GC-MS內標法測定發酵食品中氨基甲酸乙酯的含量

李曉芹，金尉，袁小美

(1.蘇州出入境檢驗檢疫局，江蘇 蘇州 215104；2.蘇州世標檢測技術有限公司，江蘇 蘇州 215104)

GC-MS內標法測定發酵食品中氨基甲酸乙酯的含量

李曉芹1,2，金尉1,2，袁小美1,2

(1.蘇州出入境檢驗檢疫局，江蘇 蘇州 215104；2.蘇州世標檢測技術有限公司，江蘇 蘇州 215104)

建立了發酵食品中氨基甲酸乙酯含量的氣相色譜-質譜測定方法。以氨基甲酸乙酯-D5為內標，經硅藻土柱富集凈化，二氯甲烷洗脫，氣相色譜-質譜儀選擇離子模式測定。方法優化后，液體樣品檢出限為2 μg/kg，定量限為5 μg/kg；固體樣品檢出限為5 μg/kg，定量限為15 μg/kg，回收率為85%～115%，RSD<6.0。該方法簡單、有效、穩定，可應用于多種發酵食品中氨基甲酸乙酯的實際檢測分析。

氨基甲酸乙酯；硅藻土柱；內標法；氣相色譜-質譜法

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，EC)天然存在于多種發酵食品中，如醬油、醋、葡萄酒、黃酒、發酵乳、發酵豆制品，是一種水溶性致癌物質。美國、加拿大、日本等國都對其最高允許含量做了限制[1]。在中國，EC也已成為目前國內食品安全重要監測項目之一。但目前我國僅建立了酒和醬油中EC的檢測方法[2]，本文在前者研究的基礎上[3-9]，對EC的分析方法進行了驗證和優化，將檢測范圍進行了擴充，采用硅藻土柱富集凈化，氣相色譜-質譜儀測定，利用選擇離子監測模式和內標法進行定性及定量分析，建立了簡單、有效、穩定的多種食品中EC測定的檢測方法。

1 儀器、試劑與材料

1.1 試劑、耗材

正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈：Fisher，色譜純；鹽酸、氯化鈉、無水硫酸鈉：國藥試劑，分析純。實驗所用樣品來源于本實驗室送檢樣品。

氨基甲酸乙酯(EC)標準品： Dr. Ehrenstorfer GmbH，純度98.5%；氨基甲酸乙酯-D5(EC-D5)標準品，內標： Dr. Ehrenstorfer GmbH，純度99%。

硅藻土柱：Agilent Chem Elut 5 mL，P/N:12198006。

1.2 設備

GC-MS 7890N5975C、電子轟擊源(EI)氣相色譜-質譜聯用儀 Agilent；H2050R 高速離心機 湖南湘儀；N-EVAP 氮吹儀 Organomation；渦旋混合儀 IKA；AE100 電子天平 Mettler；Milli-Q超純水器 美國。

1.3 標準溶液配制

分別稱取標準品和內標0.01 g(精確到0.1 mg)至10 mL容量瓶中，乙腈溶解、定容，配制成1000 mg/L的標準儲備溶液，4 ℃避光保存。再分別移取100 μL至10 mL容量瓶中，乙腈定容，配制成10 mg/L的標準工作液，4 ℃避光保存。標準曲線用乙酸乙酯配制，氨基甲酸乙酯濃度為10,50,100,200,500 μg/L，或根據需要配制，內標濃度為100 μg/L。

2 分析步驟

2.1 樣品前處理

2.1.1 液體樣品

移取葡萄酒、醋、醬油等樣品5 g，加入適量內標，如有沉淀物經10000 r/min離心10 min，取上層清液備用。

蒸餾酒：移取樣品5 g，加入適量內標，氮吹至約3 mL，備用。

發酵液體乳：移取樣品20 g，加入適量內標，2 mol/L鹽酸調節pH至2左右沉淀蛋白，離心取清液，沉淀加入8 mL水，振搖提取，離心后合并清液，定容至20 mL，取5 mL備用。

2.1.2 固體樣品

稱取樣品2 g于刻度離心管中，加入適量內標，加入飽和氯化鈉溶液8 mL，超聲提取后甲醇定容至10 mL，渦旋，10000 r/min離心10 min，取上層清液5 mL備用。

2.2 凈化

備用液加入硅藻土柱，靜置吸附10 min。20 mL正己烷淋洗，棄去淋洗液，二氯甲烷洗脫，收集洗脫液20 mL。洗脫液經無水硫酸鈉除水后氮吹至近干，加入1 mL乙酸乙酯，過膜后進行氣相色譜-質譜檢測。

2.3 色譜條件

2.3.1 氣相條件

色譜柱：Agilent VF-WAXms(0.25 mm×0.25 m，30 μm)；色譜柱溫度：60 ℃保持1 min，以5 ℃/min升至150 ℃，以25 ℃/min升到230 ℃，保持0 min，230 ℃后運行5 min；載氣：氮氣，1.0 mL/min；進樣量：1 μL；進樣方式：不分流進樣。

2.3.2 質譜條件

進樣口溫度：220 ℃；接口溫度：240 ℃；離子源溫度：230 ℃；溶劑延遲：14 min；檢測方式：選擇離子檢測方式。

3 分析與討論

3.1 色譜條件確定

本標準采用內標法定量測定，基質匹配溶劑配制標準曲線。待測液和標準品的選擇離子峰保留時間一致(±0.5%)，對應質譜碎片離子的質荷比與標準品一致。EC和EC-D5定性離子和定量離子見表1，色譜結果見圖1。

表1 EC和EC-D5定量和定性選擇離子表

圖1 EC和EC-D5標準物質的選擇離子色譜圖

注：EC濃度為20 μg/L，保留時間為16.067 min；EC-D5濃度為100 μg/L，保留時間為15.932 min。

3.2 提取方法的選擇

EC極性強，易溶于水和乙醇。對于葡萄酒、醋等樣品可以直接取清液進行凈化。對于酒精含量高于15%的酒類產品，需加水稀釋至酒精含量低于15%，或氮吹將易揮發成分除去后再做凈化。為提高方法靈敏度，選取氮吹方式降低酒精含量影響。

發酵液體乳制品蛋白含量高，離心后進行固相萃取凈化容易出現堵塞，影響方法穩定性。采用稀酸調節pH沉淀蛋白質，離心后取清液再進行固相萃取凈化。

對于固體樣品，比較了純水、飽和氯化鈉溶液[10]、乙醇、甲醇的提取效果，結果表明：采用飽和氯化鈉溶液和甲醇分步提取效果最好。飽和氯化鈉溶液提取可以減弱乳化作用，得到良好的分層效果，加入少量甲醇能夠去除部分雜質且不會影響后續的固相萃取凈化。

3.3 固相萃取條件的選擇

待測液和洗脫液都是依靠重力作用從硅藻土柱中流出。比較了多個廠家的硅藻土柱，結果表明：硅藻土孔徑及裝填密度影響上樣速度和回收效果。最終選取安捷倫Chem Elut 5 mL硅藻土柱，上樣后待測液自然滲入硅藻土柱且能得到很好保留，淋洗和洗脫后可以得到較好的回收效果。

分別比較了乙酸乙酯、乙醚、5%乙酸乙酯-乙醚溶液、二氯甲烷、10%甲醇-二氯甲烷溶液的洗脫效果，20 mL二氯甲烷洗脫效果最好。實際樣品和加標后檢測結果見圖2和圖3。

圖2 陳醋樣品加標前選擇離子色譜圖

注：a:EC-D5濃度為20 μg/kg， 保留時間為15.948 min；b:EC濃度為6.2 μg/kg， 保留時間為16.078 min。

圖3 陳醋樣品加標后選擇離子色譜圖(加標量為10 μg/kg)

注：a:EC-D5濃度為20 μg/kg， 保留時間為15.943 min；b:EC濃度為16.8 μg/kg， 保留時間為16.078 min。

3.4 方法檢出限和回收率

根據樣液中被測物的含量情況，選定濃度與樣液相近的標準工作溶液。標準工作溶液和樣液中氨基甲酸乙酯的響應值均應在儀器檢測線性范圍內。在陰性基質中進行加標實驗，按信噪比3∶1確定檢出限，信噪比10∶1確定定量限。液體樣品檢出限為2 μg/kg，定量限為5 μg/kg；固體樣品檢出限為5 μg/kg，定量限為15 μg/kg。

為驗證方法的穩定性和準確性，對葡萄酒、陳醋、白酒、酸奶、腐乳分別進行定量限、兩倍定量限和十倍定量限加標回收實驗，計算回收率和相對標準偏差(RSD)。結果表明：液體樣品及固體樣品EC的回收率在85%～115%，RSD<6.0。陳醋的加標回收實驗結果見表2。

表2 陳醋樣品中EC加標回收率及RSD(n=6)

4 結論

建立了GC-MS內標法測定多種發酵食品中氨基甲酸乙酯殘留量的方法，該方法簡單、有效、穩定，對現有檢測方法進行了優化并對檢測范圍進行了擴充，能夠滿足日常檢測需求。

[1]朱志鑫,吳惠勤,黃曉蘭,等.發酵食品中氨基甲酸乙酯的分析方法[J].食品科技,2009,34(6):287-290.

[2]GB 5009.223-2014,食品中氨基甲酸乙酯的測定[S].

[3]石維妮,劉曉毅,趙玉琪,等.發酵性食品中的氨基甲酸乙酯含量調研[J].中國釀造,2009(11):124-126.

[4]李鳳華,曹艷平,王錫寧.GC-MS法測定酒中的氨基甲酸乙酯[J].中國衛生檢驗雜志,2009,19(6):1240-1241.

[5]譚波濤,郝媛媛,趙杰,等.GC-MS法測定發酵食品中氨基甲酸乙酯的含量[J].分析實驗室,2011,30(12):31-33.

[6]B J Canas，J F Jr，G W Diachenko,et al.Determination of ethyl carbamate in alcoholic beverages and soy sauce by gas chromatography with mass selective detection:collaborative study[J].Journal of Aoac International,1994,77(6):1530-1536.

[7]Zhang Y, Zhang J. Optimization of headspace solid-phase microextraction for analysis of ethyl carbamate in alcoholic beverages using a face-centered cube central composite design[J].Anal Chim Acta,2008,627(2):212-218.

[8]Whiton R S, Zoecklein B W. Determination of ethyl carbamate in wine by solid-phase microextraction and gas chromatography/mass spectrometry[J].Am J Enli Viticult,2002,53(1):60-63.

[9]朱棟平,陶寧萍,李學惠.固相萃取-氣相色譜法測定葡萄酒中氨基甲酸乙酯[J].上海水產大學學報,2008,17(5):616-619.

[10]李剛,梁新紅,葛曉虹.GC/MS內標法測定葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量[J].釀酒科技,2010(5):98-101.

Determination of Ethyl Carbamate Content in Fermented Food by GC-MS Internal Standard Method

LI Xiao-qin1,2, JIN Wei1,2, YUAN Xiao-mei1,2

(1.Suzhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Suzhou 215104,China;2.Suzhou World Standard Testing Technology Co., Ltd.,Suzhou 215104,China)

A method for determination of ethyl carbamate content in fermented food by GC-MS is developed. Ethyl carbamate-D5 is used as internal standard. By means of diatomaceous earth column, ethyl carbamate is enriched and purified. The target substance is eluted by dichloromethane. The identification is performed by GC-MS in selected ion monitoring (SIM) mode. The limited of detection is 2 μg/kg and the limit of quantitation is 5 μg/kg for liquid samples, the limit of detection is 5 μg/kg and the limit of quantitation is 15 μg/kg for solid samples respectively. The recovery rate is 85%～115%，RSD<6.0.The method is easy, effective, stable and can be applied for the detection of ethyl carbamate in fermented food.

ethyl carbamate；diatomaceous earth column；internal standard method；GC-MS

2016-12-16

李曉芹(1987-)，女，江蘇徐州人，工程師，碩士，主要從事食品安全分析。

TS201.5

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.06.029

1000-9973(2017)06-0135-04