草魚魚糜漂洗液中蛋白肽的制備及其功能性質的研究

丁小強，陳麗麗，白春清，袁美蘭，趙利

(江西科技師范大學 生命科學學院 國家淡水魚加工技術研發分中心，南昌 330013)

草魚魚糜漂洗液中蛋白肽的制備及其功能性質的研究

丁小強，陳麗麗，白春清，袁美蘭，趙利*

(江西科技師范大學 生命科學學院 國家淡水魚加工技術研發分中心，南昌 330013)

以草魚魚糜漂洗液回收蛋白為原料，短肽得率和水解度為指標，從5 種常用蛋白酶中選出堿性蛋白酶作為酶解回收蛋白的最適酶，通過單因素和響應面優化試驗得出最佳酶解條件：酶解溫度為52.51 ℃，酶解pH 為9.06，酶添加量為1.42%，酶解時間為60 min，酶解底物蛋白濃度為1 g/dL。在此條件下回收蛋白的水解度為20.86%，短肽得率為73.5%；比較酶解前后回收蛋白的功能性質，發現酶解后多肽的溶解性、乳化性和起泡能力有所增加，乳化穩定性、泡沫穩定性和持油性較酶解前有所降低。

堿性蛋白酶；蛋白質；水解度；多肽；功能性質

魚糜是我國水產制品加工中重要的中間原料，在魚糜生產加工中會產生大量富含蛋白質的廢水，蛋白質的含量高達0.9%～2.8%，約占魚肉蛋白的30%～40%[1]。魚糜漂洗液回收蛋白中氨基酸種類齊全，比例均衡，符合FAO/WHO推薦的理想蛋白質模式，是理想的優質蛋白[2]。目前，關于從魚糜漂洗液中回收蛋白的方式研究報道較多[3-5]，可是對回收蛋白進行酶解深加工的研究報道較少。使用蛋白酶把回收蛋白降解成小分子肽，不但可以提高回收蛋白的利用率，且小分子肽也許存在多種生物活性和更好的功能性質，擁有很好的開發利用價值。

本文采用堿性蛋白酶對魚糜漂洗液中的回收蛋白進行酶解，以水解度為指標，在溫度、pH值、酶添加量、酶解時間、底物濃度5個單因素試驗的基礎上，運用響應面分析法對回收蛋白水解工藝進行優化，同時比較回收蛋白水解前后的功能性質，旨在為魚糜漂洗液回收蛋白的深加工利用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

漂洗液回收蛋白 實驗室自制；中性蛋白酶(Neutrase)、復合蛋白酶(Protamex)、堿性蛋白酶(Alcalase)、風味蛋白酶(Flavourzyme) 北京諾維信生物技術有限責任公司；木瓜蛋白酶(Papain) 廣西龐博生物工程有限公司；氫氧化鈉、硫酸銅、硫酸鉀等試劑 均為分析純。

1.2 儀器與設備

12-H絞肉機 上海標本模型廠；85-1型磁力攪拌器 常州國華電器有限公司；TDL-5A離心機 上海菲恰爾分析儀器有限公司；PHS-3C pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；BSA224S-CW型電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司。

1.3 方法

1.3.1 魚糜漂洗液中蛋白的回收

新鮮魚肉絞碎→加水攪拌10 min→4層紗布過濾→調節漂洗液pH為5.5→5000 r/min離心5 min→回收蛋白。

1.3.2 回收蛋白的基本成分分析

水分含量的測定：干燥法(GB/T 5009.3-2010)；粗蛋白含量的測定：凱氏定氮法(GB/T 5009.5-2010)；灰分含量的測定：灼燒稱重法(GB/T 5009.4-2010)；粗脂肪含量的測定：索氏提取法(GB/T 5009.6-2003)。

1.3.3 回收蛋白酶解工藝流程

回收蛋白→加水勻漿→水浴加熱→調pH值→加酶保溫酶解→滴加1 mol/L氫氧化鈉標準溶液維持pH不變→90 ℃以上滅酶10 min→4000 r/min離心15 min→上清液過濾→回收蛋白酶解液。

1.3.4 短肽得率的測定[6]

采用三氯乙酸-可溶性氮指數(TCA-NSI)對短肽得率進行測定，短肽得率計算公式如下：

式中：N1為離心上清液中可溶性氮含量；N0為酶解液中總含氮量。

1.3.5 水解度的測定

采用pH-State法[7]進行測定，水解度計算公式如下：

1.3.6 蛋白酶的選擇

在底物蛋白濃度為1 g/dL、酶解90 min、酶添加量為底物蛋白1%時，分別選用中性蛋白酶、復合蛋白酶、堿性蛋白酶、風味蛋白酶以及木瓜蛋白酶對回收蛋白進行酶解，酶解溫度和pH值參考推薦的最適酶解條件，見表1。

表1 蛋白酶酶解最適溫度和pH值

1.3.7 堿性蛋白酶酶解條件的單因素試驗

1.3.7.1 pH的選擇

分別調整酶解pH值為7，8，9，10，11，其他酶解條件為底物蛋白濃度1 g/dL、酶添加量為底物蛋白的1%、酶解溫度50 ℃、酶解時間90 min。

1.3.7.2 酶添加量的選擇

分別調整酶添加量為底物蛋白的0.5%，1%，1.5%，2%，2.5%，其他酶解條件為底物蛋白濃度1 g/dL、酶解溫度50 ℃、酶解pH值9、酶解時間90 min。

1.3.7.3 酶解溫度的選擇

分別調整酶解溫度為30，40，50，60 ℃，其他酶解條件為底物蛋白濃度1 g/dL、酶添加量為底物蛋白的1%、酶解pH值9、酶解時間90 min。

1.3.7.4 酶解時間的選擇

分別調整水解時間為30，60，90，120，150 min，其他酶解條件為底物蛋白濃度1 g/dL、酶解溫度50 ℃、酶添加量為底物蛋白的1%、酶解pH值9。

1.3.7.5 底物蛋白濃度的選擇

分別調整底物蛋白濃度為0.5，1，1.5，2，2.5 g/dL，其他酶解條件為溫度50 ℃、酶解時間60 min、酶添加量為底物蛋白的1%、酶解pH值9。

1.3.8 響應面分析試驗

在酶解單因素試驗的基本上，運用 Box-Behnken 的中心組合[10]，以水解度為響應值，選用酶解溫度、酶解pH和酶添加量3個因素進行三因素三水平的響應面分析試驗，試驗因素水平及編碼見表2。

表2 堿性蛋白酶Box-Behnken試驗計劃

1.3.9 相對分子質量分布的測定

分別采用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳法和HPLC[11]測定回收蛋白酶解前后相對分子質量分布。

1.3.10 溶解性[12]

蛋白質的溶解性通常采用氮溶指數(NSI)進行評價。0.1 g樣品與20 mL去離子水混合，用5 mol/L HCl或NaOH溶液調節樣液pH值(pH 3～10)。漩渦震蕩5 min，5000 r/min離心10 min，采用考馬斯亮藍法測定樣品溶液氮含量，氮溶指數計算公式如下：

式中：m1為離心前溶液氮含量；m2為離心后溶液氮含量。

1.3.11 乳化性[13]

乳化性采用濁度法進行測定。取蛋白濃度為5 mg/mL的溶液40 mL，加入5 mL大豆色拉油，12000 r/min均質2 min，分別在0，10 min時快速從底部汲取樣液0.1 mL，用15 mL 0.1%的SDS溶液進行稀釋，稀釋混勻后于500 nm處測定吸光值，以SDS溶液作為空白對照，乳化性(EAI)和乳化穩定性(ESI)計算公式如下：

式中：dil為稀釋倍數；A為乳化液的吸光值；C為樣品濃度(g/mL)；φ為乳化液中油相的比例；A0為初始乳化液的吸光值；At為10 min后的吸光值。

1.3.12 起泡性及泡沫穩定性[14]

取樣品濃度為3%(W/V)的溶液100 mL，12000 r/min均質2 min，快速倒入250 mL的量筒中，起泡性(Fc)及泡沫穩定性(Fs)計算公式如下：

式中：v0為均質前體積；v1為均質后溶液與泡沫總體積；v10為均質10 min后溶液與泡沫總體積。

1.3.13 持油性[15]

將0.5 g蛋白樣品置于離心管中，加入5 g大豆色拉油混勻，常溫靜置30 min后4000 r/min離心30 min，持油性(OHC)計算公式如下：

式中：m0為蛋白樣品質量；m1為離心管質量；m2為離心后離心管與蛋白樣品總質量。

2 結果與討論

2.1 回收蛋白的基本成分分析

回收蛋白的基本成分含量見表3。

表3 回收蛋白的基本成分分析

由表3可知，回收蛋白中水分含量最高，其次為蛋白質含量，脂肪和灰分的含量較少。回收蛋白樣品的蛋白含量為11.28%，約占干基總量的67.34%。

2.2 酶種類的選擇

5種蛋白酶對回收蛋白的酶解效果見圖1。

圖1 不同酶酶解效果對比

由圖1可知，水解度和短肽得率由高到低的次序均為堿性蛋白酶>中性蛋白酶>復合蛋白酶>木瓜蛋白酶>風味蛋白酶。因此，本試驗選用堿性蛋白酶對回收蛋白進行酶解優化。

2.3 堿性蛋白酶酶解工藝的單因素試驗

2.3.1 pH的影響

pH對回收蛋白酶解的影響見圖2。

圖2 pH對DH和TCA-NSI的影響

由圖2可知，回收蛋白酶解物的短肽得率和水解度均隨酶解pH值的增大呈先升后降的趨勢。在pH值為9時，回收蛋白酶解物的短肽得率和水解度達到最大值。這主要是因為過酸、過堿會使酶的空間結構發生變化或者導致酶的活性部分喪失，從而降低酶的活性[16]。因此，本試驗選擇酶解pH為9。

2.3.2 酶添加量的影響

酶添加量對回收蛋白酶解的影響見圖3。

圖3 酶添加量對DH和TCA-NSI的影響

由圖3可知，在酶添加量為底物蛋白的0.5%～1%范圍時，回收蛋白酶解物的短肽得率和水解度快速上升；當酶添加量大于底物蛋白1% 時，短肽得率幾乎不再增長，水解度也趨于平緩。因此，本試驗選擇酶添加量為1%。

2.3.3 酶解溫度的影響

溫度對回收蛋白酶解的影響見圖4。

圖4 溫度對DH和TCA-NSI的影響

由圖4可知，回收蛋白酶解物的短肽得率和水解度均隨著酶解溫度的上升呈先升后降的趨勢，在50 ℃時，回收蛋白酶解物的短肽得率和水解度均達到最大值。這是因為溫度較低時，酶活性較低，不利于與底物結合；溫度較高時，酶部分失活，同時底物蛋白部分變性，影響酶與底物的相互作用[17]。因此，本試驗選擇酶解溫度為50 ℃。

2.3.4 酶解時間的影響

酶解時間對回收蛋白酶解的影響見圖5。

圖5 酶解時間對DH和TCA-SNI的影響

由圖5可知，回收蛋白酶解物的短肽得率和水解度均隨酶解時間的增加呈先快速上升后趨于平緩的趨勢。當酶解時間超過60 min時，水解度及短肽得率變化不明顯。因此，本試驗選擇酶解時間為60 min。

2.3.5 底物濃度的影響

底物濃度對回收蛋白酶解的影響見圖6。

圖6 底物濃度對DH和TCA-SNI的影響

由圖6可知，回收蛋白酶解物的短肽得率和水解度均隨底物蛋白濃度增加呈下降的趨勢，在底物蛋白濃度為0.5～1 g/dL時，兩者下降幅度較小；在底物蛋白濃度大于1 g/dL時，下降幅度均較大。這可能是因為底物濃度太大，會導致底物不在酶分子附近，使得酶解速率降低，同時妨礙酶解產物的分散。在工業生產中，底物濃度過低時，不利于企業快速生產，所以結合酶解效果和經濟效益，本試驗選擇酶解底物蛋白濃度為1 g/dL。

2.4 堿性蛋白酶酶解回收蛋白條件的響應面優化

2.4.1 響應面試驗及方差分析

研究單因素試驗結果發現：在同一條件下，回收蛋白的水解度和短肽得率變化趨勢基本一致。為了簡化試驗，選擇水解度為指標，使用 Box-Behnken 試驗設計的基本思路，以pH值、酶添加量、溫度為變量，實施三因素三水平的響應面試驗，見表4。

表4 Box-Behnken試驗設計及結果

使用Design Expert 7.0 軟件處理，得出各項回歸系數，形成水解度及三因素的數學回歸模型：水解度=-222.49025+3.48962X1+29.5815X2+25.32150X3+0.017X1X2+0.0735X1X3+0.07X2X3-0.035692X12-1.68675X22-10.477X32。

水解度回歸模型方差分析表見表5。

表5 水解度回歸模型方差分析表

注：P<0.05表示差異顯著；P<0.01表示差異極顯著。

由表5可知，水解度的回歸模型具有高度顯著性；且失擬項P=0.1191>0.05，不顯著，由于失擬項用來表示預測值與真實值不相符的概率[18]，因此此模型合理；RAdj2=0.9879，表明此模型能反映約98.79%實際值，所以此模型可以用來分析和預測堿性蛋白酶酶解回收蛋白中各要素對水解度的影響。分析均方可知，三因素對水解度的影響次序是酶添加量>酶解溫度>酶解pH值。

2.4.2 最佳工藝條件及驗證

經響應面分析得出酶解最佳工藝條件，即溫度52.51 ℃、pH值9.06、酶添加量1.42%、時間60 min、底物濃度1 g/dL，此時蛋白質水解度為21.19%。為了檢驗此模型的正確性，選用堿性蛋白酶酶解溫度為52.5 ℃、酶解pH值為9、酶添加量為1.40%、酶解時間為60 min、底物蛋白濃度為1 g/dL的前提下進行反應，得出堿性蛋白酶水解度實際值為20.86%，短肽得率為73.5%。模型預測值與真實值基本相同，表明模型可靠有用。

2.5 相對分子質量分布的測定

圖7 回收蛋白的SDS-PAGE電泳分析

利用SDS-PAGE對回收蛋白進行相對分子質量分析，由圖7可知，回收蛋白的分子量主要分布在30～250 kDa，且在分子量40～50 kDa出現比較明顯的條帶，說明回收蛋白的組分主要為大分子蛋白質。

回收蛋白酶解物相對分子質量見表6。

表6 回收蛋白酶解后的相對分子質量分布

續 表

由表6可知，回收蛋白經堿性蛋白酶酶解后，相對分子質量分布明顯變小，酶解物的相對分子質量主要分布在180～1000 Da之間，其中相對分子質量在180～500 Da之間所占比例為43.14%。

2.6 回收蛋白和多肽功能性質的比較

2.6.1 溶解性

pH值對回收蛋白溶解性的影響見圖8。

圖8 pH值對回收蛋白溶解性的影響

由圖8可知，在pH為4～6時，兩者溶解性均有所降低，但是回收蛋白酶解后，溶解性明顯提高。這是因為蛋白酶解后，蛋白肽健斷裂，分子量有所降低，暴露在外的氨基和羧基等親水性基團數量增加，從而提高了酶解產物的溶解性[19]。

2.6.2 乳化性及乳化穩定性

pH對回收蛋白酶解前后乳化性的影響見圖9。

圖9 pH對回收蛋白酶解前后乳化性的影響

由圖9可知，回收蛋白酶解前后的乳化性均隨pH值的升高出現先降后升的趨勢。在pH 5.0時，兩者乳化性最小。這是由于在pH 5.0時，蛋白溶解性較低，致使較少蛋白在油/水界面分散，所以乳化性最低；相反，溶解性增大，乳化性增強[20]。由圖9還可知，回收蛋白酶解后的乳化性有所增強，這是由于酶解后的蛋白溶解性增大，容易在油/水界面擴散[21]。

pH對回收蛋白酶解前后乳化穩定性的影響見圖10。

圖10 pH對回收蛋白酶解前后乳化穩定性的影響

由圖10可知，回收蛋白酶解后的乳化穩定性較酶解前在不同pH下均有所減少。這是因為蛋白酶解之后，相對分子質量減小，吸附在膜上的能力下降，從而在油滴周圍形成的蛋白質層變動，乳化穩定性下降[22]。

2.6.3 起泡性和泡沫穩定性

回收蛋白酶解前后在pH 3～10范圍內的起泡性見圖11。

圖11 pH對起泡性的影響

由圖11可知，二者均隨pH值的增大出現先下降后上升的趨勢，在pH 5.0時，兩者起泡性最低，這可能是由于蛋白的起泡與溶解度有關；在pH 5.0時，溶解度最差，不利于蛋白在水與空氣的界面進行擴散和捕獲空氣粒子，從而泡沫性最小；相反溶解度增大，起泡性增加[23]，因為酶解后的蛋白溶解性增大，易于捕獲空氣粒子，所以回收蛋白酶解后的起泡性有所增加。

回收蛋白酶解前后在pH 3～10范圍內的泡沫穩定性見圖12。

圖12 pH對泡沫穩定性的影響

由圖12可知，回收蛋白酶解前后的起泡性隨pH值的增大均呈先升后降的趨勢，在pH 5.0時，二者起泡穩定性最大，這是由于在pH 5.0時靠近蛋白等電點，泡沫在等電點范圍內破損較為緩慢。同時，回收蛋白酶解后的泡沫穩定性不如酶解前，這是由于回收蛋白酶解后分子量減少，而小分子量的蛋白維持泡沫穩定的能力較弱，所以起泡穩定性有所降低[24]。

2.6.4 持油性

回收蛋白酶解前后的持油性見圖13。

圖13 pH對回收蛋白酶解前后持油性的對比

由圖13可知，回收蛋白酶解后的持油性有所下降，這是因為酶解把蛋白質的一、二級結構摧毀了，破壞了蛋白的網絡結構，物理截留油粒的作用降低，酶解后吸油性有所下降[25]。

3 結論

選用5種蛋白酶酶解回收蛋白，以酶解物短肽得率及水解度為指標，觀察各自最適前提下的酶解能力，得出堿性蛋白酶為最優酶。

堿性蛋白酶酶解回收蛋白的最適條件為：溫度52.51 ℃、pH值9.06、酶添加量1.42%、時間60 min、底物蛋白濃度1 g/dL。

酶解使回收蛋白的溶解性增加較為明顯，同時起泡性和乳化性也有所改良；而泡沫穩定性、乳化穩定性及持油性有所下降，這些結果表明回收蛋白酶解物可以作為一種具備優良溶解度的食品添加劑，為回收蛋白開發使用開拓了新路徑。

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Study on Preparation and Functional Properties of Polypeptides from Wash Liquid of Grass Carp Surimi

DING Xiao-qiang, CHEN Li-li, BAI Chun-qing, YUAN Mei-lan, ZHAO Li*

(National Freshwater Fish Processing Technology Research and Development Branch Center, College of Life Science, Jiangxi Science and Technology Normal University, Nanchang 330013, China)

Proteins recovered from grass carp surimi wash liquid are as raw materials, alkaline protease is identified as the most suitable enzyme for enzymatic hydrolysis of protein among 5 commonly used enzymes based on simultaneous consideration of trichloroacetic acid nitrogen solubility index (TCA-NSI) and degree of hydrolysis (DH). According to single factor experiment and response surface methodology, the optimal enzyme reaction system is obtained as follows: hydrolysis temperature is 52.51 ℃, hydrolysis pH is 9.06, enzyme additive amount is 1.42%, hydrolysis time is 60 min and substrate concentration is 1 g/dL. Under the optimal hydrolysis conditions, the TCA-NSI and DH are 73.5% and 20.86%. The functional properties of protein before and after hydrolysis are compared; the results show that the solubility, emulsifying and foaming of protein have been increased after enzymatic hydrolysis than before. However, the emulsifying stability, oilabsorption capacity and foaming stability are decreased.

alkaline protease; protein; degree of hydrolysis; polypeptides; functional properties

2016-12-15 *通訊作者

江西省高等學校科技落地計劃項目(KJLD12009)；江西省現代農業產業技術體系建設專項資金資助(贛財教指2013-258)；國家農業科技成果轉化項目(國科辦農[2014]42號)

丁小強(1989-)，男，江西新余人，碩士，研究方向：食品化學； 趙利(1967-)，女，江西南昌人，教授，博士，研究方向：食品化學。

TS201.21

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.06.007

1000-9973(2017)06-0034-08