國產試劑檢測結核分枝桿菌對異煙肼、利福平耐藥基因臨床價值的探討

張啟全 侯遠沛 劉成永

國產試劑檢測結核分枝桿菌對異煙肼、利福平耐藥基因臨床價值的探討

張啟全 侯遠沛 劉成永

目的 比較進口試劑和國產試劑在檢測結核分枝桿菌對利福平、異煙肼耐藥基因差異 ，探討國產試劑的臨床使用價值 方法 152株經羅氏培養陽性的菌株，分別用德國Hain life science GmbH生產的Geno Type?MTBDRplus、亞能生物技術(深圳)有限公司生產的基因探針試劑檢測利福平、異煙肼耐藥基因，并與傳統的藥敏結果作比較。結果 152例菌株中有148株納入比較，其中 進口試劑、國產試劑和羅氏培養法對利福平、異煙肼耐藥的檢出率分別為47.30%(70/148)，43.24%(64/148)；50%(74/148)，41.89(62/148)； 48.65%(72/148)，47.30%(70/148)，國產試劑與進口試劑、羅氏培養法相比，對利福平、異煙肼耐藥檢出率均無統計學差異(P>0.05). 以羅氏培養的藥敏結果為金標準，國產試劑和進口試劑對利福平、異煙肼耐藥的檢出敏感性和特異性均無統計學差異(P>0.05)。結論 國產試劑檢測異煙肼和利福平耐藥的敏感性與特異性與進口試劑相接近，且操作簡便，價格便宜，適合基層醫院對結核分枝桿菌耐藥性的快速檢測。

分枝桿菌；結核；異煙肼；利福平；耐藥

根據近年來國家以及地方對結核分枝桿菌的耐藥調查，均提示結核分枝桿菌的耐藥情況并未得到有效的控制[1-3]，與2000年第四次全國結核病流行病學抽樣調查相比, 結核分枝桿菌初、復治耐藥率都有所增加[4]，尤其是西部欠發達地區，增加更為明顯[5]。耐藥結核分枝桿菌的發現主要依賴藥敏試驗,傳統的羅氏培養法及其藥敏試驗是確診耐藥結核病的“金標準”,但該方法耗時2-3月，難以滿足臨床對耐藥結核病快速診斷的需要，隨著結核分枝桿菌對單個抗結核藥物耐藥分子機制的闡明[6]，檢測利福平、異煙肼耐藥基因作為一種快速藥敏試驗已經逐漸應用于臨床。本院既往使用的是德國Hain life science GmbH生產的GenoType?MTBDRplus試劑，之后又引進深圳亞能生物技術有限公司生產的基因探針試劑，本文應用這兩種試劑同時檢測利福平、異煙肼的耐藥基因，并與傳統的羅氏藥敏結果作比較，探討國產基因探針檢測試劑的臨床應用價值。

資料與方法

一、病例選擇

152株結核分枝桿菌的菌株均來自我院2014,1-2015.6月病房和門診痰菌培養陽性患者,男122例,女30例,年齡8-87，平均年齡47.54±20.29。152例菌株中用進口試劑檢測到4株為非結核分枝桿菌，另兩種試劑檢測為結核分枝桿菌，結果不符，去除這4例菌株，共有148株菌株進行比較。

二、試劑和方法

結核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑:①國產試劑由亞能生物技術(深圳)有限公司提供，采用PCR-反向點雜交酶顯色法②進口試劑為GenoType MTBDRplus，由德國Hain life science GmbH提供，采用PCR-反向線雜交酶顯色法③傳統的藥敏試劑由珠海貝索生物技術有限公司提供，實驗方法按照《結核病診斷實驗室檢驗規程》中的比例法進行[7]，所用藥物濃度:異煙肼0.2μg/mL，利福平為40μg/mL。刮取羅氏培養基上生長的分枝桿菌于無菌管中，加入無菌生理鹽水，研磨成混懸液，先接種于羅氏藥敏培養基表面，剩余菌液85℃ 30分鐘滅活后，超聲破碎，制成原始菌液，供耐藥基因檢測使用。所有檢測均嚴格按照試劑盒配備的說明書和SOP文件操作。

三、儀器選擇

超聲儀為Elma GmbH&Co KG提供，型號為DE-78224,PCR擴增儀為天隆生物科技有限公司提供，型號為TI988； GenoType MTBDRplus使用的雜交儀為德國Hain life science GmbH提供，型號為TwinCubator，亞能試劑使用的恒溫雜交儀為亞能生物技術(深圳)有限公司提供，型號為YN-H16

四、統計學方法

采用 PEMS 3.1醫學統計軟件進行統計分析，率的比較采用χ2檢驗，兩組均數的比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。以羅氏培養的藥敏結果為金標準，判斷兩種基因探針檢測試劑的敏感性和特異性。

結 果

一、148株結核分枝桿菌采用國產試劑對利福平、異煙肼耐藥基因的檢出率分別為50%(74/148)，41.89(62/148)；進口試劑對利福平、異煙肼耐藥基因的檢出率為47.30% (70/148)，43.24%(64/148)；兩種試劑相比，耐藥基因的陽性檢出率無統計學意義(χ2=0.22,0.06；P=0.64,0.81)，傳統的羅氏藥敏結果提示利福平、異煙肼耐藥率分別為48.64%(72/148)，47.30(70/148)，與國產試劑相比，耐藥檢出率無統計學差異(χ2=0.05,0.88；P=0.82,0.35)，148株結核分枝桿菌采用國產試劑、進口試劑以及傳統的羅氏培養法對利福平和異煙肼耐藥檢出率(見表1)。

表1 148株結核分枝桿菌采用國產試劑、進口試劑以及傳統的羅氏培養法對利福平和異煙肼耐藥檢出率(%)

※:①與②、③相比

二、72株傳統的羅氏藥敏結果為利福平耐藥的菌株中，國產試劑檢出72株耐藥，進口試劑檢出70株耐藥，與傳統的羅氏藥敏結果相比，國產試劑對利福平耐藥檢出率為100%(72/72)，進口試劑對利福平耐藥檢出率為97.22%(70/72)，二者相比無統計學差異(χ2=2.03，P=0.15)；

70株羅氏藥敏結果，異煙肼耐藥菌株中，國產試劑與進口試劑均檢出62株耐藥，與傳統的羅氏藥敏結果相比，二者耐藥檢出率相同，均為88.57%，72株利福平耐藥菌株與70株異煙肼耐藥菌株用國產試劑和進口試劑耐藥檢出率的比較(見表2)。

表2 比較國產試劑和進口試劑對利福平和異煙肼的耐藥檢出率(%)

三、以傳統的羅氏藥敏結果為金標準，測得國產試劑和進口試劑對利福平耐藥的敏感性分別為100%(72/72)，97.22%(70/72)；特異性分別為97.37%(74/76)，100%(76/76), 二者相比，敏感性和特異性均無統計學差異(χ2=2.03,2.03；P=0.15,0.15)；國產試劑和進口試劑對異煙肼耐藥的檢測敏感性相同，均為88.57%(62/72)；特異性分別為100%(78/78)，97.44%(76/78),特異性相比無統計學差異(χ2=2.03；P=0.15)。國產試劑和進口試劑對利福平、異煙肼耐藥的檢測敏感性和特異性(見表3)。

表3 國產試劑和進口試劑對利福平、異煙肼耐藥的檢測敏感性和特異性

討 論

一、據WHO發布的《2015年全球結核病監測報告》估計，2014年全球約有960萬例新發結核病例，48萬耐多藥結核病患者，超過一半的耐多藥結核病患者發生在中國、印度和印度尼西亞[8]。多地的耐藥監測結果顯示我國耐藥結核病的發生率高于全球，尤其對于合并糖尿病和艾滋病等免疫功能低下的患者，其結核病的感染率和耐藥率均高于機體免疫功能正常的患者[9-10]，給結核病的防治造成很大的困難。目前化學藥物治療仍是結核病的首選，由于耐藥患者較多，因此越早知道藥敏結果越有利于患者的治療和康復，減少耐藥結核分枝桿菌在人群中的傳播。研究表明對利福平、異煙肼耐藥基因的檢測，可作為一種快速檢測方法，用于耐藥結核病的檢查[11-12]。

二、結核分枝桿菌對利福平耐藥的原因主要是由于編碼RNA聚合酶的rpoB基因突變，干擾了利福平與RNA聚合酶β亞單位結合，使利福平失去療效[13]。對異煙肼耐藥與過氧化氫酶編碼基因KatG及烯酰酸性磷酸酶還原酶(NADH)編碼基因inhA和ahpC基因啟動子的缺失和突變有關[14]，基因突變使得異煙肼不能干擾細胞壁中分枝菌酸的生物合成，不能破壞結核分枝桿菌細胞壁的完整性及抗酸性，使異煙肼失去療效，導致耐藥[15]。目前無論是國產試劑還是進口試劑都是基于此原理設計探針，用于檢測與利福平、異煙肼耐藥相關的基因，盡管進口試劑設計的探針數量略多于國產試劑，但表1的檢測結果提示國產試劑與進口試劑對利福平、異煙肼耐藥的陽性檢出率無顯著差異(P>0.05)，國產試劑使用的基因檢測法與傳統的羅氏培養法相比，對利福平、異煙肼耐藥的陽性檢出率也無顯著差異(P>0.05)，基因檢測法的使用，提高了耐藥結核病的診斷效率，有利于用藥方案的及時調整，提高耐藥結核病患者的治愈率。

三、表2結果表明，以傳統的羅氏藥敏結果為金標準，國產試劑和進口試劑對利福平耐藥的陽性檢出率分別為100%、97.22%，國產試劑的檢測結果與傳統的藥敏結果高度一致；兩種試劑對異煙肼耐藥的陽性檢出率均為88.57%，低于傳統的藥敏結果，造成這一現象的原因可能是由于目前檢測異煙肼耐藥的試劑僅包含KatG和inhA兩種最常見的耐藥基因以及少量的耐藥位點，與異煙肼耐藥相關的基因位點還有很多[15]，目前的基因檢測試劑包含的變異位點數有限，使得有些對異煙肼耐藥的菌株不能被及時檢出。

四、表3結果表明，以傳統的羅氏藥敏結果為金標準，國產試劑與進口試劑對利福平、異煙肼耐藥的檢出敏感性和特異性相近，二者相比差異不明顯(P>0.05)，國產試劑對儀器要求不高，操作簡單，24h可出具報告，試劑價格相對便宜，可作為進口試劑的替代產品在國內基層醫院廣泛使用，既滿足臨床對結核分枝桿菌耐藥快速檢測的需要，又為患者節約了檢測成本。

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Clinical value of domestic reagents for detecting of drug resistance gene of Mycobacterium tuberculosis against isoniazid and rifampin

ZHANGQi-quan,HOUYuan-pei,LIUCheng-yong.

DepartmentofClinicalLaboratory,XuzhouMunicipalInfectiousDiseaseHospital,Xuzhou,Jiangsu221004,China

Objective To compare the differences of domestic and imported reagents on detecting drug resistance gene of Mycobacterium tuberculosis against isoniazid and rifampin. Methods Drug resistance was detected by reagent with Germany Hain life science GmbH production MTBDRplus and Yaneng Biological Technology Co. (Shenzhen) analysis in 152 strains with L-J culture-positive, and the results of L-J culture were compared. Results 148 strains were compared in 152 cases. The rates of drug resistance against rifampin and isoniazid were 47.30% (70/148) Vs 43.24% (64/148), 50% (74/148) Vs 41.89% (62/148) and 48.65% (72/148) Vs 47.30% (70/148) by imported reagents, domestic reagents and L-J culture respectively. The rates of drug resistance against rifampin and isoniazid showed no significant difference among imported reagents, domestic reagents and L-J culture (P>0.05). The sensitivity and specificity had no significant difference in detecting drug resistance against isoniazid and rifampin between imported and domestic reagents as the gold standard of l-J susceptibility (P>0.05). Conclusion The sensitivity and specificity about domestic reagent for detecting isoniazid and rifampicin are closer to imported reagents. Domestic reagents fit for basic hospital on detecting drug resistance of Mycobacterium tuberculosis rapidly, because it is simple and cheap.

mycobacterium tuberculosis; isoniazid; rifampicin; drug resistance

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.06.003

221004 江蘇 徐州 ，徐州市傳染病醫院檢驗科

侯遠沛,E-mail hhyyppxz@163.com

2016-09-18]