非小細胞肺癌患者中EGFR與TTF-1表達及與患者預后關系的研究

邸慶國 張玲 買智濤 姜明明 張欣 孫寶華

非小細胞肺癌患者中EGFR與TTF-1表達及與患者預后關系的研究

邸慶國1張玲2買智濤1姜明明1張欣1孫寶華1

目的 探索NSCLC患者TTF-1與EGFR突變表達情況及其與患者預后的關系。方法 共收集2011.1-2014.12我科NSCLC患者240例組織標本，采用免疫組化法檢測TTF-1表達，采用PCR擴增直接測序法檢測EGFR突變，采用χ2檢驗研究EGFR突變與TTF-1陽性表達的相關性，Kaplan-Meier法分析患者總生存期(OS)與TTF-1及EGFR突變的關系，繪制出生存曲線，P<0.05為有顯著統(tǒng)計學意義。結(jié)果 TTF-1陽性與患者性別，吸煙指數(shù)，病理分型，TNM分期，EGFR突變及PS評分有明顯相關性，TTF-1陽性、EGFR突變陽性患者與陰性患者生存曲線均無交叉，生存期有差別，尤其EGFR突變中21外顯子陽性患者其生存期明顯好(P<0.001)。結(jié)論 TTF-1可作為NSCLC患者預測預后的一個獨立指標，聯(lián)合EGFR突變可以更好的預測預后，指導臨床診療。

非小細胞肺癌；甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子；表皮生長因子受體

肺癌是最常見的肺部原發(fā)性惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌(non small cell lung cancer， NSCLC)占其發(fā)病率80%，其發(fā)病率和死亡率已居于各類腫瘤的首位[1]。隨著化療方法的不斷提高，其生存期有了顯著延長，特別是近十余年來靶向研究的不斷深入，使得患者生存期更有了極大提高[2]。

EGFR突變檢測是肺癌靶向治療的前提，EGFR突變陽性患者對EGFR-TKI制劑敏感性好，預后會有極大改善[3]，但是EGFR突變檢測存在時間要求，其檢測結(jié)果與標本大小，檢測方法等有明顯相關性。Yatabe 等[4]研究發(fā)現(xiàn)EGFR突變陽性率較高的腺癌中其甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子(thyroid transcription factor，TTF-1)表達也較高，免疫組化檢測分析發(fā)現(xiàn)TTF-1陽性率達到75%左右[5]，有文獻指出[6-7]TTF-1表達陽性的肺腺癌中大約93-96%的EGFR突變分析陽性，這表明TTF-1與EGFR突變表達存在一定相關性。由于TTF-1檢測方法較EGFR突變檢測簡單，省時，因此進一步探索明確TTF-1表達與EGFR突變之間的關系及與患者預后的相關性大小，從而可以進一步指導臨床治療，預測預后。

資料與方法

一、臨床資料

收集我科2011.1至2014.12月非小細胞肺癌患者240例，男性171例，女性69例。鱗癌86例，腺癌138例，腺鱗癌12例，其他類型4例。其中行EGFR基因檢測的患者144例。240例患者組織標本均行免疫組化檢測，144例患者采用PCR直接測序法檢測EGFR表達情況。總體臨床數(shù)據(jù)資料采集患者姓名、性別、年齡、體重變化、病理分型、分期、有無吸煙、免疫組化檢測結(jié)果、EGFR(18-21外顯子)突變情況、PS評分及患者生存期。其中PS評分依據(jù)Zubrod-ECOG-WHO(ZPS)法，病理類型依據(jù)2007年WHO肺、胸膜腫瘤診斷標準，腫瘤分期依據(jù)2009年第7版肺癌TNM分期標準。(見表1)。

二、檢測方法

TTF-1檢測：組織標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，經(jīng)脫水后進行石蠟包埋，切片6張(厚度5um)，其中1張經(jīng)HE染色行病理診斷，其余5張行免疫化染色。免疫組化采用EnVision兩步法(抗人TTF-1單克隆抗體及EnVision兩步法試劑盒均采購丹麥DAKO公司產(chǎn)品，嚴格按說明書進行操作)。

EGFR突變檢測：主要檢測外顯子18、19、20、21位點基因片段。PCR法直接擴增外顯子及其相連的內(nèi)含子片段(PCR流程：變性95 ℃ 15 min；變性94 ℃ 30 s，退火65 ℃ 30 s和延伸72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)；最后延伸72 ℃ 5 min)。采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增片段，凝膠成像系統(tǒng)檢測擴增產(chǎn)物電泳圖譜，行正反兩個方向測定PCR產(chǎn)物基因并測序圖譜。

三、結(jié)果判定

1 切片HE染色及免疫組化染色均由兩位有豐富經(jīng)驗的病理科醫(yī)師讀片審核(TTF-1表達于細胞核，呈棕黃色顆粒，以細胞核出現(xiàn)棕黃色為陽性信號)(見圖1)。

2 EGFR測序圖譜與正常對照分析有無突變(見圖2)

四、隨訪

通過住院病例采集、電話回訪及微信回訪形式收集患者詳細病例資料。

五、統(tǒng)計學處理

采用χ2檢驗比較TTF-1與臨床各因素之間關系，進一步采用pearson法分析TTF-1表達與EGFR突變的相關性，通過Kaplan-Meier生存分析法比較TTF-1與EGFR在患者生存方面的相關性，繪制生存曲線，P<0.05(雙側(cè)檢驗)為差異有統(tǒng)計學意義，運用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行分析。

表1 TTF-1與各臨床因素比較匯總

圖1 免疫組化中TTF-1表達情況

圖2 檢測到EGFR 19和21外顯子突變圖譜表現(xiàn)

A.19外顯子突變；B. 19外顯子野生型；C.21外顯子突變;D 21外顯子野生型

結(jié) 果

一、患者基本情況統(tǒng)計

通過χ2檢驗比較TTF-1表達與各臨床因素之間關系。(見表2、3)。

表2 EGFR檢測中19外顯子突變與TTF-1關系分析

表3 EGFR檢測中21外顯子突變與TTF-1關系

二、非小細胞肺癌患者生存分析

回訪240例非小細胞肺癌患者，通過生存分析Kaplan-Meier法分析TTF-1及EGFR突變患者的生存情況，繪制生存曲線。(見圖3-6)。

圖3 TTF-1表達與患者總生存期之間關系。TTF-1陽性患者與陰性患者生存曲線無交叉，生存期存在差異，但P=0.289，無明顯統(tǒng)計學意義

圖4 EGFR突變患者與野生型患者其生存曲線無交叉，生存期存在差異，但P=0.56，無明顯統(tǒng)計學意義

圖5 EGFR突變與患者總生存期之間關系。21外顯子突變患者生存情況，突變患者與野生型患者生存期存在差異，P<0.001,有顯著統(tǒng)計學意義

圖6 19外顯子突變患者與野生型患者生存曲線存在交叉，且P=0.501，無統(tǒng)計學意義

討 論

EGFR是分子量為170 KD的跨膜糖蛋白，通過與表皮生長因子(epidermal growth facto，EGF)結(jié)合并啟動細胞核內(nèi)的一系列信號轉(zhuǎn)導。該受體在多種上皮性腫瘤細胞中均有較高表達，EGFR表達增高直接影響到腫瘤細胞的增殖、遷移、粘附、轉(zhuǎn)移、凋亡抑制及血管生成，同時其在腫瘤不同分期表達不同，其與患者生存期，預后以及治療敏感性有密切相關。EGFR屬于Ⅰ型表皮生長因子受體家族(基因位點位于7號染色體短臂TP12-14區(qū))，目前已發(fā)現(xiàn)的EGFR突變90%以上位于外顯子18-21位點，其中最多的是19外顯子(2235-2250位)堿基缺失和21外顯子點突變(2573位T替代G)，從而引起氨基酸編碼改變。

TTF-1在Ⅱ型肺泡上皮細胞和無纖毛細支氣管上皮細胞中有較高表達，其在表面活性物質(zhì)和Clara細胞分泌蛋白增強區(qū)域結(jié)合，從而維持肺癌細胞生長活性，TTF-1在非小細胞肺癌細胞中隨病理類型的不同表達而異，有研究指出TTF-1在腺癌中表達約58%-84%[8-9]。

本研究提示TTF-1陽性表達與性別(P<0.001)、吸煙指數(shù)(P=0.002)、病理類型(P<0.001)、TNM分期(P<0.001)、EGFR突變(P<0.001)及PS評分(P=0.012)相關，特別是女性(88.41%)、不吸煙(73.72%)，腺癌(92.75%)患者TTF-1陽性表達明顯升高，Giaccone等[10]研究發(fā)現(xiàn)改組人群中EGFR突變率也明顯升高。采用免疫組化檢測TTF-1，是一種較EGFR突變分析省時，省力，節(jié)約成本的檢測方法，有研究發(fā)現(xiàn)[11]93-96%的NSCLC患者中EGFR與TTF-1同時表達，本研究也發(fā)現(xiàn)NSCLC中TTF-1與EGFR陽性表達存在一致性，僅7.32%EGFR陽性患者TTF-1表達陰性，2011年ASCO大會上Somaiah[12]等報道224例TTF-1陰性表達的肺腺癌患者中僅有2例發(fā)生EGFR突變，TTF-1檢測EGFR突變的靈敏度和特異度分別為99．1%和36．4%。Julien Vincenten等[2]發(fā)現(xiàn)TTF-1陰性患者其術后復發(fā)或化療后進展幾率明顯升高，可能與腫瘤細胞生長分化程度有關， Kyuichi Kadota等[13]研究指出TTF-1陰性患者術后易復發(fā)，生存期較短。有研究[14]已發(fā)現(xiàn)TTF-1陰性患者預后較差，本研究中結(jié)果顯示患者生存期情況與上述研究結(jié)果相符合指出TTF-1陽性患者預后明顯優(yōu)于陰性患者，因此TTF-1可作為預測患者預后的獨立指標。

研究發(fā)現(xiàn)早期肺癌中EGFR突變是一項獨立的預后因子，已有的研究指出EGFR突變患者接受化療，其有效率明顯升高；指南已提出EGFR突變檢測是晚期肺癌一線使用靶向藥物(吉非替尼、厄洛替尼)的先決條件。目前，EGFR突變的檢測手段很多，但對組織標本、實驗設備、質(zhì)量控制等要求較高，而且耗時、費用高等，使部分患者錯失檢測的機會，耽誤患者治療。而免疫組化檢測是一種快速、簡便、經(jīng)濟的方法，是在一般實驗室都能開展的項目，因此采用TTF-1來預測患者治療效果及預后具有更重要臨床指導意義，尤其對于級別及設備不全的較低級別醫(yī)院具有更好的指導意義。

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Research of relation between TTF-1 and EGFR mutations and prognosis in NSCLC

DI Qing-guo, ZHANG Ling, MAI Zhi-tao, JIANG Ming-ming, ZHANG Xin, SUN Bao-hua.

Department of Respiratory Medicine, Cangzhou Central Hospital, Cangzhou, Hebei 061000, China

Objective To explore the relationship between the expression of TTF-1, EGFR mutations and the prognosis of patients of NSCLC. Methods 240 cases of tissue samples of NSCLC were collected from 2011.1 to 2014.12. Immunohistochemical staining method was used to detect the TTF-1 expression, and direct sequencing detection was used to detect EGFR mutations. Chi-square test was used to compare the correlation of EGFR mutation positive expression and TTF-1 expression, and Kaplan Meier survival analysis method to analyze the correlation between the patients’ overall survival (OS) and EGFR mutation and TTF-1. Results The positive expression of TTF-1 had significant relevance with gender, smoking index, pathological type, TNM stage, EGFR mutations and PS score. Through the survival analysis it showed that the prognosis of TTF-1 in patients with positive and EGFR mutation positive was significant difference from negative patients. Their survival curves were without cross, and further analysis of EGFR mutation in exon 21 positive patients showed the survival was obviously better (P<0.001). Conclusion TTF-1 can be used as an independent predictor to predict prognosis in NSCLC. Further, EGFR mutations can better predict the prognosis of NSCLC patients and guide clinical diagnosis and treatment.

NSCLC; TTF-1; EGFR

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.06.008

061000 河北 滄州，滄州市中心醫(yī)院1.呼吸一科、2.內(nèi)分泌三科

2016-08-27]