鹽酸左氧氟沙星注射液滅菌前已灌封樣品微生物限度檢查方法學的建立

喬龍娟，王林，黃加秀，田穎，王君

鹽酸左氧氟沙星注射液滅菌前已灌封樣品微生物限度檢查方法學的建立

喬龍娟，王林，黃加秀，田穎，王君

鹽酸左氧氟沙星為氧氟沙星的左旋體，其抗菌活性約為氧氟沙星的兩倍，主要作用機制為抑制細菌 DNA 旋轉酶的活性，阻礙細菌 DNA 復制，對大多數革蘭陰性菌和革蘭陽性菌均有較強的抗菌作用[1]。因其抗菌譜廣，抗菌作用強，維持時間長，療效高，不良反應輕微，臨床應用范圍廣泛[2]。

根據新版 GMP 的要求，應當依據所用滅菌方法的效果確定滅菌前產品微生物污染水平的監控標準，并定期監控[3-4]。檢驗方法的可靠直接決定產品日常監測的結果，筆者據此建立了鹽酸左氧氟沙星注射液滅菌前已灌封樣品的微生物限度檢查方法，并進行了方法學驗證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試品 鹽酸左氧氟沙星注射液配制液（規格：0.1 g/ml，批號：16062231、16071131、16071331）為揚子江藥業集團有限公司產品。

1.1.2 試驗用菌種 金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉菌[CMCC（F）98003]均來自中國菌種保藏中心。

1.1.3 稀釋液和緩沖液 0.9% 無菌氯化鈉溶液、pH 7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液均為自制。

1.1.4 培養基 胰酪大豆胨液體培養基（批號：20160310）、胰酪大豆胨瓊脂培養基（批號：20160308）、沙氏葡萄糖瓊脂培養基（批號：20160310）、沙氏葡萄糖液體培養基（批號：20160318），均由北京三藥科技開發有限公司提供。

1.1.5 儀器 ZH-2 型旋渦混合儀購自上海滬西醫療儀器廠；HTY-601 型集菌儀和全封閉集菌培養器均購自浙江泰林生物技術股份有限公司；KB400 型恒溫培養箱購自德國賓得公司。

1.2 方法

1.2.1 菌液制備 分別接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至胰酪大豆胨液體培養基，接種生孢梭菌的新鮮培養物至硫乙醇酸鹽流體培養基中，30 ～35 ℃ 培養 18 ～ 24 h；接種白色念珠菌的新鮮培養物至沙氏葡萄糖液體培養基中，20 ～ 25 ℃ 培養 24 ～ 48 h。上述培養物用 0.9% 無菌氯化鈉溶液稀釋成含菌數小于 100 cfu/ml的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養物至胰酪大豆胨瓊脂斜面培養基中，培養 5 ～ 7 d，產生大量孢子，加入 3 ～ 5 ml 含 0.05%（v/v）聚山梨酯 80 的 0.9% 無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，然后吸出孢子懸液（管口帶有薄的無菌棉花過濾菌絲）至滅菌試管內，用含 0.05%（v/v）聚山梨酯 80 的 0.9%無菌氯化鈉溶液將菌液稀釋至含 50 ～ 100 cfu/ml 的菌懸液，備用[4]。

1.2.2 需氧菌檢查方法

1.2.2.1 需氧菌檢查方法的預驗證一 鹽酸左氧氟沙星對大多數細菌均有較強的抗菌作用，但對厭氧菌和腸球菌的抑菌作用較差，故采用薄膜過濾法通過沖洗液及沖洗液加中和劑的方法[5]分別對銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌進行實驗，以確定最終的驗證方法。

試驗組：

A：取供試液 19.9 ml 和小于 10 000 cfu 的銅綠假單胞菌菌懸液 0.1 ml 混勻，然后取上述混勻后的樣品 2 ml 至含有 100 ml pH 7.0 的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液的集菌培養器中過濾，然后用 pH 7.0 的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液900 ml 沖洗，每次 100 ml，沖洗結束后取出濾膜，菌面朝上貼至胰酪大豆胨瓊脂培養基平板上，于 30 ～ 35 ℃ 倒置培養 3 d，逐日點計菌落數。金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌同法操作。

B：采用每 250 ml 含 1 ml 聚山梨酯 80 的緩沖液沖洗，其余操作同“A”。

C：采用每 250 ml 含 1 ml 3 mol/L 氯化鎂溶液的緩沖液沖洗，其余操作同“A”。

菌液組：以稀釋液代替供試液，其余按照“試驗組”項下 A、B、C 試驗組方法進行操作。

1.2.2.2 需氧菌檢查方法的預驗證二

試驗組：

D：取供試液 2 ml 至含有 100 ml pH7.0 的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液的集菌培養器中過濾，然后用 pH 7.0 的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液 900 ml 沖洗，每次 100 ml，在最后一次沖洗液中加入不大于 100 cfu/ml 的銅綠假單胞菌菌懸液，沖洗結束后取出濾膜，菌面朝上貼至胰酪大豆胨瓊脂培養基平板上，于 30 ～ 35 ℃ 倒置培養 3 d，逐日點計菌落數。金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌同法操作。

E：采用每 250 ml 含 1 ml 3 mol/L 氯化鎂溶液的緩沖液沖洗，其余操作同“D”。

F：采用每 250 ml 含 1 ml 聚山梨酯 80 和 1 ml 3 mol/L 氯化鎂溶液的緩沖液沖洗[6-8]，其余操作同“D”。

菌液組：以稀釋液代替供試液，按照“試驗組”項下D、E、F 方法進行操作。

1.2.2.3 需氧菌檢查方法的驗證

取 3 批進行驗證。

試驗組：取供試液 2 ml 至含有 100 ml pH 7.0 的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液的集菌培養器中過濾，然后用每 250 ml含 1 ml 聚山梨酯 80 和 1 ml 3 mol/L 氯化鎂溶液的 pH 7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液 900 ml 沖洗，每次 100 ml，在最后一次沖洗液中加入不大于 100 cfu/ml 的銅綠假單胞菌菌懸液，沖洗結束后取出濾膜，菌面朝上貼至胰酪大豆胨瓊脂培養基平板上，于 30 ～ 35 ℃ 倒置培養 3 d，逐日點計菌落數。金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌及黑曲霉同法操作。

菌液組：以稀釋液代替供試液，照“試驗組”項下方法進行操作。

供試品對照組：以稀釋液代替菌懸液，照“試驗組”項下方法進行操作。

稀釋劑對照組：取試驗菌 1 ml 至含 100 ml pH 7.0 的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液的集菌培養器中過濾，照“試驗組”項下方法進行操作。

1.2.3 霉菌及酵母菌檢查方法

1.2.3.1 霉菌及酵母菌檢查方法的預驗證

試驗組：

H：取供試液 19.9 ml 和小于 10 000 cfu 的白色念珠菌菌懸液 0.1 ml 混勻，然后取上述混勻后的樣品 2 ml 至含有 100 ml pH7.0 的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液的集菌培養器中過濾，用 pH 7.0 的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液 200 ml沖洗，每次 100 ml，沖洗結束后取出濾膜，菌面朝上貼至沙氏葡萄糖瓊脂培養基平板上，于 20 ～ 25 ℃ 倒置培養 5 d，逐日點計菌落數。黑曲霉同法操作。

I：采用 pH 7.0 的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液 500 ml沖洗，其余操作同“H”。

菌液組：以稀釋液代替供試液，其余照“試驗組”項下H、I 方法進行操作。

1.2.3.2 霉菌及酵母菌檢查方法的驗證

取 3 批進行驗證。

試驗組：取供試液 19.9 ml 和小于 10 000 cfu 的白色念珠菌菌懸液混勻，然后取上述混勻后的樣品 2 ml 至含有100 ml pH7.0 的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液的集菌培養器中過濾，然后用 pH7.0 的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液 200 ml沖洗，每次 100 ml，沖洗結束后取出濾膜，菌面朝上貼至沙氏葡萄糖瓊脂培養基平板上，于 20 ～ 25 ℃ 倒置培養 5 d，逐日點計菌落數。黑曲霉同法操作。

菌液組：以稀釋液代替供試液，照“試驗組”項下方法進行操作。

供試品對照組：以稀釋液代替菌懸液，照“試驗組”項下方法進行操作。

稀釋劑對照組：取試驗菌 1 ml 至含 100 ml pH 7.0 的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液的集菌培養器中過濾，照“試驗組”項下方法進行操作。

2 結果

2.1 需氧菌檢查方法的驗證

2.1.1 需氧菌檢查方法的預驗證一結果采用方法 A、B、C 的試驗組在培養 3 d 后，銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌的平板上均無菌產生，試驗組的回收率為0，三種方法均不適用該樣品的需氧菌檢查。

2.1.2 需氧菌檢查方法的預驗證二結果當試驗組采用方法 F 時，在培養 3 d 后，銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌的試驗組的回收率均大于 90%（表 1）。初步判定方法 F 適用于該供試品的需氧菌檢查，故采用該方法進行正式驗證。

表 1 需氧菌預驗證二結果（回收率 %）

2.1.3 需氧菌檢查方法的驗證結果經過 3 批樣品的驗證，銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的試驗組回收率均在 50% ～ 200% 之間，且對應稀釋劑對照組的回收率也符合要求（表 2）。

表 2 需氧菌驗證結果（回收率 %）

2.2 霉菌及酵母菌檢查方法的驗證

2.2.1 霉菌及酵母菌方法的預驗證結果當沖洗量分別為200、500 ml 時，白色念珠菌和黑曲霉的回收率均符合試驗要求且相差不大（表 3）。故采用沖洗量為 200 ml 進行正式驗證。

表 3 霉菌及酵母菌預驗證一結果（回收率 %）

2.2.2 霉菌及酵母菌方法的驗證結果3 批樣品的白色念珠菌、黑曲霉的試驗組回收率均在 50% ～ 200% 之間，且稀釋劑對照組的回收率也符合要求（表 4）。

表 4 霉菌及酵母菌驗證結果（回收率 %）

2.3 鹽酸左氧氟沙星注射液滅菌前已灌封樣品微生物限度檢查方法

需氧菌檢查：配制液進行薄膜過濾后采用每 250 ml 含1 ml 聚山梨酯 80 和 1 ml 3 mol/L 氯化鎂溶液的 pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液 900 ml 沖洗，每次 100 ml。

霉菌及酵母菌檢查：配制液進行薄膜過濾后用 pH 7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗 2 次，每次 100 ml。

3 討論

由于鹽酸左氧氟沙星有較強的抑菌性，單純采用薄膜過濾法不能消除其抑菌性。根據對喹諾酮類藥物化學性質的分析，該類藥品能夠與部分金屬離子（Fe2+、Mg2+、Mn2+等）進行絡合反應形成穩定的六元環絡合物，最終能達到消除抑菌活性的目的[6]。本文采用薄膜過濾法通過沖洗液及沖洗液加中和劑的方法分別進行了驗證，通過在沖洗液中添加適量的中和劑（聚山梨酯 80 和氯化鎂）能有效地消除抑菌活性。

本文將菌懸液和供試液混勻后進行驗證時，試驗組的回收率始終為 0。而根據《中國藥典》（2015 版）的規定：如果供試品對微生物生長的抑制作用無法以其他方法消除，供試液可經過中和、稀釋或薄膜過濾處理后再加入試驗菌懸液進行方法適用性試驗[5]。據此在最后一次沖洗液中加入符合要求的菌懸液進行多次試驗，確立了鹽酸左氧氟沙星注射液滅菌前已灌封樣品需氧菌、霉菌及酵母菌的微生物限度檢查方法。

聚山梨酯 80 和氯化鎂作為中和劑加入到沖洗液后，試驗結果對菌株無影響。在制備含聚山梨酯 80 和氯化鎂的沖洗液時，建議采用將聚山梨酯 80、氯化鎂溶液與緩沖液混合均勻、分裝后進行滅菌，用于供試品的檢測。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2017.03.016

225321 泰州，揚子江藥業集團有限公司

王林，Email：wanglin@yangzijiang.com

2017-03-11