重組腺病毒pCMV-NM23-IRES-EGFP載體的構建及鑒定

曾 理，唐澤飛，李春鳴

(遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院 病理科，貴州 遵義 563099)

臨床醫(yī)學研究

重組腺病毒pCMV-NM23-IRES-EGFP載體的構建及鑒定

曾 理，唐澤飛，李春鳴

(遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院 病理科，貴州 遵義 563099)

目的 構建攜帶有NM23的重組腺病毒載體并觀察其對人胃癌細胞株BGC-823凋亡的影響。方法 以質粒NM23-PIRES2-EGFP為模版，采用PCR擴增NM23基因，克隆至腺病毒載體pCMV-MCS-IRES-EGFP上，形成重組腺病毒載體pCMV-NM23-IRES-EGFP并酶切鑒定及基因測序。將人胃癌細胞株BGC-823分為實驗組(NM23-OE組，感染pCMV-NM23-IRES-EGFP)、空白組(Ctrl組)，陰性對照組(NC組，感染pCMV-MCS-IRES-EGFP)；Real Time PCR和Western Blot分別檢測3組細胞中NM23mRNA和蛋白表達；流式細胞儀檢測3組細胞凋亡率。結果 經酶切鑒定和基因測序證實成功構建重組腺病毒pCMV-NM23-IRES-EGFP；經擴增后，重組腺病毒的滴度為4.0×1010ifu/mL ；RT-PCR及Western blot結果顯示，陰性對照組與空白組相比差異無統計學意義(P>0.05)，而實驗組的NM23的mRNA和蛋白表達顯著高于其他兩組(P<0.05)；實驗組BGC-823細胞的凋亡率也顯著高于其他兩組(P<0.05)。結論 成功構建了過表達NM23的重組腺病毒pCMV-NM23-IRES-EGFP載體，通過上調NM23基因的表達，可觀察到胃癌細胞株BGC-823的凋亡水平有明顯升高，為后續(xù)研究NM23基因對人胃腺癌細胞生物學功能的影響提供實驗基礎。

NM23；載體；BGC-823；腺病毒；凋亡

NM23基因最早發(fā)現于1988年，是由美國國立癌癥研究所的Steeg等[1]用消減雜交分離的方法從7個K-1735小鼠黑色素瘤細胞株中分離出來并克隆成功。作為第一個被發(fā)現的腫瘤轉移抑制基因，NM23基因在多種腫瘤細胞中呈現低表達或不表達[2-3]，而這種表達的缺失對腫瘤的浸潤轉移起重要作用。Radovic等[4]研究發(fā)現，與正常胃黏膜相比NM23基因在胃腺上皮細胞癌中呈現低表達。孫端[5]發(fā)現胃癌組織中NM23基因表達的缺失可導致臨床TMN分期的加重。

作為目前應用最為廣泛的載體之一，腺病毒載體具有宿主范圍廣、感染率高、安全性好等諸多優(yōu)點[6]。本實驗采用AdMax系統的第三代腺病毒，通過構建攜帶NM23基因的重組腺病毒載體并感染人胃癌細胞株BGC-823，從而獲得穩(wěn)定過表達NM23基因的人胃癌細胞株BGC-823，為后續(xù)研究NM23基因對人胃腺癌細胞生物學功能的影響提供實驗基礎。