雷帕霉素對哮喘緩解期小鼠模型氣道炎癥的作用

金華良 王利民 王嬌莉 夏俊波 馬勝林

●論 著

雷帕霉素對哮喘緩解期小鼠模型氣道炎癥的作用

金華良 王利民 王嬌莉 夏俊波 馬勝林

目的 探討雷帕霉素對哮喘緩解期小鼠氣道炎癥的作用與機制。 方法 將 50 只 Balb/c 小鼠隨機分為 5 組：正常對照組、哮喘緩解組、哮喘模型組、地塞米松組和雷帕霉素組，每組 10 只。采用卵蛋白致敏與激發制備哮喘模型，休息 3 周后，采用卵蛋白再次激發 1 周，在小鼠休息期間治療組采用雷帕霉素或地塞米松干預。采用 Buxco 無創肺功能儀檢測氣道高反應性；Luminex 測定肺泡灌洗液 IL-4、IL-5、IL-13、IL-17 及 INF-Y 水平；肺組織 HE 染色評價觀察小鼠肺組織氣道炎癥；Western blot檢測肺組織 p-S6、S6、AKT、p-AKT（S473）蛋白含量；流式分析測定肺泡灌洗液 CD4+CD25+Foxp3+Treg 細胞百分率。 結果 與正常組及哮喘緩解組比較：哮喘模型組氣道反應性升高（P＜0.01），灌洗液 IL-4、IL-5、IL-13 及 IL-17 水平增加（均 P＜0.01），肺組織氣道炎癥評分增高（P＜0.01），肺組織 mTORC1 信號通路下游蛋白 p-S6 蛋白增加（P＜0.01），灌洗液 Treg 細胞比例上升（P＜0.01）；與模型組比較：雷帕霉素在乙酰甲膽堿濃度為 6.25mg/ml時,可降低 Penh 值（P＜0.01），同時降低肺泡灌洗液 IL-4 水平（P＜0.01），并抑制肺組織炎癥細胞浸潤（P＜0.01），而肺組織 mTORC1 信號通路下游蛋白 p-S6 蛋白下降（P＜0.01），但雷帕霉素可降低肺泡灌洗液 Treg 細胞比例（P＜0.01）。 結論 在哮喘緩解期應用雷帕霉素，其可通過 mTORC1 信號通路顯著抑制哮喘急性發作時氣道炎癥；在哮喘緩解期應用雷帕霉素，對控制哮喘再次發作具有積極作用。

雷帕霉素 哮喘 mTOR 信號通路

【 Abstract 】 Objective To investigate the effects of rapamycin on airway inflammation in mice with asthma during remission. Methods Fifty Balb/c mice were randomly divided into 5 groups:normal control,asthma,asthma in remission, dexamethasone and rapamycin groups with 10 mice in each group.The asthma model was induced by ovalbumin(OVA) sensitization and challenge;after 3-week interval the mice were challenged by OVA again.Dexamethasone,rapamycin or saline was given to 3 groups,respectively during 3-week interval.Airway reactivity was measured by Buxco's non-invasive system. Cytokines IL-4,IL-5,IL-13,IL-17 and INF-Y in bronchoalveolar lavage fluid(BALF)were assessed by Luminex method.Lung tissues were examined for inflammatory cell infiltration.The expression of p-S6,S6,AKT and p-AKT(S473)in lung tissue was examined by Western blot.CD4+CD25+Foxp3+Treg cells in BALF was assessed by flow cytometry. Results Compared with the normal and remission groups,OVA re-expose significantly increased airway hyperresponsiveness(P＜0.01),elevated IL-4,IL-5, IL-13,IL-17 levels(P＜0.01),and reduced INF-Y in the BALF(P＜0.01);it also markedly increased inflammatory cells in lung tissue,increased Ttreg cells in BALF and decreased expression of p-S6(P ＜0.01).Rapamycin significantly reduced airway hyperresponsiveness to aerosolized methacholine at 6.25mg/ml(P＜0.01),inhibited IL-4 level in BALF,and markedly decreased inflammatory infiltration in lung tissues(P＜0.01).Notably,rapamycin significantly inhibited the expression of p-S6;and also Treg cells in BALF were significantly reduced after rapamycin treatment. Conclusion Antiasthmatic effects of rapamycin during remission time are at least partially through mTORC1 signaling pathway,and rapamycin may be used for asthma patients in remission to control asthma attack.

【 Key words 】 Rapamycin Asthma mTOR signaling pathway

支氣管哮喘是一種以慢性氣道炎癥、氣道高反應為特征，伴隨氣道上皮杯狀細胞增生，黏液高分泌，IgE 顯著增加，以 Th2反應為優勢的慢性變態反應性疾病[1]。盡管糖皮質激素與支氣管擴張劑是哮喘主要治療藥物，但這些藥物并非對所有哮喘患者有效[2]，哮喘患病率與發病率仍呈升高趨勢[3]。雷帕霉素可作用于哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路，顯著改善哮喘氣道炎癥與氣道高反應性[4]。然而雷帕霉素對哮喘治療作用尚存在爭議，不同時期應用其效果可能存在較大差異[5]。而在哮喘緩解期應用雷帕霉素，是否可改善哮喘氣道炎癥目前尚不清楚。本研究通過制備哮喘緩解期小鼠模型，探討在哮喘緩解期應用雷帕霉素對哮喘急性發作時氣道炎癥的改善作用及機制，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和試劑 健康 6 周齡 Balb/c 小鼠 50 只（體重 16～20g），由上海西普爾必凱實驗動物有限公司提供。采用隨機數字表法將小鼠分為 5 組：正常對照組、哮喘緩解組、哮喘模型組、地塞米松組和雷帕霉素組，每組 10 只。卵蛋白（V 級）和乙酰甲膽堿購于美國 Sigma公司；雷帕霉素購自美國 Gene operation 公司；免疫佐劑購于美國 Thermo Fisher 公司；小鼠調節性 T 細胞檢測試劑盒、IL-4、IL-5、IL-13、IL-17 及 INF-γ 均購于美國Ebioscience（San Diego)公 司；小 鼠 無 創 肺 功 能 儀 、流 式細胞儀分別為美國 buxco 公司、BD 公司產品；小鼠哮喘造模霧化儀器（Boy Sx 085G3005）為德國百瑞公司產品。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 將 Balb/c 雌性小鼠于實驗第 0 天腹膜腔內注射致敏液 0.1ml+皮下 0.1ml（含卵蛋白 40μg和免疫 佐 劑 0.05ml，0.9%氯化鈉溶液 約 0.15ml）， 第 7天、第 14 天重復致敏，第 21 天起用 1%的卵蛋白氯化鈉溶液霧化吸入激發，1 次/d，每次 30min，連續 1 周；第 28 天起停止激發 3 周，第 49 天起再次卵蛋白連續激發 1 周。同時第 49 天處理哮喘緩解組,第 56 天處理其余小鼠。并予實驗第 28 天至第 48 天（共 3 周）各干預組連續灌胃相應藥物（0.9%氯化鈉溶液、地塞米松 1mg/kg或雷帕霉素 4mg/kg）。正常對照組用等量 0.9%氯化鈉溶液進行霧化吸入。

1.2.2 氣道高反應檢測 將自然狀態下的 Balb/c 小鼠置入體描箱中，先測定基礎增強呼氣間歇（enhanced pause，Penh）值；隨后用乙酰甲膽堿激發，濃度由低到高依次為 0、6.25、12.5、25 和 50g/L，記錄此時的 Penh 值，每次霧化吸入 1min，記錄 3min。Penh 計算公式：呼氣峰壓力（PEP）/吸 氣 峰 壓 力（PIP）× 呼 氣 間 歇（Pause），其 中Pause=（Te-Tr）/Tr。Te：呼氣相時間；Tr：呼氣相松弛時間。

1.2.3 肺泡灌洗液細胞因子檢測 待肺功能檢測后，將小鼠處死。使用注射器吸取 PBS 液 1ml從導管緩慢注入灌洗雙肺，可見小鼠肺部逐漸膨脹，顏色由紅色變成粉白色，待液體完全進入肺內，輕壓肺部，以保證充分灌洗，5s后回抽液體，反復 2 次，回收率為 60%～80%。將液體離心，3 000r/min，取上清液,采用 Luminex 測定肺泡灌洗液 IL-4、IL-5、IL-13、IL-17 及 INF-γ，細胞沉淀留取用于流式實驗。

1.2.4 肺組織 HE 染色 取右肺上葉，10%的中性甲醛溶液固定，脫水、石蠟包埋、連續切片，厚 4μm，行 HE 染色，光鏡下觀察小鼠支氣管黏膜下和周圍肺組織炎性細胞浸潤。參照文獻[6]對炎癥浸潤程度進行評分：0 分，沒有炎癥細胞；1 分，少量炎癥細胞；2 分，炎癥細胞形成環狀，層厚 1 個細胞；3 分，炎癥細胞形成環狀，層厚 2～4個細胞；4 分，炎癥細胞形成環狀，層厚 4～5 個細胞；5分，炎癥細胞形成環狀，層厚＞5 個細胞。

1.2.5 Western blot 檢測 取肺組織提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，每組取 50μg 的總蛋白，按 1∶4 加入SDS 上樣緩沖液，沸水浴中加熱 5min，然后進行 SDSPAGE 電泳，轉膜，5%牛奶封閉 1h，分別加入 p-S6，S6，AKT，p-AKT（S473）一抗和內參 Actin 孵育過夜，TBST洗滌 3 次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫與膜孵育 1h，TBST 洗滌 3 次，ECL 法曝光后洗片，掃描后用Quantity One 灰度分析軟件進行光密度計算，以目的蛋白條帶灰度值與內參 Actin 灰度值的比值作為相應母的蛋白的表達量指標。

1.2.6 流式細胞術 留取肺泡灌洗液同上，將灌洗液離心沉淀后 PBS 重懸，流式緩沖液洗滌后，加入相應的熒光標記單抗（anti-CD4-FITC，anti-CD25-APC）,輕輕混勻，冰上避光孵育 30min。用流式細胞染色緩沖液洗滌后，加入 1ml細胞固定和破膜液，冰上避光孵育 30 min。破膜緩沖液洗滌 2 次，加入 anti-Foxp3-PE, 冰上避光孵育60min，用破膜緩沖液洗滌后上流式儀檢測。采用 Flowjo軟件計算 CD4+CD25+Foxp3+Treg 細胞占 CD4+T 細胞比例。

1.3 統計學處理 采用 SPSS13.0 統計軟件，計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用 Dunnet-t法。

2 結果

2.1 不同濃度乙酰甲膽堿時各組小鼠 Penh 值比較見圖1。

圖1 不同濃度乙酰甲膽堿時各組小鼠 Penh 值比較（與哮喘模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01）

由圖 1 可見，哮喘模型組小鼠的 Penh 值明顯升高，與正常對照組及哮喘緩解組相比差異均有統計學意義（P＜0.01）。在乙酰甲膽堿濃度為 6.25、12.5mg/ml時，地塞米松組小鼠 Penh 值明顯下降，與哮喘模型組相比差異有統計學意義（P＜0.05）。在乙酰甲膽堿濃度為 6.25mg/ ml時，雷帕霉素組小鼠 Penh 值明顯下降，與哮喘模型組相比差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 各組小鼠肺泡灌洗液細胞因子比較 見表 1。

由表 1 可見，哮喘模型組小鼠肺泡灌洗液 IL-4、IL-5、IL-13 及 IL-17 水平顯著上升，而 INF-γ 水平顯著下降，與正常對照組、哮喘緩解組相比差異均有統計學意義（P＜0.05 或 0.01）；地塞米松組 IL-4、IL-5、IL-13及 IL-17 水 平 較 哮 喘 模 型 組 顯 著 下 降 （P ＜0.05 或0.01）；雷帕霉素組較哮喘模型組 IL-4 水平顯著下降（P＜0.01），而 IL-5、IL-13、IL-17 及 INF-γ 水平差異均無統計學意義（均 P ＞0.05）。

表1 各組小鼠肺泡灌洗液細胞因子比較（ng/L）

2.3 各組小鼠肺組織氣道炎癥評分及肺組織病理變化肺組織氣道炎癥評分正常對照組（1.08±0.27）分，哮喘緩解組（2.45±0.90）分，哮喘模型組（4.42±0.70）分，地塞米松組（2.22±0.70）分，雷帕霉素組（2.71±0.18）分。哮喘模型組小鼠肺氣道炎癥評分顯著升高，與其余 4組比較差異均有統計學意義（均 P＜0.01）。各組小鼠肺組織病理變化見圖2。

2.4 各組小鼠肺組織 mTOR 下游信號通路蛋白變化見圖3。

由圖 3 可見，哮喘模型組 mTORC1信號通路下游蛋白 p-S6 蛋白顯著增加，與正常對照組相比差異有統計學意義（P＜0.01）；而哮喘緩解組、雷帕霉素組 p-S6蛋白較哮喘模型組下降（P＜0.05）；哮喘模型組 mTORC2信號通路下游蛋白 p-AKT（S473）蛋白與正常對照組、雷帕霉素組差異均無統計學意義（均 P ＞0.05）。

圖2 各組小鼠肺組織病理圖（a：正常對照組，b：哮喘緩解組，c：哮喘模型組，d：地塞米松組，e：雷帕霉素組；HE 染色，×100）

2.5 各組小鼠肺泡灌洗液 CD4+CD25+Foxp3+Treg 細胞變化 各組小鼠肺泡灌洗液 Treg 細胞比例：正常對照組 3.60±1.20，哮喘緩解組 1.15±0.45，哮喘模型組 5.62± 0.39，地塞米松組 2.91±0.56，雷帕霉素組 2.41±0.55。哮喘模型組肺泡灌洗液 Treg 細胞比例顯著增加，與其余 4組比較差異均有統計學意義（均 P＜0.01）。各組肺泡灌洗液 Treg 細胞比例見圖 4。

3 討論

本研究通過制備哮喘緩解期小鼠模型，探討雷帕霉素在哮喘緩解期的應用價值，研究發現哮喘緩解期小鼠經卵蛋白再次激發后，其氣道高反應性與氣道炎癥較正常組顯著升高，肺泡灌洗液細胞因子 IL-4、IL-5、IL-13及 IL-17 較正常組顯著升高，而 INF-γ 顯著下降。而在緩解期應用雷帕霉素，哮喘小鼠的氣道炎癥及氣道高反應性均有所改善。既往研究發現在哮喘造模早期應用雷帕霉素，可以顯著改善氣道炎癥與氣道高反應性[4]。但在哮喘模型制備成功后再給予雷帕霉素干預，其治療效果存在爭議：有研究發現在哮喘模型制備后休息 6 周（相當于緩解期），再次用抗原激發哮喘，激發期間同時予雷帕霉素治療，發現雷帕霉素仍能在一定程度上改善哮喘氣道炎癥，包括降低總的效應 T 細胞，減少杯狀細胞，降低 IgE 水平[7]；但也有研究發現在慢性哮喘模型后期，給予雷帕霉素干預，則發現其作用有限，反而加重氣道高反應與氣道炎癥[5]。但關于在哮喘緩解期應用雷帕霉素，對控制哮喘急性發作的應用價值，目前鮮有報道。本研究發現在哮喘模型制備后，在緩解期給予雷帕霉素治療，遇抗原再次激發時，可顯著緩解哮喘肺組織炎癥及氣道高反應性。IL-4 可以招募嗜酸性粒細胞及其他效應性細胞，促進 B 細胞分泌 IgE，增加杯狀細胞黏液分泌，參與氣道炎癥的發生和發展[8]。本研究發現雷帕霉素可降低肺泡灌洗液 IL-4 水平，說明雷帕霉素對氣道炎癥的改善作用可能與此相關。

圖3 mTOR 下游信號通路蛋白 p-S6、p-Akt的變化（與哮喘模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01）

圖4 各組肺泡灌洗液 Treg 流式細胞圖（a：正常對照組，b：哮喘緩解組，c：哮喘模型組，d：地塞米松組，e：雷帕霉素組）

由于 mTOR 信號通路與哮喘氣道炎癥密切相關，故本研究進一步探討了雷帕霉素對哮喘 mTOR 相關信號通路的作用。mTOR 為進化上高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，分子量大小為 289kDa，通過形成兩種復合物在細胞內傳遞信號：mTORCl（mTOR complex 1）和mTORC2（mTOR complex 2）[9]。Raptor 與 Rictor 分別為mTORCl和 mTORC2 的關鍵基因。激活 mTORCl信號通路促進下游核糖體蛋白 S6 激酶與 4EBP1 磷酸化水平，而 mTORC2 信號通路則促進 Akt（S473）磷酸化水平[10]。雷帕霉素是 mTOR 信號通路的抑制劑，小劑量雷帕霉素（500pM）只能抑制 mTORC1 信號通路，而大劑量（500nM） 可同時抑制 mTORC1 與 mTORC2 信號通路。本研究發現雷帕霉素能顯著抑制 mTORC1信號通路下游 p-S6 蛋白，但對 mTORC2 下游蛋白 p-AKT（S473）無顯著影響，說明本研究中雷帕霉素濃度只能抑制mTORC1 信號通路。mTOR 信號通路對 T 細胞的增殖具有重要的調節作用，研究發現將 Raptor基因敲除（即阻斷 mTORC1 信號通路），T 細胞增殖受到顯著影響[11]。與mTORC2 作用的區別是，阻斷 mTORC1 信號通路可抑制 Th2細胞分化與功能[12]。如上所述，本研究發現雷帕霉素可降低 Th2細胞因子 IL-4 水平。由于 Th2細胞在哮喘中發揮關鍵作用，故而本研究中雷帕霉素對哮喘模型氣道炎癥的改善作用，應與其抑制 mTORC1 信號通路，從而抑制 Th2反應相關。

mTOR 信號通路可調控細胞的生長、增殖及代謝，可調控 Treg 細胞分化與增殖。雷帕霉素可通過抑制mTOR 信號通路，而緩解哮喘氣道炎癥，因此本研究進一步探討雷帕霉素對哮喘 Treg 細胞作用變化。而 Treg對氣道炎癥具有重要的調節作用，研究認為 Treg 細胞可通過多種機制抑制效應性T細胞活化，從而控制哮喘氣道炎癥，其可能途徑包括：通過表達細胞溶解性 T 淋巴細胞相關抗原-4（CTLA-4），以細胞接觸方式抑制效應性 T 細胞活化；通過分泌抑制性細胞因子 IL-10 及TGF-β，從而抑制效應性 T 細胞；分泌穿孔素，使效應性T 細胞裂解；與效應性 T 細胞競爭細胞生長因子 IL-2，抑制效應性T細胞分化。既往體外實驗發現雷帕霉素在IL-2 存在的前提下可以顯著促進 Treg 細胞擴增[13]。然而本研究發現雷帕霉素與地塞米松均導致哮喘小鼠Treg 細胞比例顯著下降。由于在本研究中，雷帕霉素同時降低了效應性 T 細胞，其是產生 IL-2 的重要來源。故而與地塞米松作用類似，雷帕霉素降低 Treg 細胞可能與抑制產生 IL-2 來源的細胞有關。既往研究也發現在哮喘模型中，雷帕霉素與地塞米松均可使調節性 T細胞比例下降[7]。另有研究也發現重度哮喘患者肺泡灌洗液Treg 細胞比例較輕度患者顯著增加，并與氣道炎癥相關。這說明哮喘 Treg 細胞比例與炎癥細胞（特別是產生IL-2 細胞）相關[14]。此外，體外研究發現只有同時阻斷mTORCl和 mTORC2 信號通路, 才能促進 Treg 細胞分化與增殖[15]，而本研究中所采用的雷帕霉素劑量，僅阻斷了 mTORCl信號通路，而未能阻斷 mTORC2 信號通路，因此未能促進 Treg 細胞增殖。

本實驗通過在哮喘模型緩解期應用雷帕霉素，證實其可通過抑制 mTORC1信號通路，從而緩解哮喘急性發作時氣道炎癥與氣道高反應性。而與體外實驗相反的是，在哮喘動物模型緩解期應用雷帕霉素后，遇抗原再次激發時，哮喘 Treg 細胞水平下降，其可能與雷帕霉素所采用的劑量相關。

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Effects of rapamycin on airway inflammation in mice with asthma during remission

JIN Hualiang,WANG Limin,WANG Jiaoli,et al.
Department of Respiratory Medicine,Hangzhou First People's Hospital,Hangzhou Hospital of Nanjing Medical University,Hangzhou 310006,China

2017-01-02）

（本文編輯：馬雯娜）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.11.2017-19

國家自然科學基金（81403247/H2902）；浙江省醫藥衛生科技項目（2014KYA170）

310003 杭州市第一人民醫院 / 南京醫科大學附屬杭州醫院呼吸科

馬勝林，E-mail：mashenglin@medmail.com.cn