短乳桿菌ZLB004發酵培養基的優化研究

劉輝，季海峰，王四新，張董燕，張偉，王晶，單達聰，王雅民

（北京市農林科學院畜牧獸醫研究所，北京100097）

短乳桿菌ZLB004發酵培養基的優化研究

劉輝，季海峰*，王四新，張董燕，張偉，王晶，單達聰，王雅民

（北京市農林科學院畜牧獸醫研究所，北京100097）

為得到短乳桿菌ZLB004最佳發酵培養基，本試驗研究了不同碳源、氮源、緩沖鹽、微量元素對短乳桿菌活菌數的影響，并利用響應面分析法對篩選出的主培養基成分進行了優化，得到短乳桿菌ZLB004的發酵培養基為：葡萄糖31.4 g/L、酵母粉3.5 g/L、牛肉膏8.5 g/L、牛肉蛋白胨10 g/L、乙酸鈉7.5 g/L、檸檬酸氫二銨3 g/L、磷酸氫二鉀3 g/L、硫酸錳0.2 g/L、硫酸鋅0.6 g/L、吐溫-80 1 ml/L、pH 6.5。短乳桿菌ZLB004在此培養基中37℃培養24 h，活菌數可達3.15×109cfu/mL，是優化前活菌數的4.03倍。

短乳桿菌ZLB004；發酵培養基；響應面；優化

乳酸菌是一類可發酵碳水化合物產生大量乳酸的細菌的通稱，因其具有營養、抑菌、免疫調節等多種生物學功能（李瑞等，2013；Xie等，2011），在畜牧生產中得到廣泛的研究和應用。乳酸菌對營養的要求特殊而復雜，正常生長不僅需要碳源、氮源、緩沖鹽、微量元素等營養物質，而且營養物質的組成及配比對菌體生長影響重大（劉輝等，2016；Dumbrepatil等，2008），因此需要對營養物質組成和配比進行優化，篩選出適合乳酸菌生長的培養基。

短乳桿菌ZLB004（Lactobacillus brevis ZLB004）是分離自健康斷奶仔豬腸黏膜中的一株優良乳酸菌，具有較強的耐酸、耐膽鹽性，動物試驗表明，該菌在改善腸道菌群、增加營養物質利用率、增強機體免疫力、提高生長性能等方面具有良好的效果（Liu等，2015；劉輝等，2013）。為了提高短乳桿菌ZLB004發酵液中的活菌數，本試驗在單因素試驗的基礎上，通過響應面法優化發酵培養基，以期為該菌株的發酵生產提供基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株L.brevis ZLB004分離自健康斷奶仔豬腸黏膜，已通過中國普通微生物菌種保藏管理中心鑒定，由本研究室保藏。

1.2 培養基MRS培養基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母粉5 g/L，乙酸鈉5 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，檸檬酸氫二銨2 g/L，硫酸鎂0.58 g/L，硫酸錳0.19 g/L，Tween-80 1 mL/L，pH值6.5。121℃滅菌15 min。

1.3 活化與接種發酵L.brevis ZLB004菌株保存于-80℃冰箱，使用前按1%的接種量接種于MRS液體培養基中，37℃培養24 h，活化兩代。活化后的菌種以1%接種量接種于相應的培養基中，37℃培養24 h后測定菌體生長情況。

1.4 活菌計數采用菌落平板計數法計算發酵液中的活菌含量：將發酵液用滅菌生理鹽水進行十倍梯度稀釋，選擇合適的3個梯度進行平板涂布，每個梯度設3個平行，37℃培養48 h計菌落總數。

1.5 單因素試驗篩選培養基營養成分在MRS培養基的基礎上，固定其他成分，采用不同的碳源和氮源分別取代MRS中的碳源和氮源配制培養基，接種發酵，根據菌體生長情況對其最優碳源和氮源進行判斷和篩選；在碳氮源優化的基礎上，分別添加不同的緩沖鹽體系和微量元素，接種發酵，根據菌體生長情況，確定緩沖鹽體系和微量元素的種類。

1.6 響應面法優化主培養基

1.6.1 Plackett-Burman（P-B）試驗設計篩選顯著影響因子采用P-B兩水平法，選用試驗次數N=12試驗設計，對篩選出的碳源、氮源、緩沖鹽、微量元素等9種因素進行考察，每個因素各取2個水平，以短乳桿菌發酵液的活菌數為響應值，篩選出對短乳桿菌活菌數影響顯著的因素（Soliman等，2005）。

1.6.2 最陡爬坡試驗設計確定重要影響因素的水平對P-B試驗設計篩選得到的顯著影響因素進行最陡爬坡試驗，確定最陡爬坡試驗的方向和梯度，進而確定試驗因素的中心點。

1.6.3 響應面分析法確定最大響應值用Box-Behnken法，根據最陡爬坡試驗確定的試驗因素中心點設計響應面因素及水平，以活菌數為響應值，采用minitab 16軟件對數據進行二次多項回歸擬合，得到一個響應變量與自變量之間的模型。根據建立的模型計算得到L.brevis ZLB004的最佳增殖培養基配方。

1.6.4 驗證試驗將活化好的種子液按1%的比例分別接種至普通MRS培養基和1.6.3響應面設計得到的增殖培養基中，37℃培養48 h計菌落總數。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗篩選培養基營養成分

2.1.1 不同碳源對活菌數的影響碳源物質是構成培養基的主要成分之一，能夠提供細胞物質中的碳素來源和微生物生長發育過程中所需要的能量。不同碳源對L.brevis ZLB004活菌數的影響見圖1。由圖1可知，以葡萄糖為培養基唯一碳源時，短乳桿菌的活菌數最高，為7.6×108cfu/mL，遠高于其他11種碳源，因此選擇葡萄糖作為最佳碳源進行后續試驗。

圖1 不同碳源對L.brevis ZLB004活菌數的影響

2.1.2 不同氮源對活菌數的影響選擇10種常用的有機氮源和無機氮源，其對L.brevis ZLB004活菌數的影響見圖2。由圖2可知，與無機氮源相比，有機氮源更適合短乳桿菌的生長，并且當氮源為牛肉蛋白胨、牛肉膏和酵母粉時，短乳桿菌的活菌數優于其他幾種。乳酸菌對氮源的需求比較高，而復合氮源比單一氮源更有利于乳酸菌的生長（Vinodh等，2011），綜合考慮，選擇牛肉蛋白胨、牛肉膏和酵母粉作為后續研究的氮源。

圖2 不同氮源對L.brevis ZLB004活菌數的影響

2.1.3 不同緩沖鹽對活菌數的影響在前面碳氮源優化的基礎上，添加5種不同的緩沖鹽體系，根據短乳桿菌菌體生長情況，確定最優的緩沖鹽體系。由圖3可知，不同的緩沖鹽對菌體的增殖效果各不相同，其中以檸檬酸氫二銨/乙酸鈉/磷酸氫二鉀緩沖體系對菌體的促生長效果最好，因此選擇此緩沖鹽體系作為優化培養基的緩沖鹽。

2.1.4 不同微量元素對活菌數的影響分別以硫酸亞鐵（FeSO4·7H2O）、硫酸鎂（MgSO4·7H2O）、硫酸銅（CuSO4）、硫酸鋅（ZnSO4·7H2O）和硫酸錳（MnSO4·5H2O）等5種微量元素，加入不含硫酸鎂和硫酸錳的優化培養基中，測定各培養基的活菌數。由圖4可知，硫酸錳和硫酸鋅對短乳桿菌的促生長作用最為突出，而硫酸鎂、硫酸亞鐵和硫酸銅的作用較弱。微量元素可作為酶的激活劑或生物活性物質的組成成分，對微生物的生長繁殖具有十分重要的作用，綜合考慮，選擇硫酸錳和硫酸鋅作為優化培養基的微量元素。

圖3 不同緩沖鹽對L.brevis ZLB004活菌數的影響

圖4 不同微量元素對L.brevis ZLB004活菌數的影響

2.2 響應面法優化主培養基

2.2.1 Plackett-Burman試驗設計及結果試驗設計及結果見表1，各因素水平及主效應分析見表2。由表2可以看出，在這9個因素的主效應中，葡萄糖、乙酸鈉、檸檬酸氫二銨、磷酸氫二鉀和硫酸鋅對響應值（活菌數）表現為正效應，牛肉蛋白胨、牛肉膏、酵母粉和硫酸錳表現為負效應。其中酵母粉、牛肉膏和葡萄糖對響應值有顯著影響（可信度大于95%，即主效應P＜0.05），因此可作為顯著因素進行下一步試驗。

2.2.2 最陡爬坡試驗設計及結果根據P-B試驗篩選出的顯著因素的效應大小，確定最陡爬坡試驗的方向和步長，試驗設計及結果見表3。由表3可以看出，隨著酵母粉、牛肉膏質量濃度降低、葡萄糖質量濃度的升高，活菌數呈現先上升后下降的變化趨勢，活菌最高的響應值區域在第4組試驗，因此以第4組因素的水平作為響應面試驗設計的中心點，即酵母粉3.5 g/L、牛肉膏8.5 g/L、葡萄糖31.5 g/L。

表1 Plackett-Burman試驗設計及響應值

表2 Plackett-Burman試驗設計的因素水平及效應分析

表3 最陡爬坡試驗設計及結果

2.2.3 響應面分析法確定最大響應值根據P-B試驗、最陡爬坡試驗，以及Box-Behnken的中心組合設計原理，設計3因素3水平的響應面試驗，以酵母粉、牛肉膏和葡萄糖3個因素為自變量，以短乳桿菌的活菌數為響應值，根據最陡爬坡試驗的結果確定試驗中心和水平。試驗因素與水平的選取見表4，Box-Behnken試驗設計及結果見表5。

表4 Box-Behnken試驗因素與水平

表5 Box-Behnken試驗設計及結果

根據表5結果，用Minitab16軟件對數據進行二次回歸分析，得到的回歸方程為：Y=3.21667+ 0.195X1+0.0675X2+0.0325X3-0.36208X12-0.23208X22-0.22208X32+0.0025X1X2-0.0225X1X3-0.0775X2X3。

式中：Y為短乳桿菌ZLB004菌體濃度的預測響應值；X1、X2、X3分別為酵母粉、牛肉膏和葡萄糖的編碼值。

由表6可以看出，X1、X12、X22及X32對短乳桿菌活菌數有極顯著的影響（P＜0.01）。由表7可知，回歸方程P值為0.004，小于0.01，為非常顯著。模型失擬項P值為0.224，大于0.05，不顯著，說明所得數據擬合效果較好。相關系數R2= 0.9647，R2（調整）=0.9012，大于0.9，說明模型相關度很好。所以，能采用此模型來分析和預測短乳桿菌ZLB004的活菌數。

表6 回歸方程中回歸系數的估計值

表7 回歸方程的方差分析

根據上述回歸方程繪出響應面分析圖及等高線圖，以確認酵母粉、牛肉膏和葡萄糖3個因素對短乳桿菌ZLB004活菌數的影響，響應面圖和等高線圖見圖5。由圖及軟件分析可知，所得擬合回歸方程存在穩定點，即極大值點。根據Minitab軟件得到的回歸方程可計算得到，短乳桿菌活菌數的最大預測值為3.2×109cfu/mL，此時酵母粉質量濃度為3.5 g/L，牛肉膏質量濃度為8.5 g/L，葡萄糖質量濃度為31.4 g/L。

2.2.4 驗證試驗為了驗證模型預測的準確性，采用優化培養基重復試驗3次，發酵液中短乳桿菌ZLB004的平均活菌數為3.15×109cfu/mL，與響應面預測的最大活菌數3.2×109cfu/mL接近，誤差為1.56%，這表明該模型能夠很好地預測試驗結果。與優化前的活菌數（7.85×108cfu/mL）相比，優化后的活菌數提高了4.03倍，達到了優化培養基的目的。

圖5 各因素交互作用響應面分析圖與等高線圖

3 結論

以短乳桿菌ZLB004為試驗菌種進行發酵培養基的優化，經過單因素試驗以及響應面試驗設計分析，最終確定了最佳的發酵培養基配方為：酵母粉3.5 g/L、牛肉膏8.5 g/L、葡萄糖31.4 g/L、牛肉蛋白胨10 g/L、無水乙酸鈉7.5 g/L、檸檬酸氫二銨3 g/L、磷酸氫二鉀3 g/L、硫酸錳0.2 g/L、硫酸鋅0.6 g/L、吐溫-80 1 mL/L。短乳桿菌ZLB004在此培養基中以1%接種量，37℃培養24 h，活菌數可達到3.15×109cfu/mL，是優化前活菌數的4.03倍，可以為短乳桿菌ZLB004的規模化生產提供基礎。

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To optimize the fermentation medium of Lactobacillus brevis ZLB004，the effects of different carbon source，nitrogen source，buffer salts and microelement on the growth of Lactobacillus brevis were studied.The enrichment medium for Lactobacillus brevis was optimized by response surface methodology，and its composition was：glucose 31.4 g/L，yeast extract 3.5 g/L，beef extract 8.5 g/L，beef peptone 10 g/L，sodium acetate 7.5 g/L，diammonium hydrogen citrate 3 g/L，K2HPO43 g/L，MnSO4·5H2O 0.2 g/L，ZnSO4·7H2O 0.6 g/L，Tween 80 1 ml/L，pH 6.5.After cultivated in enrichment medium for 24 h at 37℃，the living cells of Lactobacillus brevis ZLB004 were 3.15×109cfu/mL，which was about 4.03 times higher than previous optimization.

Lactobacillus brevis ZLB004；fermentation medium；response surface；optimization

S816.3

A

1004-3314（2017）11-0028-05

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20171106

北京市科技計劃（Z141100002614002）；生豬產業技術體系北京市創新團隊項目（BA1C02-2016）；北京市農林科學院青年科研基金（QNJJ201408）

*通訊作者