、LDL-C含量并提高HDL-C含量)，降低炎癥細胞因子CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6含量并提高炎癥細胞因子IL-10含量而抑制炎癥反應，提高抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)活性而抑制氧化應激損傷，提示Bre對大鼠動脈粥樣硬化的發生和發展具有一定的抑制作用，其機制可能與Bre能夠有效調節血脂、抑制炎癥和降低氧化應激損傷有關。

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(本文編輯： 董歷華)

Protective effects and mechanism of breviscapine on atherosclerosis rats

WUYinglei，ZHAOTian，LIMing.

ThethirdhospitalofXingtai，Xingtai054000,China

LIMing，E-mail：czhlm2016@163.com

Objective To investigate the protective effects and mechanism of breviscapine(Bre) on atherosclerosis rats. Methods The atherosclerosis models were made by high-fat diet and intraperitoneal injection with VD3, and at the same time, the rats were treated with Bre [6, 12, 24 mg·(kg·d)-1] and simvastatin [SV, 1.8 mg·(kg·d)-1], course of the treatment was 12 weeks; the rats were divided into normal control group and model group. The cardiac index(CI) was calculated；the histopathological changes and lesion classification of abdominal aorta was observed by HE staining; the serum lipids in serum were detected; the level of inflammatory cytokines in serum were determined; the activity of antioxidase and the content of MDA in serum were determined. Results Compared with model group, the CI of Bre [12, 24 mg·(kg·d)-1] groups were significantly decreased (P<0.05); the histopathological changes were significantly improved; the level of TC, TG, LDL-C in serum of Bre [12, 24 mg·(kg·d)-1] groups were significantly decreased (P<0.05)；the level of CRP, TNF-α, IL-1β, IL-6 in plasma were significantly decreased (P<0.05); the activity of SOD, CAT in serum were significantly increased while the content of MDA was significantly decreased (P<0.05，P<0.05); the level of HDL-C and the activity of GSH-Px in Bre 24 mg·(kg·d)-1group was significantly increased (P<0.05), the level of IL-10 was significantly increased (P<0.05). Conclusion Bre has protective effects on atherosclerosis rats, which perhaps related to its effects of reducing cholesterol, improving the anti-inflammatory and antioxidant capacity.

Breviscapine; Atherosclerosis; Blood lipid; Inflammation; Oxidative stress

054000 邢臺市第三醫院藥劑科(趙天、武迎磊)；滄州市食品藥品檢驗所(李明)

武迎磊(1984- )，本科，主管藥師。研究方向：臨床藥學。E-mail：yimy21@126.com

李明(1983- )，本科，主管藥師。研究方向：藥物分析藥理學研究。E-mail：czhlm2016@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.06.007

2016-10-05)