LPS、TNF-α、IL-1β刺激RAW 264.7細胞分泌NO的比較

殷津津，辛文妤

1.山東省青島市城陽區惜福鎮街道衛生院藥劑科，山東青島266106；2.山東省濱州醫學院，山東煙臺 264003

LPS、TNF-α、IL-1β刺激RAW 264.7細胞分泌NO的比較

殷津津1，辛文妤2

1.山東省青島市城陽區惜福鎮街道衛生院藥劑科，山東青島266106；2.山東省濱州醫學院，山東煙臺 264003

目的研究LPS、TNF-α、IL-1β刺激RAW264.7細胞分泌NO的劑量、時間依賴性關系，為建立炎癥細胞模型提供實驗依據。方法以LPS（0.01、0.10、1.00、10.00μg/mL）、TNF-α（0.10、1.00、10.00、100.00 ng/mL）或IL-1β（0.10、1.00、10.00、100.00 ng/mL）刺激RAW264.7細胞，24 h后收集細胞上清液Greiss法測定NO的含量。以LPS（1μg/mL）、TNF-α（10 ng/mL）或IL-1β（10 ng/mL）分別刺激RAW264.7細胞6、12、24、48 h，收集細胞上清液Greiss法測定NO的含量。結果不同劑量LPS均可顯著誘導RAW264.7細胞分泌大量NO，無明顯的劑量依賴性，不同劑量TNF-α或IL-1β均可顯著誘導RAW264.7細胞分泌NO，且有一定的劑量依賴性，LPS（1μg/mL）或TNF-α（10 ng/mL）刺激RAW264.7細胞12~48 h時NO的分泌量顯著升高，IL-1β（10 ng/mL）刺激6~48 h均可顯著誘NO的分泌，均具有一定的劑量依賴性。結論0.01~10.00μg/mL LPS、0.10~100.00 ng/mL的TNF-α或IL-1β刺激RAW264.7細胞均可成功復制炎癥細胞模型。

炎癥、RAW 264.7細胞、LPS、TNF-α、IL-1β

炎癥是多種疾病的一個重要標志特征，是機體對內外有害刺激因素做出的自我保護性反應。雖然炎癥在一定程度上對機體是有利的，但過度或過久的炎癥反應往往會加重許多疾病的發展，如自身免疫性疾病、膿毒癥、癌癥、動脈粥樣硬化、糖尿病等[1-2]。巨噬細胞是一類重要的免疫細胞，在機體炎癥反應中發揮重要作用[3]。小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞來源于小鼠腹腔，是可以永生化的巨噬細胞株，能夠穩定進行傳代培養[4]。

LPS是革蘭陰性菌細胞壁的的重要組成成分，是引起炎癥的一類重要誘導劑，LPS與其受體結合后通過一系列信號通路如NF-κB信號通路，誘導多種炎癥介質的釋放[5]。以LPS誘導RAW264.7細胞在一定程度上可以模擬機體的炎癥反應，是目前常用的體外炎癥細胞模型[6-7]。此外，TNF-α、IL-1β是炎癥反應中最常見的炎癥因子，TNF-α是機體應激反應中的核心炎癥介質，可誘發血管內皮細胞的表型變為炎癥型，導致機體代謝和血液動力學改變，促進炎癥介質生成，是導致炎性因子“瀑布效應”的“元兇”[8]。IL-1β是一種能夠激活多種免疫和炎癥細胞的前炎性細胞因子，在感染、炎癥、免疫應激等細胞反應中發揮了重要的作用[9]。LPS、TNF-α、IL-1β均可以誘導RAW264.7細胞發生炎癥反應，用于抗炎藥物的篩選及其作用機制的評價。該文主要觀察不同劑量LPS、TNF-α、IL-1β誘導RAW264.7細胞不同時間后NO分泌量的比較，為建立更理想的炎癥細胞模型提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠巨噬細胞RAW 264.7由該實驗室前期凍存；LPS、TNF-α、IL-1β購自美國sigma公司。胰蛋白酶、胎牛血清購自美國sigma公司；DMEM培養基購自美國Invitrogen公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養小鼠巨噬細胞RAW264.7在37℃、5% CO2、飽合濕度條件下用含10%胎牛血清的DMEM培養液傳代培養。

1.2.2 不同劑量LPS、TNF-α、IL-1β誘導RAW264.7細胞分泌NO的比較取剛剛長成完整單層的RAW264.7細胞一瓶，胰蛋白酶消化后吹打細胞，調整細胞數目至2×105cell/mL。于96孔細胞培養板中每孔加入100μL細胞懸液，置于CO2培養箱中繼續培養12 h。取出培養板后吸掉原培養液，每孔加入190μL無血清培養液。6 h后加入10μLLPS（終濃度為0.01、0.10、1.00、10.00μg/mL），或10μLTNF-α（終濃度為0.10、1.00、10.00、100.00 ng/mL）或10μL IL-1β（終濃度為0.10、1.00、10.00、100.00 ng/mL），另設正常對照組。然后于微孔板振蕩器上振蕩混勻，置于CO2培養箱中分別繼續培養24 h。收集培養上清液，Greiss測定NO的含量。

取細胞上清液100μL加入到96孔板中，加入100μL Griess試劑（0.2%萘基乙二胺和含2%磺胺的0.5%磷酸按1:1比例混合），于微孔板振蕩器上振蕩使之混勻，室溫避光靜置10min，用酶標儀于540 nm波長處測定吸光度值。計算NO分泌率=（樣品孔OD－空白孔OD）/（對照孔OD-空白孔OD）×100%。

1.2.3 LPS、TNF-α、IL-1β誘導RAW264.7細胞不同時間分泌NO的比較取RAW264.7細胞一瓶，胰蛋白酶消化后收集細胞，用移液管吹打均勻，調整細胞數目至2×105cell/mL。于96孔細胞培養板中每孔加入100μL細胞懸液，置于CO2培養箱中繼續培養12 h。取出培養板后吸掉原培養液，每孔加入190μL無血清培養液。6 h后加入10μL LPS（終濃度為1μg/mL）或10μL TNF-α（終濃度為10 ng/mL）或10μL IL-1β（終濃度為10 ng/mL），另設正常對照組。加入LPS后，于微孔板振蕩器上振蕩混勻，置于CO2培養箱中分別繼續培養6、12、24、48 h。收集培養上清液，Griss測定NO的含量，計算NO分泌率=（樣品孔OD－空白孔OD）/（對照孔OD-空白孔OD）×100%。

2 實驗結果

2.1 不同劑量LPS、TNF-α、IL-1β誘導RAW 264.7細胞分泌NO的比較

正常對照組RAW264.7細胞分泌NO的量極低，加入不同劑量的LPS、TNF-α或IL-1β刺激后NO分泌量均顯著提高。加入0.01、0.10、1.00、10.00μg/mL刺激后NO分泌量均顯著提高，隨著LPS劑量的增加，NO的分泌略微增加。加入0.10、1.00、10.00、100.00 ng/mLTNF-α或IL-1β刺激后NO分泌量均顯著提高；隨著TNF-α或IL-1β劑量的增加，NO的分泌量逐漸增加，且有一定的劑量依賴性（圖1）。

2.2 LPS、TNF-α、IL-1β刺激RAW 264.7細胞不同時間致NO分泌的變化

正常對照組RAW264.7細胞分泌NO的量極低，加入LPS、TNF-α或IL-1β刺激后NO分泌量顯著提高。與正常對照組相比，加入LPS或TNF-α6 h后NO分泌量略微提高，隨著LPS或TNF-α刺激時間的延長，NO分泌量逐漸增加，12、24、48 h組與正常對照組相比具有顯著性差異，其中在48 h時NO分泌量達到高峰期。加入IL-1β在6、12、24、48 h與正常對照組相比均具有顯著性差異，其中在48 h時NO分泌量達到高峰期（圖2）。

3 討論

炎癥是十分常見而重要的基本病理過程，可發生于機體的任何部位和任何組織，參與人類的大多數疾病。目前臨床上常見抗炎藥物包括：非甾體抗炎藥、糖皮質激素類、生物制劑、中草藥制劑等。但這些藥物存在療效不確定、毒副作用明顯、價格昂貴等問題。因此，積極尋找有效、不良反應低、能夠長期使用的抗炎藥物一直是醫藥工作者關注的熱點。建立體外炎癥細胞模型具有簡單、高效、便捷等諸多優點。因此，以炎癥細胞為模型進行抗炎藥物的篩選及評價成為科研人員關注的焦點。該文主要通過觀察不同劑量LPS、TNF-α、IL-1β誘導RAW264.7細胞不同時間后NO的分泌量，尋找合適的刺激物劑量及刺激時間，為更好地進行抗炎藥物的篩選及評價奠定基礎。

圖1 不同劑量的LPS（A）、TNF-α（B）、IL-1β（C）

圖2 不同時間段內加入LPS(A)、TNF-α(B)、IL-1β(C)

NO的過量生成與炎癥反應密切相關，是一種重要的炎癥介質。正常情況下內皮源性NO具有抑制炎癥反應的作用，而在病理情況下誘導型NO合成酶合成大量的NO則有細胞不良反應，加重炎癥反應，參與多種疾病的發展[10]。在該實驗中，主要通過檢測NO的分泌量來評價LPS、TNF-α、IL-1β誘導RAW 264.7成為炎癥細胞模型的標準。NO的測定采用Greiss法，該方法操作簡單，只需一步反應，時間為10 min，并且價格低廉、靈敏度高、可用于大批量的藥物篩選或抗炎活性評價。因此，該實驗選擇通過測定NO含量來初步評價炎癥細胞模型。實驗結果顯示，LPS在0.01、0.10、1.00、10.00μg/mL各劑量均可以刺激RAW264.7細胞分泌大量的NO，劑量依賴性不明顯。TNF-α、IL-1β在0.10、1.00、10.00、100.00 ng/mL各劑量均可以刺激RAW264.7細胞分泌大量的NO，且具有一定的劑量依賴性。

此外，該研究選取1μg/mL LPS、10 ng/mL TNF-α或IL-1β刺激RAW264.7細胞的。結果顯示，LPS或TNF-α刺激6 h時NO的分泌量與正常對照組無顯著性差異，復制模型不成功；僅在12~48 h均可以成功復制模型；而IL-1β在6~48 h均可以刺激NO的大量分泌，有一定的時間依賴性，可成功復制模型。據文獻報道，LPS多采用0.2~1μg/mL刺激RAW264.7細胞18-24 h進行炎癥細胞模型的復制[11-13]。WeiweiLi等人采用10 ng/mLTNF-α誘導RAW264.7細胞24 h為炎癥細胞模型，進行藥物的抗炎活性評價[14]。

綜上所述，0.01~1.00μg/mL LPS刺激RAW264.7細胞24 h，以及0.1~100.00 ng/mL的TNF-α或IL-1β刺激RAW264.7細胞24 h均可以成功復制炎癥細胞模型。在實驗中如何選取LPS、TNF-α、IL-1β的劑量以及刺激時間，炎癥細胞模型過重或過輕都不利于抗炎藥物的評價或篩選。應綜合考慮，結合細胞狀態、細胞密度，以及刺激物的純度、廠家、批次等自身實驗條件進行選取。

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Comparison of LPS,TNF-α,IL-1βin Stimulating NO Secreted by RAW 264.7 Cell

YIN Jin-jin1,XINWen-yu2
1.Department of Pharmacy,Street Health Center of Xifu Town,Qingdao,Shandong Province,266106 China;2.Binzhou Medical College,Yantai,Shandong Province,264003 China

Objective To research the correlation between the LPS,TNF-α,IL-1βin stimulating NO secreted by RAW264.7 cell and time dependence and provide experimental basis for the establishment of inflammatory cell model. M ethods The LPS(0.01,0.10,1.00,10.00μg/mL),TNF-α(0.10,1.00,10.00,100.00 ng/mL)and IL-1β(0.10,1.00,10.00,100.00 ng/mL) wereused to stimulate the RAW 264.7 cell,after24h,the NO contentwasmeasured by theGreissmethod,and the LPS(1μg/mL), TNF-α(10 ng/mL)or IL-1β(10 ng/mL)were used to stimulate RAW264.7 cell for 6,12,24，48 h,and the NO contentwas measured by collecting the cell supernatant Greissmethod.Results Different doses of LPS could obviously induce the NO secreted by RAW264.7 cellswithout obvious dose dependency,and different doses of TNF-αor IL-1βcould cann obviously induce the NO secreted by RAW264.7 cells with a certain dose dependency,and the NO secretion volume was obviously increased after LPS(1μg/mL)or TNF-α(10 ng/mL),and IL-1β(10 ng/mL)stimulation for 6~48 h could obviously induce the secretion of NOwith a certain dose dependency.Conclusion 0.01~10.00μg/mL LPSand 0.10~100.00 ng/mL TNF-αor IL-1βin stimulating the RAW264.7 cell can successfully duplicate inflammatorymodel.

Inflammation;RAW264.7 cell;LPS;TNF-α;IL-1β

R965

A

1672-5654（2017）05（b）-0003-04

2017-02-11）

10.16659/j.cnki.1672-5654.2017.14.003

山東省博士基金資助項目（BS2014YY049）；煙臺市科技計劃資助項目（2014ZH092）；科研啟動基金（BY2013KYQD09）。

殷津津（1985-），女，山東青島人，碩士，主管藥師，研究方向：靛紅的抗炎作用研究，七葉皂苷鈉防治術后腸粘連研究等。

辛文妤（1985-），女，山東濰坊人，博士，講師，研究方向：炎癥與疾病，E-mail:xinwenyu1391139@163.com。