OC-STAMP基因過表達載體及穩轉細胞系的構建

袁慧敏，何茳萍，張光亞，張丹丹，陳鳳玲

(1.蚌埠醫學院 臨床學院，安徽 蚌埠 233030； 2.上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院 內分泌科，上海 201900)

基礎醫學研究

OC-STAMP基因過表達載體及穩轉細胞系的構建

袁慧敏1，何茳萍2，張光亞2，張丹丹2，陳鳳玲2

(1.蚌埠醫學院 臨床學院，安徽 蚌埠 233030； 2.上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院 內分泌科，上海 201900)

目的 構建破骨細胞多次跨膜蛋白(OC-STAMP)基因過表達質粒，體外轉染RAW264.7細胞構建穩轉細胞系，為進一步研究OC-STAMP的功能提供工具。方法 根據NCBI數據庫中OC-STAMP基因信息，設計引物，采用PCR擴增其基因片段; 運用基因重組方法雙酶切目的基因，并將其克隆至含有綠色熒光蛋白(GFP)的pCDH-CMV慢病毒載體，經酶切測序對重組質粒進行鑒定；轉染成功構建的質粒至293T細胞中Western blotting驗證蛋白過表達情況；采用psPAX2和pMD2.G兩種包裝質粒包裝pCDH-CMV-oc-stamp重組質粒獲得病毒液，病毒感染RAW264.7細胞獲得OC-STAMP過表達穩轉細胞系，Q-PCR和Western blotting驗證蛋白過表達情況。結果 酶切和測序鑒定表明成功構建pCDH-CMV-oc-stamp的基因重組質粒; 將成功構建的pCDH-CMV-oc-stamp質粒轉染至293T，可觀察到大量綠色熒光表達; 將成功包裝獲得的病毒液感染RAW264.7細胞后q-PCR及Western blotting結果證實OC-STAMP成功過表達。結論 成功構建pCDH-CMV-oc-stamp重組質粒及OC-STAMP過表達的穩轉細胞系。

破骨細胞多次跨膜蛋白；質粒構建;病毒轉染；RAW264.7細胞

破骨細胞跨膜蛋白(Osteoclast stimulatory transmembrane protein，OC-STAMP) 是Yang等[1]于2008年在經核因子B受體活化因子配體( receptor activator of nuclear factor-Bligand，RANKL) 誘導后的小鼠巨噬細胞株RAW 264.7細胞及原代骨髓巨噬細胞中發現的一個多次跨膜蛋白。小鼠的OC-STAMP基因位于2號染色體上，與人的同源性和相似性分別為74%和86%。……