細胞蠟塊結合免疫組化在小細胞癌診斷中應用價值

權春姬 金仁順

細胞蠟塊結合免疫組化在小細胞癌診斷中應用價值

權春姬 金仁順

目的 探討應用細胞蠟塊結合免疫化學染色在惡性小細胞癌中診斷價值。方法 利用常規細胞涂片或薄層液基細胞學(thinprep cytology test ，TCT)方法篩查疑似小細胞癌病例21例(細針穿刺標本8例、胸腔積液13例)，全部病例制作細胞蠟塊，采用免疫組織化學染色，比較分析兩種方法的診斷價值。結果 診斷小細胞癌的陽性率在細胞蠟塊-免疫組化方法明顯高于常規細胞涂片或TCT方法(76.2%和28.6%)，兩種方法比較有顯著性差異(χ2=9.545,P<0.05)。余5例中1例為腺癌、2例為鱗癌、1例為間皮瘤、1例為多發性骨髓瘤。結論 細胞蠟塊結合免疫組化技術可提高小細胞癌陽性率,對鑒別診斷和組織學分型具有重要意義。

細胞塊；免疫組化；小細胞癌；鑒別診斷

小細胞癌常見原發于肺，惡性程度高，近年來發病趨勢上升。細胞學在惡性小細胞腫瘤診斷是一個難題，各類參考書籍描述少，缺乏經驗，容易漏診。隨著細胞蠟塊技術廣泛推廣，細胞蠟塊結合免疫組化方法能有效提高小細胞腫瘤診斷陽性率。本研究通過21例細胞蠟塊標本，聯合應用各種免疫組化抗體，綜合分析，比較其與普通涂片及薄層液基細胞學(thinprep cytology test TCT)技術在診斷陽性率方面的差異，并探討細胞蠟塊結合免疫組織化學染色(immunohistochemistry,IHC)技術在小細胞癌診斷及鑒別診斷方面的應用，為晚期惡性小細胞癌患者的病理診斷提供一種準確可行的新途徑。

資料與方法

一、材料

收集我院2012年11月-2015年12月通過細針穿刺涂片或TCT篩選出的21例疑似小細胞癌標本，全部標本制作細胞蠟塊。標本類型胸腔積液13例、細針穿刺標本8例(淋巴結7例、皮下組織1例)。其中男性12例、女性9例，年齡50歲-77歲，平均58.9歲。

二、方法

1 細針穿刺涂片：常規消毒皮膚用左手食指與中指固定腫物，伸展上方皮膚并穩固向下壓，右手持10mL注射器8號針頭，以45°角快速刺入皮膚達包塊，將注射器活塞拉到1-2mL標記處以不同角度進行抽吸3-5次，釋放負壓后拔針。迅速將針管內吸取物推至干燥玻片上，制片2張，用95%乙醇固定，HE染色，顯微鏡下觀察。

2 TCT制片：取臨床送檢的胸腔積液放入50mL尖底離心管，3000r/min離心5mim，棄上清液取部分離心管沉渣置液基細胞保存液中，靜置20mim后上機制片，巴氏染色。液基制片機為湖北孝感德立森公司提供。

3 細胞塊制備：參照姚宇琪[1]的試管包埋法：胸水標本放入一次性尖底塑料管中離心(3000r/min,5min),去上清，加入95%乙醇，充分混勻再次離心。穿刺物直接放入裝有95%乙醇的10mL尖底離心管進行離心。兩種標本離心后棄上清液，用手術剪從試管底端開始以0.2cm厚度剪去，將裝有沉淀物的試管放入包埋盒中，在10%中性福爾馬林固定2h，進行石蠟包埋切片，HE染色。

4 免疫組化：所選抗體Syn、CD56、CK、CK7、CK20、TTF-1、NapsinA、Calretinin 、CD138、CK5/6、P63，WT-1、LCA均為工作液，購自北京中杉金橋生物技術有限公司，染色方法采用EnVision兩步法，染色過程按說明進行，用DAB顯色。 支持小細胞癌的免疫組化指標：Syn、CD56、CK；支持腺癌細胞的免疫組化指標：CK7、NapsinA、TTF-1；支持間皮細胞的免疫組化指標：CK5/6、Calretinin、WT-1；支持鱗狀細胞癌的免疫組化指標：CK5/6、P63；CD138陽性細胞為漿細胞性腫瘤。結果判斷：TTF-1、P63、WT-1核染色，呈棕黃色顆粒；Syn、CK、CK7、CK20、CK5/6、NapsinA、Calretinin均為胞質陽性，呈棕黃色顆粒；CD56 、CD138、LCA呈棕黃色細胞膜染色。所有細胞陽性率>10%視為陽性細胞。

5 統計學分析：應用SPSS19.0統計軟件，卡方檢驗分析，P<0.05為差異具有統計學意義。

結 果

一、TCT及普通細胞學涂片鏡下觀察

小細胞腫瘤在胸腔積液中典型表現為細胞小，呈圓型，核染色深，立體感強，呈葡萄串狀排列，即使呈單個癌細胞也有“厚實”感，因細胞排列較密集常看不清楚；小細胞腫瘤在細針穿刺標本涂片中仍顯示細胞相對較小，部分細胞細絲雜亂樣，結構不清。21例標本中因其細胞典型而診斷小細胞癌為6例，診斷陽性率為28.6%(6/21)。

二、細胞塊HE鏡下觀察

小細胞腫瘤在胸腔積液細胞塊中呈團狀排列，細胞呈圓型或卵圓形，穿刺標本蠟塊中部分呈現擠壓現象，結構模糊不清，核染色質呈細顆粒狀，表現出經典的“椒鹽樣”特性。

三、免疫表型

21例標本中 16例小細胞腫瘤對CK、CD56、Syn、TTF-1陽性表達。余5例中 1例對CK7、NapsinA、TTF-1陽性而診斷為腺癌；2例 P63、CK5/6陽性而診斷為鱗狀細胞癌，1例Calretinin、WT-1、CK5/6陽性診斷為間皮瘤，1例對CD138陽性而診斷為多發性骨髓瘤(見表1)。最終確診的16例小細胞病例和5例非小細胞腫瘤病例，后經臨床、影像學及相關實驗室檢查得到相應證實。

四、診斷陽性率比較

通過細胞涂片(細針穿刺涂片)、TCT涂片診斷小細胞癌6例，陽性率為28.6%(6/21)，細胞塊結合免疫組化診斷小細胞陽性率76.2%(16/21)，與常規細胞學涂片比較有統計學差異(χ2=9.545，P<0.05)(見表2)。

表1 21例細胞蠟塊免疫組化染色結果

表2 21例標本 兩種方法診斷陽性率比較

討 論

小細胞癌常原發于肺，占全部肺癌的15%-20%[2]，以其復雜的病理生理學特性和高度惡性而引起病理和臨床工作者的重視。小細胞癌的治療與預后與非小細胞癌不同，因而對它的識別和診斷非常重要。臨床細胞病理學可通過痰檢、支氣管刷檢及漿膜腔積液脫落細胞學檢查對小細胞癌進行診斷。如果發生了頸部淋巴結或體表的轉移，也可以通過細針穿刺診斷小細胞癌。在細胞學上表現特征主要是：細胞小，約為成熟淋巴細胞的2-3倍，胞質少，呈巢狀分布，由于胞質少，易蛻變丟失，常呈裸核，極易受外力影響而拉成核絲失去細胞的結構特征。盡管有以上特點，但常規脫落細胞學檢查時因細胞過度重疊，炎性滲出物及黏液混在一起，造成背景不清晰而診斷不明確，極易漏診。特別是出現在漿膜腔積液時易與淋巴細胞、小間皮細胞混淆，導致檢出率降低。細胞蠟塊技術其制作簡單可避免常規細胞涂片的不足，又可以像常規活檢一樣反復切片，而且提供更多的細胞數量結合免疫組化進行腫瘤分類甚至也可以做臨床預后評估及靶向治療研究[3-5]。

小細胞癌具有上皮及神經內分泌標記陽性的特點[6]，免疫組織化學標記物常包括CgA、Syn、NSE和CK等[7-8]。文獻報道CD56也在肺小細胞癌有較高的表達[9-11]。TCT和普通細胞涂片難以鑒別小細胞癌，本研究通過細胞蠟塊技術結合免疫組化標記診斷小細胞癌共16例，而普通細胞涂片和TCT技術診斷小細胞癌只有6例，有效提高了診斷陽性率(76.2% vs 28.6%)。另外我們觀察到16例小細胞癌病例CD56全部表達陽性，而Syn在小細胞癌中僅有11例表達陽性，據此推斷CD56在小細胞腫瘤中，比Syn具有更高的敏感性,這與劉盡國[12]等報道相似。TTF-1增高存在于多種肺癌中[13],本研究中16例小細胞癌病例中TTF-1全部陽性而明確腫瘤來源于肺。小細胞癌主要與低分化腺癌、鱗癌、淋巴瘤等鑒別，如出現在漿膜腔積液還應與間皮病變相鑒別。因其在HE上很難與其他腫瘤鑒別，所以必須結合免疫組織化學染色鑒別小細胞癌。常用鑒別診斷抗體包括：低分化鱗狀細胞癌CK5/6、P63抗體組合；惡性淋巴瘤LCA、CD3、CD20組合[14]；腺癌CK7、TTF-1、NapsinA等組合；間皮病變Calretinin、WT-1等抗體組合。本研究中5例非小細胞癌病例的細胞蠟塊標本中腫瘤細胞也呈現圓型細胞，與小細胞腫瘤鑒別困難，我們結合臨床病史應用NapsinA、CK7、P63、CK5/6、WT-1、Calretinin、CD138、LCA等多種免疫組化抗體組合，結果1例患者因NapsinA、CK7陽性而確診為腺癌，2例因P63、CK5/6陽性而診斷為鱗狀細胞癌，1例因間皮標記物WT-1和Calretinin陽性而診斷為間皮病變。1例患者既往有多發性骨髓瘤病史，胸水中發現圓型腫瘤細胞，因 CD138陽性，CD56、Syn陰性也排除了小細胞腫瘤。另外1例小細胞癌皮膚轉移患者需與原發性神經內分泌癌鑒別，因CK20(-)、TTF -1(+),而有效排除皮膚原發性神經內分泌癌，支持肺來源。全部病例因LCA(-)、CK(+)而排除了淋巴系統來源腫瘤。

總之，常規細胞涂片診斷小細胞腫瘤困難，而利用細胞蠟塊結合免疫組化染色技術，可大大提高惡性小細胞腫瘤的檢出率，減少漏診及誤診的發生，且明確腫瘤分型，值得臨床推廣。

[1] 姚宇琪，王瑾，楊霞，等.試管包埋切片技術應用于體液檢查診斷的實驗體會[J].四川醫學，2004,25(3)：357-358.

[2] Singh S,Parulekar W,Murray N,et al.Influence of sex on toxicity and treatment outcome in small-cell lung cancer[J].J Clin Oncol,2005,23(4):850-856.

[3] 張纓，周瑜，梅佳，等.惡性漿膜腔積液細胞塊在分子病理診斷中的應用[J].臨床腫瘤學雜志，2013,18(2)：147-150.

[4] 孟加榕，潘羨心，郭以河，等.肺腺癌胸腔積液上清液和細胞塊EGFR基因突變檢測的臨床意義[J].解放軍醫藥雜志，2014,26(10)：82-85.

[5] 楊紅，王影，覃勝，等.漿膜腔積液細胞塊對提高細胞學診斷及開展基因檢測的價值[J/CD].中華臨床醫師雜志(電子版)，2013,7(21)：9489-9493.

[6] 趙渙芬，河春年.肺小細胞癌53例臨床病理分析[J].診斷病理學雜志，2007,14(6)：437-440.

[7] 虞紅珍，吳強，秦蓉，等.聯合組織學與細胞學對肺小細胞癌診斷和鑒別診斷[J].臨床與實驗病理學雜志，2012,28(1)：61-64.

[8] 周曉軍，黃文斌.免疫組化在小圓細胞未分化惡性腫瘤中的應用[J].臨床與實驗病理學雜志，2009,25(3)：232-235.

[9] 梁國棟，馬亞琪，宋欣,等.宮頸小細胞癌20例臨床病理分析[J]. 診斷病理學雜志，2015，22(1)：8-11.

[10] 丁國正，彭鈞，施煒.59例肺小細胞癌臨床及病理分析[J].醫學信息(中旬刊)，2010,12：3451-345.

[11] 汪美華, 凌揚, 周林艷.免疫組織化學在肺小細胞癌診斷中的應用[J].腫瘤基礎與臨床，2015，28(2):148-150.

[12] 劉盡國，張杰，張儉，等.液基薄層細胞學與免疫細胞化學聯合在肺癌分型及鑒別診斷中的應用[J].臨床與實驗病理學雜志，2013,29(8)：871-875.

[13] Perner S,Wagner PL,Soltermann A,et al.TTF1 expression in non-small cell lung carcinoma:association with TTF1 gene amplification and improved survival[J].J Pathol,2009,217(1):65-72.

[14] 周小鴿.淋巴瘤病理診斷中的抗體選擇[J].診斷病理學雜志，2010,17(1)：4-6.

Application value of cell block combined with immunohistochemistry in diagnosis of small cell carcinoma

QUANChun-ji,JINRen-shun.

DepartmentofPathology,theAffiliatedHospitalofYanbianUniversity,Yanji,Jilin133000,China

Objective To investigate the diagnostic value of cell block combined with the immunohistochemistry in the diagnosis of small cell carcinoma. Methods 21 cases of suspected small cell carcinoma (8 cases of fine needle aspiration, 13 cases of pleural effusion) were screened by using routine smear or thinprep cytology test method. All samples were diagnosed by cell blocks combined with immunohistochemistry. The diagnostic value of the two methods was comparative analyzed. Results The positive rate of immunochemistry of cell blocks (76.2%) was significantly higher than that of the routine smear or thinprep cytology test (28.6%) (χ2=9.545,P<0.05). In the remaining 5 cases, 1case was adenocarcinoma, 2 cases were squamous cell carcinoma, 1 case was mesothelioma, and 1 case was multiple myeloma. Conclusion Cell blocks combined with immunohistochemistry technique can improve the positive rate of small cell carcinoma, which has important significance in the differential diagnosis of small cell carcinoma and histological classification．

cell blocks; immunohistochemistry; small cell carcinoma; differential diagnosis

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.06.011

133000 吉林 延吉，吉林省延邊大學附屬醫院病理科

2016-10-10]