不同核酸檢測方法對獻血者隱匿性乙肝病毒感染的分析

陳秀麗

[摘要] 目的 分析不同核酸檢測方法對獻血者隱匿性乙肝病毒感染的檢測能力。方法 方便抽取2015年1月—2016年10月期間到獻血站進行無償獻血的8 000名人員，對其分別選擇Procleix Ultrio以及nested-PCR兩種自動核算檢測系統對其血漿標本予以HBN核酸檢測，同時序列分析核酸陽性標本。結果 通過研究后可知，40名獻血者HBsAg檢測結果為陽性，比例經計算后為0.50%，420名獻血者抗-HBc結果為陽性，比例經計算后為5.25%，25例獻血者經過Procleix Ultrio以及nested-PCR能力相當，表現為陽性結果。結論 獻血人員中隱匿性乙肝病毒感染比例較高，而核酸檢測方法的差異性致使檢測能力有所不同。

[關鍵詞] 核酸檢測；獻血者；隱匿性乙肝病毒感染

[中圖分類號] R440 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2017）04（c）-0068-03

[Abstract] Objective To analyze the effect of different nucleic acid test methods on the occult hepatitis B virus infection of blood donors. Methods 8 000 cases of blood donors from January 2015 to October 2016 were extracted and the plasma specimens were given the HBN nucleic acid test respectively by the Procleix Ultrio and nested-PCR， at the same time， the nucleic acid positive samples were given the sequence analysis. Results The research showed that of the 40 blood donors， the HBsAg test result was positive accounting for 0.50%， of 420 cases of blood donors， the anti-HBC result was positive， accounting for 5.25%， the result of Procleix Ultrio was similar to that of nested-PCR， positive. Conclusion The ratio of occult hepatitis B virus infection of blood donors is higher， and the difference in the nucleic acid test method lead to different test abilities.

[Key words] Nucleic acid test； Blood donor； Occult hepatitis B virus infection

HBV感染是我國較為重要的公共衛生課題，而檢測HBV感染的主要指標為HBsAg。然而在排除早期感染檢測窗口期，而經過HBV DNA陽性比例均有隱匿性HBV感染引發HBsAg陰性結果。HBV感染的一種特殊類型為OBI，如果獻血者出現OBI，當其進行獻血時會使得受血者產生病毒性肝炎或者感染HBV[1]。臨床對于OBI的檢測并無良好的手段，通常選擇NAT（核酸檢測）對HBV DNA進行檢測。核算檢測方法則在PCR原理基礎上以及TMA原理基礎上，上述兩種原理均可對HIV、HCV以及HBV病毒進行檢測[2]。該次研究則分析同核酸檢測方法對獻血者隱匿性乙肝病毒感染的檢測能力，方便抽取2015年1月—2016年10月期間到獻血者進行無償獻血的8 000名人員，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

方便抽取2015年1月—2016年10月期間到獻血者進行無償獻血的8 000名人員，對其血漿標本進行抽取，每人需要將2管血漿標本進行保留，兩管均為8 mL真空采血管，具有EDTA-K2抗凝以及帶分離膠，同時型號為LOT N786502。一管進行Procleix Ultrio檢測，另外一個管首先將1 mL血漿進行分離，在-20℃環境中進行保存，隨后對其進行nested-PCR檢測。剩余標本進行血清學檢測。

1.2 方法

血清學檢測。8 000名獻血人員在進行獻血之前需要實施HBsAg試紙條初次篩選，為HBsAg（乙型肝炎病毒表面抗原）診斷，隨后對此標本實施檢測，其檢測內容包含HBsAb、HBsAg以及HbcAb，此試劑采用膠體金法進行檢測。采用北京萬泰生物藥業股份有限公司生產的檢測劑HBsAb和HbcA，采用美國雅培以及廈門新創生產的HBsAg試劑，此試劑采用ELISA方法進行檢測。上述試劑均進行批檢同時按照試劑盒操作說明書予以操作。HBsAg陰性結果為兩種HBsAg試劑經檢測后均為陰性，任何一種HBsAg檢測為陽性則說明HBsAg結果陽性[3]。

Procleix Ultrio檢測。Procleix Ultrio檢測選擇單人份核算檢查，隨后和血清學檢測一同進行。Ultrio在進行初檢的過程中，如果出現反應性標本需要進行重復檢測，如再次產生反應性則為Ultrio反應性，如對其實施重復檢測后無反應性，通過辮子血血漿進行檢測，如依舊未產生反應性則為Ultrio非反應性，再次予以檢測后可將其判定為Ultrio反應性。因為Procleix Ultrio檢測能夠對HIV、HVC、以及HBV混合病毒進行檢測，為此Ultrio 反應行標本需要實施HBV鑒別，從而對其是否為陽性結果進行確定[4]。

nested-PCR檢測。nested-PCR檢測則是按照抗-HBc陽性單獨標本實施檢測，檢測過程中為單人份HBV-nested-PCR檢測。Procleix Ultrio檢測 NAT結果如果為陽性，其標本并非是抗-HBc單獨陽性，隨后對其實施單人份HBV-nested-PCR檢測[5]。血漿檢測時，選擇QIAamp DNA Blood Mini Kit對HBV-DNA進行檢測，檢測過程中選擇6套不同地區的引物實施巢式PCR，20 copies/mL為巢式PCR檢測指標。如果進行初次檢測后其標本結果為陽性，對其標本進行保存，并對DNA標本進行重復提取，進而實施復檢，當復檢結果為陽性時其檢測結果為陽性，當復檢結果為陰性時檢測結果為陰性[6]。

1.3 HBV S基因片段測試

S基因區域中的a表位片段是采用ABI 3 100 DNA全自動測試予以檢查，a表位片段包含aa110-aa165。在進行檢測的過程中其引物為S3 GCGGGGTTTTCTTGTTGAC 以及S4 GGGACTCAAGATGTTGTACAG，通過檢測可知其序列長度大致為544bp，同時表現為雙向[7-8]?；蚍中蛣t選擇MEFA3.1序列軟件實施，隨后采用Neighbor-Join-ing對數據進行計算。

2 結果

2.1 分析獻血人員一般情況和血清學檢測結果

8 000名獻血人員男性4 500名，女性3 500名，年齡最大者為38歲，年齡最小者為21歲，經軟件計算后平均年齡為（31.4±2.0）歲，3 000名為初次獻血。通過檢測后可知40名獻血者HBsAg檢測結果為陽性，比例經計算后為0.50%，420名獻血者抗-HBc結果為陽性，比例經計算后為5.25%。

2.2 分析HBV核酸檢測結果

40名獻血者為陽性結果，而25例獻血者經過Procleix Ultrio以及nested-PCR能力相當，表現為陽性結果，詳細數據由表1可知。與此同時，20名獻血者為B型基因，6名獻血者為C型基因，其中OBI中5名為B基因，10名為C基因。

3 討論

無償獻血人員中通常會產生OBI現象，而此現象同樣在多數研究中進行報道。同時該地區采用抗-HBc單獨陽性結果聯合nested-PCR方法對無償獻血者進行檢測[9]。而該次研究結果表明，本地區無償獻血患者中具有較高的隱匿性乙肝病毒感染發生率，而將血液篩選方法進行有效改進，保證血液安全是臨床一直研究的課題。與此同時說明nested-PCR為核酸檢測方法的靈敏度以及穩定性良好，但是因為此方法操作過程中具有一定的復雜性，因此不能將此方法在臨床中進行常規應用。

Procleix Ultrio為目前臨床中常用的血液核酸篩查系統，我國部分供血機構均采用此系統對NAT進行檢測，臨床研究證實nested-PCR檢測方法的靈敏度高于Procleix Ultrio檢測，對其原因因素進行分析可能為以下幾點，兩種檢測方法的原理存在差異行，nested-PCR為一種方法，而Procleix Ultrio采用TMA原理，為此前者檢測方法的靈敏度高于后者，但是需要進行深度研究，此外Procleix Ultrio系統對于HBV核酸并無較高的靈敏度。通常情況下，隱匿性乙肝病毒感染載量在200 IU以下，Procleix Ultrio雖然可實現幾個IU，但是其自身的靈敏度存在差異性，同時因為環境、標本和操作等相關因素的影響，無法實現檢測水平，進而降低了檢出正確率。

該次研究通過探究后可知，40名獻血者HBsAg檢測結果為陽性，比例經計算后為0.50%，420名獻血者抗-HBc結果為陽性，比例經計算后為5.25%，25名獻血者經過Procleix Ultrio以及nested-PCR能力相當，表現為陽性結果。由此能夠看出不同核酸檢測方法對獻血者隱匿性乙肝病毒感染具有不同的臨床意義，此研究結果和臨床以往的研究結果存在一致性，和李錦等人[10]對隱匿性乙肝獻血者中TGF-β1的表達結果存在相似性，其研究結果證實C型極易產生OBI患者。

綜上所述，C型極易產生OBI，但是由于該次研究時間以及樣本數量等問題，對于OBI的產生機制還需要進一步研究。

[參考文獻]

[1] 葉賢林，李彤，孫淑君，等.核心抗體陽性合格獻血者隱匿性乙肝病毒感染分子生物學特性及追蹤結果的研究[J].中國輸血雜志，2016，29（9）：890-894.

[2] Ford，S.，Summers，S.，Cantwell，L，et al.Hidden perils in a highly sensitized kidney transplant recipient[J].Nephrology，2012，17（Suppl.1）：9-11.

[3] 蔣昵真，朱紹汶，湯心怡，等.256例ELISA篩查無反應性/核酸檢測反應性標本的確認分析[J].中國輸血雜志，2016，29（10）：1126-1129.

[4] 方娛.HBsAg陰性伴抗--HBC陽性人群隱匿性乙型肝炎病毒感染流行率及臨床特征研究[D].濟南：山東大學，2016.

[5] 呂豪，江素君，孫愛華，等.衢州市無償獻血者中隱匿性HBV感染的基因型別及突變類型分析[J].中華實驗和臨床病毒學雜志，2014，28（5）：371-373.

[6] 葉賢林，杜鵬，馮旭，等.深圳市18～25歲抗-HBc陽性合格獻血者隱匿性乙肝病毒感染的血清學和分子生物學特性分析[C]//中國輸血協會.2014中國輸血協會第七屆輸血大會論文集.北京：中國輸血雜志，2014： 1112-1116.

[7] 賈曉坤，賈曉暉，楊鵬華，等.張家口地區獻血者隱匿性乙肝病毒感染研究[J].現代生物醫學進展，2013，13（10）：1962-1964.

[8] 孫波.輸血前血液篩查中新型HBV基因突變及抗原分析的研究[D].濟南：山東大學，2013.

[9] Kaneva， E.，Rainova， I.，Harizanov， R，et al.Study of Toxocara seroprevalence among patients with allergy and healthy individuals in Bulgaria[J].Parasite Immunology，2015，37（10）：505-509.

[10] 李錦，景媛媛，郭燕，等.隱匿性乙肝獻血者中TGF-β1的表達分析[J].中國輸血雜志，2016，29（1）：39-41.

（收稿日期：2017-01-24）