黑腹果蠅吞噬細胞對金黃葡萄球菌與大腸埃希菌的不同吞噬作用

王 徵，朱 斐

（浙江農林大學 動物科技學院，浙江 臨安 311300）

黑腹果蠅吞噬細胞對金黃葡萄球菌與大腸埃希菌的不同吞噬作用

王 徵，朱 斐

（浙江農林大學 動物科技學院，浙江 臨安 311300）

吞噬作用是一種對抗微生物病原體的重要機制，但許多細菌均有抗吞噬作用。利用透射電鏡和激光共聚焦顯微鏡結合細胞生物學技術，對黑腹果蠅 Drosophila melanogaster S2細胞吞噬熱滅活大腸埃希菌（heat inactivated Escherichia coli,HIEC）和熱滅活金黃葡萄球菌（heat inactivated Staphylococcus aureus,HISA）的作用進行了研究。結果表明：S2細胞能夠在接種后1 d內有效清除HIEC，但不能清除HISA；經聚肽糖（PG）或脂多糖（LPS）激活的S2細胞同樣不能有效地清除HISA，HISA能夠在S2細胞內至少存活4 d。在接種細胞酸性指示劑（pHrodo）標記的細菌1 h后，HIEC處于酸化環境中，而HISA沒有；檢測S2細胞的吞噬百分率顯示S2細胞吞入活細菌與滅活細菌的敏感度沒有顯著差異。 PG處理后的S2細胞防御素（defensin）與抗真菌肽（drosomycin）均顯著上調表達，但仍無法消化HISA。結果證實：滅活金黃葡萄球菌表面具有抑制吞噬作用中消化步驟的成分，而滅活大腸埃希菌沒有。研究揭示了在S2細胞對抗革蘭氏陽性菌時，吞噬作用在清除該類病原體時所起到的重要作用以及金黃葡萄球菌抑制消化過程從而抵御細胞吞噬的策略。圖7表1參38

免疫生物學；吞噬作用；黑腹果蠅；金黃葡萄球菌；大腸埃希菌；防御素；抗真菌肽

無論是脊椎動物還是無脊椎動物，先天性免疫都是第一線防御機制，對抗著各類病原體的侵染。吞噬作用作為一種高度保守進程的先天性免疫機制，能夠為許多細胞用來消化微生物病原體以及凋亡或壞死的細胞殘骸［1-3］。在吞噬作用中，外來物質被細胞識別并結合到細胞表面，被吞噬小體吞入，并在被吞入的物質周圍形成細胞器［4］。吞噬小體經過裂變以及與核內體、溶酶體，或是兩者共同的限制性融合后形成成熟的吞噬溶酶體。進入吞噬溶酶體內部的病原體則被低pH值、水解作用以及自由基所消滅［5］。黑腹果蠅Drosophila melanogaster是最常見的果蠅，因擁有與哺乳動物相近的先天性免疫系統，而被認為是研究宿主與微生物相互作用的最佳基因模式生物［6-7］。近年來，果蠅Schneider細胞株（S2）細胞已被確認是一種非常適合研究細胞感染的宿主模型，在對抗衣原體Chlamydia，單胞增生性李斯特菌Listeria monocytogenes，查菲埃立克體Ehrlichia chaffeensis，白念珠菌Candida albicans，大腸埃希菌Escherichia coli以及金黃葡萄球菌Staphylococcus aureus等病菌［6,8-14］的體外感染過程中，S2細胞與哺乳動物巨噬細胞的作用機制非常相近。金黃葡萄球菌是一種主要的人類病原體，致病率顯著，研究顯示金黃葡萄球菌可能是一種兼性胞內病原體［15］，并認為金黃葡萄球菌可以在巨噬細胞中存活數日而不影響細胞的生存情況［16］。筆者就果蠅S2細胞對熱滅活大腸埃希菌（heat inactivated Esherichia coli,HIEC）及熱滅活金黃葡萄球菌（heat inactivated Staphylococcus aureus,HISA）的吞噬模式展開研究，揭示了在S2細胞對抗革蘭氏陽性菌時，吞噬作用在清除該類病原體時所起到的重要作用以及金黃葡萄球菌抑制消化過程從而抵御細胞吞噬的策略。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黑腹果蠅S2細胞株從初代培養24 h的胚胎中分離獲得，在體積分數為10%的小牛血清的果蠅培養基（Ivitrogen,美國）中28℃培養［17］。為了確認脂多糖（LPS，Sigma，美國）或聚肽糖（PG，Sigma，美國）的活化作用是否會增強吞噬作用，將S2細胞以106個·孔-1鋪開在6孔板中并粘附30 min，LPS或PG經超聲處理1 h后，按1.0 mg·L-1的劑量加入到每個孔中孵育1 h，備用。

大腸埃希菌ATCC 14948菌株在LURIA-BERTANI培養基（LB）37℃培養24 h后，10 000 g離心10 min收集細菌。金黃葡萄球菌ATCC 25923菌株在含20.0 g·L-1氯化鈉的哥倫比亞培養基中培養過夜，在鹽溶液中重懸。熱滅活大腸埃希菌（HIEC）或熱滅活金黃葡萄球菌（HISA）以5×109個·L-1的密度接種于S2細胞，28℃孵育1 h。不同時間段收集S2細胞分析。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備與透射電子顯微鏡（TEM）分析 收集感染后的果蠅S2細胞（5.0～10.0 μL），在含體積分數2%多聚甲醛與2%戊二醛的0.1 mol·L-1二甲砷酸鈉緩沖液（pH 7.4）固定劑中浸泡16 h，室溫下不斷旋轉。以0.1 mol·L-1二鉀砷酸鈉緩沖液清洗，3次·樣品-1，5 min·次-1，保持室溫下旋轉。隨后加入體積分數2%鋨（Osmium），并以0.1 mol·L-1二鉀砷酸鈉緩沖液清洗3次，5 min·次-1，保持室溫下旋轉。樣品固定，20.0 g·L-1醋酸雙氧鈾緩沖液（pH 5.2）進行染色，室溫避光染色1 h，保持旋轉，隨后以0.1 mol·L-1二鉀砷酸鈉緩沖液清洗3次，5 min·次-1并不斷旋轉。通過逐級增加的丙酮溶液（體積分數依次為50%，60%，70%，80%，90%，95%，100%）對樣品進行脫水，室溫下旋轉處理，隨后在100%環氧丙烯中毒處理10 min。以EMBED 812或502樹脂黏結劑進行最終的滲透處理，V（環氧丙烯）∶V（黏合劑）=1∶1，室溫旋轉處理10 min；V（環氧丙烯）∶V（黏合劑）=1∶2，室溫旋轉處理20 min；100%黏合劑處理10 min。最終，樣品中加入新的100%黏合劑，滲透16 h后，在干燥烘箱中以60℃聚合 24～48 h。Hitachi 7650透射電鏡（Hitachi,日本）在70 kV下采集圖像［10］。

1.2.2 激光共聚焦顯微鏡分析 果蠅S2細胞用體積分數10%胎牛血清（FBS）的施耐德培養基12孔板中鋪板培養，并將密度為 5×109個·L-1異硫氰酸熒光素標記（FITC，Invitrogen,美國）的熱滅活大腸埃希菌（HIEC）/熱滅活金黃葡萄球菌（HISA），加入到S2細胞中 28℃共培養1 h。以磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗后，將混合細胞移植到多聚賴氨酸預處理的載玻片（Sigma，美國）上固定。之后，分別使用羅丹明鬼筆環肽（Invitrogen,美國）和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，Sigma，美國）一同孵育，用以標記肌動蛋白或細胞核DNA［18］。

1.2.3 流式細胞儀檢測分析 細胞培養與處理見1.2.2節。果蠅S2細胞接種細菌后，以PBS清洗，將混合細胞收集到流式管中，通過流式細胞儀檢測S2細胞內的FITC熒光信號，統計S2細胞對HIEC和HISA的吞噬能力。為了研究細胞的吞噬作用對活細菌和熱滅活細菌的敏感度，以胞內有1個以上FITC標記細菌的細胞在所有細胞中所占的百分比為參考值來予以評價。

1.2.4 細胞酸性指示劑（pHrodo）標簽檢測溶酶體酸化 在果蠅S2細胞（培養方法見1.2.2節）中加入LPS或PG，孵育S2細胞1 h，從而激活S2細胞；激活后的S2細胞以1×109個·L-1在6孔板中鋪開，分別接種pHrodo標記的滅活病原菌（5×109個·L-1），28℃共孵育1 h。收集混合細胞，立刻在共聚焦顯微鏡下觀察。分別統計不同處理組中，吞入pHrodo標記病原菌的S2細胞在全部細胞中所占百分比［18］。不同處理組間的差異以t檢驗進行統計學分析，P＜0.05為顯著。

1.2.5 實時熒光定量PCR檢測 果蠅S2細胞經過不同實驗處理后，以PBS清洗，收集細胞，使用Trizol試劑（Invitrogen，美國）提取總RNA，操作步驟依據產品使用說明書［18］。即刻使用5.0 μg總核糖核酸，以M-MLV反轉錄酶（Takara，日本）合成為20.0 μL cDNA。實時熒光定量的檢測采用基因特異引物與TaqMan探針（表1），反應體系包括10.0 μL Premix Ex Taq（Takara，日本），1.0 μL cDNA樣品，7.2 μL無酶水，各基因對應TaqMan探針0.3 μL，以及各特異性引物0.4 μL。聚合酶鏈式反應（PCR）程序如下：95℃，30 s；90℃，5 s，60℃，30 s，循環50次。數據分析使用iQTM5軟件。

1.2.6 統計學分析 本研究中每組試驗均使用3個生物學重復。統計學顯著性分析使用t檢驗，判斷對照組與實驗組的差異性，P＜0.05為顯著，P＜0.01為極顯著。

表1 實時熒光定量PCR反應中引物與TaqMan探針序列Table 1 Primers and TaqMan probe sequences in qRT-PCR

2 結果與分析

2.1 透射電鏡觀察黑腹果蠅S2細胞對HIEC或HISA的吞噬作用

透射電鏡下觀察黑腹果蠅S2細胞對滅活大腸桿菌（HIEC）或滅活金黃葡萄球菌（HISA）的吞噬過程，發現孵育1 h后S2細胞即可順利吞噬HIEC（圖1A），孵育后第1天S2細胞內HIEC已消失（圖1B）；但共孵育1 h后S2細胞未能吞噬HISA（圖1C），HISA（圖2A）與S2細胞共孵育4 d，仍保持形態完整（圖1D，圖2B，圖2C，圖2D，圖2 E）。在PG或LPS激活后，S2細胞也不能有效地吞噬HISA（圖2F，圖2G，圖2H）。與健康的S2細胞相比，在接種后第4天，S2細胞吞入的HISA依然形態完整（圖2E，圖2F，圖2G，圖2H）；吞入HISA的S2細胞沒有出現凋亡或破裂，表明細胞內的HISA并沒有對 S2細胞造成明顯的損傷。

圖1 透射電鏡觀察黑腹果蠅S2細胞對HIEC或HISA的吞噬作用Figure 1 Transmission electron microscopy of phagocytosis of HIEC or HISA by S2 cells

圖2 透射電鏡觀察黑腹果蠅S2細胞對HISA的吞噬作用Figure 2 Transmission electron microscopy of phagocytosis of HISA by S2 cells

2.2 激光共聚焦顯微觀察黑腹果蠅S2細胞對HIEC或HISA的吞噬作用

激光共聚焦顯微觀察發現，在S2細胞吞噬熱滅活大腸桿菌HIEC 1 h后，胞內可觀察到HIEC發出的綠色熒光（圖3A）；吞噬發生1 d后， S2細胞內觀察不到綠色熒光粒子（圖3B）；表明HIEC已經被S2細胞清除。同樣處理下，熱滅活金黃葡萄球菌HISA沒有被S2細胞清除。由圖3C和圖3D可知，HISA被吞噬后，被S2細胞內化到細胞內繼續存在。由此可知，在S2細胞接種滅活菌后，HIEC與HISA均被S2細胞吞入，但HIEC被S2細胞清除，而HISA則沒有被清除。

2.3 流式細胞儀檢測S2細胞對HIEC或HISA的吞噬作用

圖3 激光共聚焦顯微鏡觀察黑腹果蠅S2細胞對FITC標記的HIEC或HISA的吞噬作用Figure 3 Confocal microscopy of phagocytosis of FITC-labeled HIEC or HISA by S2 cells

流式細胞儀的檢測結果由圖4可知：接種1 h后，吞入了至少1個HIEC粒子的S2細胞在所有S2細胞中所占的比例接近40%，與S2細胞吞噬大腸埃希菌的結果相近；吞入至少1個HISA粒子的S2細胞在所有S2細胞中所占的比例接近25%，與S2細胞吞噬金黃葡萄球菌的結果相近。說明S2細胞吞入活細菌和熱滅活細菌的敏感度并沒有顯著差異。

2.4 吞噬溶酶體酸化觀察和吞噬率檢測結果

細胞內的酸性環境可誘導pHrodo標記的病原菌激發出紅色熒光，從而指示吞噬溶酶體的形成。激光共聚焦顯微鏡觀察發現，接種HIEC 1 h后，S2細胞內可觀察到紅色熒光，表明S2細胞對HIEC的消化程序被激活，細胞內形成了酸性環境（圖5A）；圖5B中未能觀察到紅色熒光，表明HISA未能激活S2細胞的酸化過程。使用LPS或PG激活S2細胞，再進行接種觀察，可發現在接種HISA 1 h后，未能觀察到紅色熒光，說明S2細胞的酸化過程仍未被激活。

為揭示LPS或PG的刺激對S2細胞吞噬活性的影響，用共聚焦顯微鏡觀察S2細胞吞噬pHrodo標記菌并統計吞噬率。結果表明：共孵育1 h后，只有接種HIEC的S2細胞內呈現酸性環境，其他的處理均不能誘導S2細胞酸化（圖6）。檢測吞噬百分比發現，只有HIEC處理組的吞噬率顯著高于對照組（P＜0.01）。使用LPS或PG激活S2細胞后再接種，S2細胞對HISA的吞噬率仍沒有顯著增加。這表明溶酶體酸化過程只發生在S2細胞吞噬HIEC的過程中，而LPS或PG刺激并不能誘導S2細胞吞噬HISA后的酸化過程（圖6）。

圖4 孵育1 h后黑腹果蠅S2細胞對FITC標記的病原菌的吞噬率Figure 4 Quantification of phagocytosis of FITC-labeled microbes by S2 cells at 1 h post-inoculation

圖5 激光共聚焦顯微觀察孵育1 h后黑腹果蠅S2細胞對pHrodo標記的HIEC及HISA的吞噬作用Figure 5 Confocal microscopy of phagocytosis of pHrodo-labeled HIEC or HISA by S2 cells at 1 h post-inoculation

2.5 實時熒光定量PCR檢測基因表達

實時熒光定量PCR反應中引物與TaqMan探針序列如表1所示。通過實時熒光定量PCR檢測不同處理條件下S2細胞內的防御素（defensin），抗真菌肽（drosomycin）和Relish的表達量變化。結果發現：防御素的表達量在HISA，HISA＋LPS和HISA＋PG等3個處理組中，均發生顯著上調（P＜0.01）；抗真菌肽的表達量僅在HISA＋PG處理組中發生顯著上調（P＜0.01）（圖7）；Relish的表達量在HIEC處理組中發生顯著上調（P＜0.01），但在HISA處理組中無顯著變化。

3 討論與結論

吞噬作用是動物對抗微生物病原體的一種重要免疫防御機制，由吞噬細胞來執行具體的功能［19-20］。本研究對黑腹果蠅S2細胞吞噬熱滅活大腸埃希菌（HIEC）和金黃葡萄球菌（HISA）的異同進行了研究。結果表明：S2細胞能夠在接種后1 d有效吞噬并清除HIEC，但卻無法清除HISA；即使到了接種后4 d，S2細胞仍不能有效地清除HISA，而是任由它存在于細胞內。經PG或LPS誘導激活的S2細胞同樣不能有效地清除HISA。與健康的S2細胞相比，存在于細胞內的HISA在接種4 d后并沒有明顯破壞S2細胞。許多研究證明在細胞培養模式下，金黃葡萄球菌能夠逃逸宿主細胞的免疫系統，具有隱藏的潛能［21］，可在胞內堅持存活一段時間［22-23］。在本研究中，熱滅活金黃葡萄球菌存在于S2細胞中達4 d以上，說明滅活后的金黃葡萄球菌仍存在抗吞噬的成分，這與金黃葡萄球菌存在多個抗吞噬因子有關［24-26］。統計細胞吞噬率發現，熱滅活并不會影響吞噬作用對滅活細菌的敏感性，這一點已被另一項研究所證實［11］。

圖6 共孵育1 h后S2細胞對pHrodo標記的HIEC及HISA的吞噬率Figure 6 Phagocytic percentages of the pHrodo-labeled HIEC or HISA

圖7 黑腹果蠅S2細胞吞噬HISA作用中防御素，抗真菌肽及Relish的表達譜Figure 7 Expression profiles of drosomycin,defensin and relish in phagocytosis of HISA

在消化進程中，吞噬溶酶體的pH值降低，細胞內環境酸化，可幫助吞噬作用的進行，并能夠通過pHrodo染料的使用進行檢測［27］。LPS是革蘭氏陰性菌的主要的細胞膜成分，可以通過Imd（immune deficiency）免疫信號通路激活巨噬細胞；PG是革蘭氏陽性菌細胞壁上的主要成分，可以通過Toll信號通路激活巨噬細胞。使用LPS或PG刺激接種HISA的S2細胞，細胞并未形成酸化環境。通過透射電鏡與激光共聚焦顯微鏡的觀察，明確了即使S2細胞經過LPS或PG的激活也不能有效地吞噬HISA的結果；檢測S2細胞對pHrodo標記的病原菌的吞噬百分比也表明，吞噬溶酶體的酸化只發生在S2細胞對HIEC的吞噬過程中，其他處理并不能引起S2細胞的酸化。

黑腹果蠅S2細胞的吞噬作用中包括了Toll與Imd等2條信號通路，其中Toll通路參與到抗革蘭氏陽性菌的免疫作用中，該免疫應答機制中包含Defensin基因［28-29］的表達，而已知的防御素（defensin）是一類由小胱甘酸富集而成，可被誘導的抗微生物肽，有利于宿主對真菌的防御應答［30］；Drosomycin基因表達的Drosomycin是一類可誘導的抗真菌肽，同樣由Toll通路調節，并在全身脂肪體中均有表達［31-32］。觀察發現防御素的表達量在HISA，HISA+LPS以及HISA+PG處理中，均發生顯著上調；抗真菌肽的表達量在HISA+PG處理中顯著上調；由此可以推斷，Toll通路在HISA+PG的刺激下被激活。但是也看到PG雖然能激活S2細胞的Toll通路，但卻無法有效清除HISA，同樣，胞內的HISA也不會誘導S2細胞凋亡。由此可知，金黃葡萄球菌作為一種人類病原體，對黑腹果蠅來說也是高致病的病原，與其他革蘭氏陽性菌相比，它表現出了更強的對防御素的抵御能力［36］。在黑腹果蠅中，Imd通路調節著對革蘭氏陰性菌的免疫應答，Relish作為NF-κB通路的轉錄因子，是Imd通路的終極目標［28］。本研究結果發現：Relish在HIEC處理中顯著上調（P＜0.01）， 說明Imd通路在HIEC處理中被激活，而激活的Imd通路最終誘導S2細胞吞噬HIEC，說明Relish的表達量與S2細胞吞噬HIEC的百分率呈正相關。

有研究表明：金黃葡萄球菌能夠迅速地逃避溶酶體/吞噬體的捕獲，在細胞液泡內存活可長達4 d，之后逃入細胞質中［16,37-38］。有趣的是，我們發現滅活金黃葡萄球菌同樣能夠在S2細胞內存活4 d，其細胞表面物質具有抗吞噬消化的活性。該結果同時暗示著無脊椎動物吞噬細胞對清除部分革蘭氏陰性及革蘭氏陽性菌均有所幫助，但細胞免疫對這些胞內細菌的清除效力勝于體液免疫。

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Differential phagocytosis of Staphylococcus aureus and Escherichia coli by Drosophila melanogaster S2 phagocytes

WANG Zhi,ZHU Fei
（College of Animal Science and Technology,Zhejiang A&F University,Lin’an 311300,Zhejiang,China）

Phagocytosis is an important defense mechanism against microbial pathogens,but many pathogens get the ability to subvert it.This research was aimed at discovering the potential mechanism of the gram positive and negative bacteria to survive from phagocytosis.In this study,Drosophila melanogaster S2 cells were applied as the host,and active/heat-inactivated Escherichia coli and Staphylococcus aureus were applied as invaders.Cultured S2 cells were incubated with Escherichia coli（EC）,Staphylococcus aureus（SA）,heat-inactivated Escherichia coli（HIEC）or Staphylococcus aureus （HISA）,separately.After incubation,S2 cells were collected for transmission electron microscopy （TEM）analysis,confocal laser scanning microscopy analysis, flow cytometry （FCM）analysis and real time quantitative PCR analysis.Results showed that S2 cells could phagocytose HIEC efficiently at 1 d post-inoculation,but they could not clear HISA.HISA could survive within S2 cells for at least 4 d,and peptidoglycan （PG）and lipopolysaccharide-activated S2 cells could not digest HISA efficiently either.Comparing S2 cells,intracellular HISA did not destroy the S2 cells even at 4 d postinoculation.The pHrodo-labeled HIEC was observed in an acidified environment at 1 h post-inoculation,but HISA was not.In addition,the percentage of phagocytized pHrodo-labeled bacteria showed no great differenceswhether the bacteria were engulfed alive or heat-killed.Defensin and drosomycin were up-regulated in the HISA+PG treatment,but S2 cells could not digest HISA.Also,results confirmed that antiphagocytic properties were located on the surface of heat-inactivated S.aureus but not on that of heat-inactivated E.coli.Thus, cellular immunity is important for Drosophila melanogaster S2 cells fighting gram-positive bacteria,and the role of phagocytosis shed light on clearing of the bacterial pathogens.［Ch,7 fig.1 tab.38 ref.］

immunobiology;phagocytosis;Drosophila melanogaster;Staphylococcus aureus;Escherichia coli; defensin;drosomycin

S856；R392

A

2095-0756（2017）03-0381-08

浙 江 農 林 大 學 學 報，2017，34（3）：381-388

Journal of Zhejiang A＆F University

10.11833/j.issn.2095-0756.2017.03.001

2016-04-18；

2016-07-23

國家自然科學基金資助項目（31370050）

王徵，從事甲殼動物抗病免疫研究。E-mail：jiu.jingli@qq.com。通信作者：朱斐，副研究員，博士，從事水產動物免疫與疾病研究。E-mail：zhufei@zju.edu.cn