肝氣郁結對結腸癌模型小鼠肝轉移的影響

馬夢雨 楊曉燕 趙璐 梁芳 張勇 徐可 樊瀛哲 許建華

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·論著·

肝氣郁結對結腸癌模型小鼠肝轉移的影響

馬夢雨 楊曉燕 趙璐 梁芳 張勇 徐可 樊瀛哲 許建華

目的 通過構建肝氣郁結證模型，觀察肝氣郁結對結腸癌肝轉移的影響并探討β-AR信號通路在其中的作用機制。 方法 通過束縛制動法構建肝氣郁結證模型，將BALB/C裸小鼠隨機分為空白對照組、普萘洛爾對照組、ICI118,551 對照組、空白肝郁組、普萘洛爾肝郁組、ICI118,551 肝郁組，共六組，每組6只。ELISA法檢測血清、脾種植瘤腎上腺素(epinephrine，E)、去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)含量；qRT-PCR 和Western blot 法檢測脾臟種植瘤組織轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor ，VEGF) 和基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloprotein-9，MMP-9)表達情況；免疫組化法觀察肝轉移瘤組織VEGF和CD31蛋白表達情況。 結果 與空白對照組相比，空白肝郁組小鼠肝臟重量明顯升高(P<0.01)，并能升高小鼠血清NE、E水平及脾臟NE水平(P<0.01、P<0.05、P<0.05)，差異具有統計學意義；與對照組相比，肝郁組小鼠脾臟腫瘤組織中TGF-β、IL-6、VEGF、MMP-9蛋白以及mRNA的表達顯著升高(P<0.01)，而給予普萘洛爾或ICI118,551后表達降低(P<0.01、P<0.05)，差異具有統計學意義；肝郁組肝轉移瘤VEGF、CD31表達明顯高于對照組(P<0.01)，給予普萘洛爾或ICI118，551后，則表達降低(P<0.01、P<0.05)，差異有統計學意義。 結論 肝氣郁結可通過介導β2-AR信號通路促進結腸癌肝轉移。

肝氣郁結； 結腸癌； 肝轉移； β-AR信號通路

結腸癌是臨床最常見的惡性腫瘤之一，發病率逐年增高[1]。肝臟作為結腸癌最常見的轉移部位，約50%～60%的患者會出現肝轉移，其中20%～34%的患者在初次就診時已有肝轉移[2]。因此，防治結腸癌肝轉移是目前臨床亟需解決的關鍵問題。隨著傳統的生物醫學模式逐漸向“生物—心理—社會醫學模式”發生轉變，精神、心理因素與腫瘤的關系也日益得到重視，中醫學也認為其在疾病發生發展中起到了重要的作用。肝氣郁結是腫瘤患者常伴有的臨床癥狀，本實驗以結腸癌肝轉移小鼠作為研究對象，并引入肝氣郁結證模型，旨在觀察肝氣郁結對腫瘤轉移的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級4周齡BALB/C裸小鼠，雄性，體重18～20 g，共38只，購自上海SLAC實驗動物中心，合格證號：SCXK[滬]2012-0002。實驗動物飼養在SPF及層流架中，環境溫度(22±2)℃，照明時間12小時/天。

1.2 實驗藥物與試劑

鹽酸普萘洛爾標準品(E4642，Sigma-Aldrich，美國)、ICI118,551((±)-1-[2,3-(二氫-7-甲基1H-茚-4-基)氧]-3-[(1-甲基乙基)氨基]-2-丁醇鹽酸鹽)(I127，Sigma，美國)； Anti-MMP9 antibody(ab119906)、Anti-VEGF antibody(ab1316)、Anti-IL-6 antibody(ab154367)、Anti-TGF-β antibody(ab28364)、Anti-CD31 antibody(ab31013)，均購自美國Abcam；FITC anti-mouse/human CD11bPE anti-mouse F4/80(123110、101206，BioLegand，美國)；Anti-GAPDH antibody(PB0141，武漢博士德生物工程有限公司，武漢)；小鼠去甲腎上腺素ELISA Kit(2547，AMEKO，日本)，小鼠腎上腺素ELISA Kit(2998，AMEKO，日本)；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser、PrimerScriptTMRT reagent Kit、SYBR Premix Ex TaqTM(RR047A，TaKaRa，大連)；TRIzol(15596-026，Thermo Scientific，美國)；引物合成于上海生工生物工程股份有限公司。

1.3 實驗儀器

37℃、5% CO2細胞培養箱(7000)，購于美國Napco公司；離心機(5810R)，購于德國Eppendorf公司；超凈工作臺(SCZ-4A1)，購于新加坡ESCO公司；熒光倒置顯微鏡(CKX41)，購于日本Olympus公司；酶標儀(1100)，購于美國Agilent公司；流式細胞儀(LSR Ⅱ)，購于美國BD公司；植入式膠囊滲透壓泵(Model 1004)，購于Alzet公司。

1.4 肝氣郁結模型建立

肝氣郁結模型構建參照文獻[12]，隨機取19只小鼠建立肝氣郁結模型，將小鼠放入小鼠固定器中，以限制小鼠活動，使其不能前進、后退及轉身，每天6小時，每次時間隨機，共束縛35天。剩余19只不作處理，但在肝郁組小鼠束縛制動期間，同時斷水斷食。

1.5 結腸癌肝轉移模型建立

在束縛刺激后第7天，運用脾臟注射HT-29結腸癌細胞制作結腸癌肝轉移模型。裸小鼠腹腔注射2.5%戊巴比妥鈉麻醉，將手術區消毒，腹部切口平行于左肋下緣，注射器將HT-29(1×107)細胞懸液注入脾臟，按壓1～2分鐘后縫合，造模過程中除空白肝郁組死亡1只，剩余18只，其余全部存活。

1.6 實驗分組及治療

將18只經過束縛及注射HT-29結腸癌細胞的小鼠隨機分為空白肝郁組、普萘洛爾肝郁組、ICI118，551肝郁組，每組各6只。將19只經HT-29脾臟注射并未經束縛處理的小鼠隨機分為空白對照組、普萘洛爾對照組、ICI118，551對照組，每組6只，多余1只棄去。注射HT-29腫瘤細胞后1天開始給藥，普萘洛爾組給予植入式膠囊滲透壓泵10 mg/(kg·d)，持續給藥，ICI118，551組給予每日30 μL，25 μM ICI118，551腹腔注射給藥，連續給藥27天，對照組給予等量生理鹽水。注射腫瘤細胞后28天處死裸小鼠，取外周血、脾原發瘤、肝轉移瘤，于-80℃保存備用。

1.7 ELISA法檢測外周血、脾腫瘤組織E、NE含量

實驗結束后，眼球取血法取小鼠外周血1 mL，3000 r/min離心10分鐘，取上清液，于-20℃冰箱凍存備用。處死小鼠，無菌取出脾臟，精確稱量脾種植瘤重量，加入9倍體積的冷生理鹽水，用搗桿研磨6～8分鐘，充分研碎，使組織勻漿化。具體操作步驟嚴格按照ELISA試劑盒的說明書進行。試驗后運用450 nm酶標儀測光密度(optical density，OD)值。分別檢測不同組小鼠血清以及脾臟腫瘤組織的E、NE的濃度。

1.8 RT-PCR法檢測VEGF、MMP-9、TGF-β、IL-6

采用實時熒光定量PCR法檢測，將脾腫瘤組織從-80℃中取出，Trizol一步法試劑盒提取組織細胞總RNA，分光光度計測量OD 260/280值均在1.8～2.0。用20 μL反應體系將RNA反轉錄成cDNA ，取5 μL總RNA逆轉錄為cDNA。取所得的cDNA 2 μL，用20 μL反應體系進行PCR擴增。上述反應體系94℃預變性1分鐘，然后進行40個循環擴增，94℃15秒，60℃34秒，最后72℃分鐘。用相對定量2-△△CT法計算各個樣本目的基因的表達變化。

表1 引物序列

1.9 Western Blot法檢測VEGF、MMP-9、IL-6、TGF-β

從脾臟原發瘤組織100 mg，研磨后，加入RIPA裂解液200 μL。BCA蛋白濃度測定法檢測蛋白濃度。樣品蛋白變性后，取50 g樣品蛋白經100 g/L聚丙烯酰氨凝膠電泳分離并轉移至硝酸纖維素膜上。封閉液封閉1小時，分別加入IL-6(1∶500)、VEGF(1∶1000)、MMP-9(1∶500)、GAPDH(1∶1000)稀釋抗體孵育，4℃過夜。用加入1∶10000稀釋的辣根過氧化物酶偶聯物二抗，室溫孵育1小時，TBST漂洗后NBT/BCIP顯色，用凝膠成像圖像分析系統照相并記錄結果，Image-lab圖像分析系統分析比較脾臟腫瘤組織中VEGF、MMP-9、IL-6的表達情況。1.10 免疫組織化學法檢測肝轉移瘤中VEGF、CD31的表達

將肝轉移瘤于10 % 福爾馬林中固定，常規石蠟包埋、切片，脫蠟、脫水，根據SABC免疫組化試劑盒說明書進行：滴加5 % BAS，室溫孵育20分鐘，分別滴加一抗：VEGF(1∶1000)、CD31(1∶1000)，37℃孵育60分鐘，并用含有靶抗原的病理組織切片進行陽性對照，PBS沖洗；滴加已生物素化的羊抗兔 IgG 二抗(1∶100)，37℃孵育20分鐘，PBS沖洗；滴加 SABC，37℃孵育20分鐘，PBS沖洗；滴加 DAB 溶液，鏡下觀察35秒后終止反應，蒸餾水沖洗。乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片結果判讀，染色強度由Image-Pro 6.0進行。隨機選取3個不重疊的代表性視野，計算平均光密度值(mean density)，比較各組肝轉移瘤VEGF、CD31表達情況。

1.11 統計學處理

2 結果

2.1 各組小鼠肝轉移情況比較

對小鼠施加肝郁刺激后，脾臟重量較其相應對照組增大，但未達到統計學意義。各肝郁組小鼠肝轉移灶較其相應對照組均顯著增多，肝郁組小鼠給予普萘洛爾或ICI118,551治療后，肝轉移較空白肝郁組均減少，普萘洛爾肝郁組和ICI118,551肝郁組分別與空白肝郁組相比肝臟重量減輕，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同藥物處理后小鼠脾臟、肝臟重量比較±s，n=6，g)

注： 與空白對照組比較，aP<0.01；與空白肝郁組比較，bP<0.05。

2.2 空白對照組、空白肝郁組小鼠血清及脾臟種植瘤中E、NE含量變化

肝郁組小鼠血清NE、E 水平較對照組均顯著升高，差異具有統計學意義(P<0.01)。脾臟種植瘤NE較對照組顯著升高(P<0.01)，同時脾臟種植瘤組織中E也較對照組升高，但未達到統計學差異，提示慢性束縛制動能提高模型動物外周血、荷瘤組織中兒茶酚胺類物質水平。見表3。

2.3 各組小鼠脾臟腫瘤組織中IL-6、VEGF、MMP-9、TGF-β mRNA表達的變化

通過RT-PCR檢測脾臟種植瘤中TGF-β、IL-6、VEGF和MMP-9的mRNA表達量，結果顯示，空白肝郁組小鼠TGF-β、IL-6、VEGF和MMP-9 mRNA表達水平較空白對照組明顯上調，差異具有統計學意義(P<0.05)。與空白肝郁組相比，普萘洛爾肝郁組和ICI118,551肝郁組小鼠脾臟腫瘤組織中TGF-β、IL-6、VEGF和MMP-9 mRNA表達水平均顯著下降，差異均具有統計學意義(P<0.05)。見表4。

2.4 各組小鼠脾臟腫瘤組織中IL-6、VEGF、MMP-9、TGF-β 蛋白表達的變化

通過Western blot法檢測TGF-β、IL-6、VEGF 和MMP-9 的蛋白表達水平，結果顯示：空白肝郁組小鼠脾臟種植瘤組織中TGF-β、IL-6、MMP-9和VEGF蛋白表達較空白對照組顯著增加(P<0.01)。普萘洛爾肝郁組和ICI118,551肝郁組分別與空白肝郁組相比，TGF-β、IL-6、MMP-9和VEGF蛋白表達均減少，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表5。

2.5 各組小鼠肝轉移瘤中VEGF、CD31表達情況比較

結果顯示，空白肝郁組小鼠肝轉移瘤組織VEGF和CD31蛋白表達較空白對照組顯著增多(P<0.01)。對肝郁組小鼠給予普萘洛爾或ICI118,551后，與空白肝郁組相比，普萘洛爾肝郁組和ICI118,551肝郁組小鼠肝轉移瘤組織中VEGF和CD31蛋白陽性表達均減少，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表6。

3 分析與討論

現代醫學研究發現，肝氣郁結證是機體在抑郁、焦慮或悲痛等不良情緒作用下，以高級神經中樞調節紊亂為前提，使神經、分泌、免疫等多個系統出現病理改變的有機概括[3]。本實驗通過模具限制動物的自由活動，模擬人類心理郁怒不得發泄，壓抑內心的憤恨，久而成肝氣郁結的慢性心理應激狀態。同時，束縛制動法不會對動物造成軀體損害，從而排除由于其他因素對病因病機方面的干擾，與中醫臨床發病機制較為吻合。小鼠處于慢性應激狀態下，機體為適應環境出現下丘腦—垂體—腎上腺軸功能增強的現象，產生的神經內分泌產物如腎上腺素、去甲腎上腺素能夠激活β-AR。近年來，大量臨床研究發現β-AR阻斷劑能顯著降低乳腺癌、結腸癌、前列腺癌及惡性黑色素瘤患者的疾病復發率和死亡率[4-11]。因此，β-AR信號通路與腫瘤生物學行為之間的關系日益成為研究熱點。本實驗也發現，肝郁組小鼠外周血清、脾臟種植瘤中NE和E水平顯著高于對照組小鼠，提示肝氣郁結可造成模型動物單胺類神經遞質的紊亂。

表3 空白對照組、空白肝郁組小鼠血清、脾臟腫瘤組織NE、E水平±s，n=6)

注： 與空白對照組比較，aP<0.05，bP<0.01。

表4 RT-PCR法檢測不同藥物處理后小鼠脾臟腫瘤組織TGF-β、IL-6、VEGF、MMP-9 mRNA 相對表達量比較

注： 與空白對照組比較，aP<0.01；與空白肝郁組比較，bP<0.05，cP<0.01。

表5 WB法檢測不同藥物處理后小鼠脾臟腫瘤組織中TGF-β、IL-6、VEGF、MMP-9蛋白表達量比較

注： 與空白對照組比較，aP<0.01；與空白肝郁組比較，bP<0.05。

表6 不同藥物處理后小鼠肝轉移瘤VEGF、 CD31平均光密度值表達的比較

注： 與空白對照組比較，aP<0.01；與空白肝郁組比較，bP<0.05，cP<0.01

本實驗在肝氣郁結的前提下，進一步通過皮下微泵持續性給予非選擇性β-AR阻滯劑(普萘洛爾)以及β2-AR阻滯劑(ICI118,551)。結果發現，在阻斷β-AR信號通路后，肝轉移灶顯著減少。本實驗進一步從mRNA和蛋白水平兩方面檢測肝氣郁結對腫瘤轉移相關因子表達的影響。結果顯示，肝郁組小鼠脾臟種植瘤組織中TGF-β、IL-6、VEGF 和MMP-9 mRNA和蛋白表達水平較對照組顯著升高，而給予β-AR阻滯劑或β2-AR阻滯劑后逆轉了肝氣郁結的作用，提示β-AR信號通路介導肝氣郁結促進結腸癌肝轉移的機制還涉及上調腫瘤轉移相關因子的表達。

在結腸癌發生肝轉移的方式中，經門靜脈轉移是最主要的途徑，故本實驗采用脾內注射人結腸癌細胞株的方法，模擬腫瘤細胞通過門靜脈進入肝臟并形成轉移灶的過程，構建肝轉移模型。因此，本實驗運用免疫組化法對肝轉移瘤組織中VEGF和CD31蛋白表達情況進行標記，觀察肝氣郁結對轉移瘤新生血管形成的影響。結果顯示，肝氣郁結能顯著上調肝轉移瘤組織中VEGF和CD31蛋白的陽性表達，在給予β-AR阻滯劑或β2-AR阻滯劑后，VEGF和CD31 蛋白陽性表達減弱，這提示β-AR信號通路同時能夠介導肝氣郁結促進轉移瘤新生血管的形成。本實驗結果表明，肝氣郁結打破了機體內環境的平衡及穩定，并以β-AR信號通路作為橋梁，使各種神經遞質及免疫抑制因子與腫瘤細胞相互作用，從而營造出有利于腫瘤侵襲轉移的環境。

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(本文編輯： 韓虹娟)

Effect of liver qi stagnationon liver metastasis of mouse model of colon cancer

MAMengyu,YANGXiaoyan,ZHAOLu,etal.

DepartmentofOncology,PutuoHospital,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai,201203,China

XUJianhua，E-mail：xujianhua50@126.com

Objective The liver qi stagnation syndrome model was established to observe the effect of liver qi stagnation on liver metastasis of colon cancer and the role of β-AR signal pathway in it. Methods BALB/C mice were randomly divided into blank control group, propranolol control group, ICI118,551 control group, liver depression group, liver depression treated with propranolol group, liver depression treated with ICI118,551 group. The expressions of TGF-β, IL-6, VEGF and MMP-9 were detected by ELISA and Western blot. The expressions of VEGF and CD31 in liver metastatic tissues were observed by immunohistochemistry. Results Compared with the blank control group, the liver weight of the mice was significantly increased of liver depression group (P<0.01), and the level of NE and E in blood was increased (P<0.01,P<0.05) and the level of NE in spleen was increased (P<0.05). The expression of TGF-β, IL-6, VEGF, MMP-9 and mRNA in spleen tumor of liver depression group was significantly higher than those of control group (P<0.01), and the expression was decreased after treated with propranolol or ICI118,551(P<0.01,P<0.05). The expression of VEGF and CD31 in liver metastases of liver depression group was significantly higher than those in control group (P<0.01), and the expression was decreased after treated with propranolol or ICI118,551(P<0.01,P<0.05).Conclusion Liver qi stagnation can promote liver metastasis of colorectal carcinoma by mediating β2-AR signal pathway.

Liver qi stagnation； Colon cancer； Liver metastasis； β-AR signal pathway

國家自然科學基金面上項目(81573940)；國家自然科學基金青年項目(81403350)；上海市進一步加快中醫藥事業發展三年行動計劃(中醫藥專門人才計劃項目) (ZY3-RCPY-3-1012)

200062 上海中醫藥大學附屬普陀醫院中醫腫瘤科[馬夢雨(博士研究生)、梁芳、張勇、徐可、樊瀛哲、許建華]，人事處(楊曉燕)；無錫市中醫醫院腫瘤科(趙璐)

馬夢雨(1989- )，女，2014級在讀博士研究生。研究方向：中醫內科學。E-mail：intercity@163.com

許建華(1962- )，博士，主任醫師，博士生導師。研究方向：中醫腫瘤學。E-mail：xujianhua50@126.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.06.010

2017-01-12)