葛根上調肝胰島素抵抗HepG2細胞OB—R IRS2，GLUT1和GLUT2蛋白調節糖代謝的研究

黎宇+羅新新+嚴奉東+魏漳彬+涂珺

[摘要] 研究中藥葛根對人肝癌HepG2細胞胰島素抵抗（IR）模型糖代謝的改善作用并初步探討葛根降糖的分子作用機制。該實驗采用課題組優化方法，1×10-9 mol·L^-1胰島素加3.75×10-6 mol·L^-1地塞米松聯合給藥HepG2細胞48 h建立穩定的IR模型；CCK-8法檢測葛根含藥血清對細胞活性的影響；葡萄糖氧化酶法檢測多個時間點（12，15，18，21，24，30，36 h） IR-HepG2細胞葡萄糖消耗量；蒽酮法檢測細胞內糖原含量；Western blot法檢測胰島素受體底物2（IRS2）、瘦素受體（Ob-R）、葡萄糖轉運蛋白1（GLUT1）和GLUT2蛋白表達水平。研究結果顯示葛根含藥血清（5%，10%，15%）對IR-HepG2細胞的活力沒有明顯的影響；5%和10%葛根含藥血清在給藥18，21，24 h均顯著上調IR-HepG2細胞葡萄糖消耗量（P<0.01），15%葛根含藥血清除給藥15 h上調葡萄糖消耗量較弱（P<0.05），18，21，24，30 h都顯著上調葡萄糖消耗量（P<0.01），呈現一定程度劑量依賴性。葡萄糖消耗時效實驗確認24 h是最佳時間點，進一步研究發現葛根含藥血清作用24 h增加胞內糖原含量（P<0.01）；上調IRS2，Ob-R，GLUT1和GLUT2蛋白表達量。葛根含藥血清降糖作用可能部分通過上調Ob-R和IRS2蛋白表達來調節以PI3K/PDK為中心的胰島素信號通路；上調IR-HepG2細胞GLUT1和GLUT2表達量，加速葡萄糖轉運進入肝細胞中并增加糖原合成來增強IR-HepG2細胞的胰島素敏感性來實現的。

[關鍵詞] 胰島素信號通路； 胰島素受體底物2（IRS2）； 瘦素受體（Ob-R）； 葡萄糖轉運蛋白1（GLUT1）；GLUT2

[Abstract] To observe the anti-hyperglycemic effect of Puerariae Lobatae Radix in hepatocyte insulin resistance（IR） models， and investigate its preliminary molecular mechanism. IR-HepG2 cell model was stably established with 1×10-9 mol·L^-1 insulin plus 3.75×10-6 mol·L^-1 dexamethasone treatment for 48 h according to optimized protocol in our research group. After IR-HepG2 cells were treated with different concentrations（5%，10% and 15%） of Puerariae Lobatae Radix-containing serum， cell viability was detected by CCK-8 assay； the glucose consumptions in IR-HepG2 cells were separately detected at different time points （12， 15， 18， 21， 24， 30， 36 h） by using glucose oxidase method； intracellular glycogen content was detected by anthrone method； and the protein expression levels of leptin receptor （Ob-R）， insulin receptor substrate-2 （IRS2）， glucose transporter 1（GLUT1） and GLUT2 were detected by Western blot assay. The results showed that Puerariae Lobatae Radix-containing serum （5%， 10% and 15%） had no significant effect on IR-HepG2 cell viability； 5% and 10% Puerariae Lobatae Radix-containing serum significantly increased glucose consumption of IR-HepG2 cells （P<0.01） at 18， 21 and 24 h； 15% Puerariae Lobatae Radix-containing serum elevated the glucose consumption of IR-HepG2 cells at 15 h （P<0.05）， and significantly elevated the glucose consumption at 18， 21， 24 and 30 h （P<0.01） in a dose-dependent manner. The optimized time of anti-hyperglycemic effect was defined as 24 h， and further study showed that Puerariae Lobatae Radix-containing serum could increase intracellular glycogen content after 24 h treatment （P<0.01）， and up-regulate IRS2， Ob-R， GLUT1 and GLUT2 protein expression levels. Our results indicated that Puerariae Lobatae Radix-containing serum could achieve the anti-hyperglycemic effect through important PI3K/PDK signaling pathway partially by up-regulating the expression levels of Ob-R and IRS2， GLUT1 and GLUT2 in IR-HepG2 cells， accelerating the glucose transport into hepatocytes and increasing hepatic glycogen synthesis to enhance the anti-hyperglycemic effect of IR-HepG2 cells.

[Key words] insulin resistance （IR）； IRS2； Ob-R； GLUT1； GLUT2

眾多臨床實踐發現中藥在降糖調脂及治療2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）中注重調節人體的整體機能，作用溫和，長期使用具有較強的競爭優勢[1]。在中藥臨床辨證治療，葛根為主的系列經方廣泛用于糖尿病發生發展的不同階段。采用分子網絡藥理學方法發現，葛根主要成分葛根素、大豆苷元、染料木苷等均作用于胰島素信號PI3K，JNK通路，PI3K，JNK通路在胰島素信號轉導途徑中起著重要的作用，其異常的表達可能會影響葡萄糖轉運和合成、脂質代謝等[2]。已有研究發現葛根顆粒劑可明顯改善肥胖小鼠的糖脂代謝紊亂[3]。葛根煎劑能顯著降低糖尿病大鼠空腹血糖、游離脂肪酸、TNF-α的含量來提高胰島素敏感指數[4]。葛根主要藥效成分葛根素能改善T2DM患者血糖[5]，葛根素治療糖尿病的主要作用機制可能與降血糖、抗氧化應激、抑制蛋白質非酶糖基化等相關[6]。

本課題組研究發現重用葛根的葛根芩連湯配伍干預糖尿病大鼠呈現更好的降糖降脂藥效，可有效減輕胰島素抵抗（insulin resistance，IR）。本課題組已采用血清藥理學方法發現葛根含藥血清可明顯提高IR-3T3-L1脂肪細胞降糖降脂作用，干預多個糖脂代謝相關基因表達來改善脂肪IR的作用[7]。本實驗采用先期優化胰島素加地塞米松的穩定體外肝IR細胞模型[8]，研究葛根含藥血清對IR-HepG2細胞糖代謝的影響及并初步探討降糖的相關分子機制，為葛根的方劑配伍和臨床精準用藥提供理論指導。

1 材料

1.1 藥物 人肝癌細胞系HepG2細胞購于北京鼎國生物科技有限公司（源于協和細胞庫）。葛根（批號912014，產地廣西，江西匯仁藥業有限公司），葛根素質量分數為5.4%，符合2015年版《中國藥典》標準。

1.2 動物 SPF級雄性SD大鼠，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物合格證號11400700119627。

1.3 試劑 葡萄糖測定試劑盒（上海榮盛生物藥業有限公司，GOD-POD法，批號361500）；DMEM高糖培養基（Hyclone公司，批號NAE1396）；胰島素（Sigma分裝）；地塞米松（Sigma公司，批號#BCBC92609V）；Cell Counting Kit-8（同仁化學研究所，批號JH620）；鹽酸二甲雙胍（中國食品藥品檢定研究院，批號41DF-4HDKM）；非諾貝特（中國食品藥品檢定研究院，批號41DF-4HKJM）；GLUT1抗體（美國Millipore公司，批號#2430566）；GLUT2抗體（美國Abcam公司，批號#ab921599）；Ob-R抗體（美國Santa公司，批號L2673）；IRS-2（美國CST公司，批號3089S）；辣根酶標記山羊抗鼠二抗（聯科生物公司，批號#5103930）。

1.4 儀器 倒置顯微鏡（日本Olympus CKX41）；CO2培養箱[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；全波長酶標儀（Spectra Max Plus384，美國Molecular Devices）；電泳儀、水平和垂直電泳槽、轉移槽（美國Bio-Rad公司）；化學發光凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 葛根含藥血清的制備及含量測定 參考本課題組已發表文獻的方法制備[7]，簡述如下：稱取葛根藥材并加入8倍藥重的水，浸泡30～60 min；煮沸40 min后，減壓旋轉蒸發濃縮制備葛根水提液（1 g·mL^-1），保存于4 ℃備用。SD雄性大鼠60只，體重（280±20） g，隨機分為空白血清組（40只），葛根含藥血清組（20只）。含藥血清組按每100 g大鼠體重給藥量2.5 mL給予葛根水提液灌胃制備，分裝-20 ℃保存。UPLC-MS檢測葛根成分葛根素和大豆苷元出峰時間及含量。

2.2 細胞培養 將凍存的HepG2細胞用15%FBS轉至細胞培養瓶中，放37 ℃，5%CO2培養箱中。待細胞接觸性抑制后，用10%FBS的DMEM培養基每3 d按1∶3傳代1次，待細胞從復蘇適應2周后，于對數生長期進行實驗。

2.3 IR-HepG2細胞模型建立 參考本課題先期優化肝IR模型建立方法[8]，用1×10-9mol·L^-1胰島素加3.75×10-6 mol·L^-1地塞米松培養誘導48 h后，棄去培養液，PBS洗滌2次，再用培養基37 ℃孵育20 min；重復上述過程1次，換上無血清培養液孵育24 h后，檢測各組細胞培養基上清液中葡萄糖含量，計算葡萄糖消耗量。

2.4 對IR-HepG2細胞葡萄糖消耗量的影響 復制2.3項中的模型，給藥分組為正常組，IR組，二甲雙胍組（2 mmol·L^-1），5%，10%，15%葛根含藥血清分組，每組都補大鼠空白血清至總血清含量為15%，在給藥12，15，18，21，24，30，36 h分別采用葡萄糖氧化酶法檢測其上清液中葡萄糖含量，參照文獻加以改進[9]，以無細胞的空白孔為對照，以起始葡萄糖濃度減去各時間點葡萄糖濃度來計算葡萄糖消耗量。

2.5 對HepG2細胞活性的影響 IR-HepG2細胞模型建立參照2.3項，細胞分組如2.4項。參照文獻方法[8]，給藥24 h后，每孔加10 μL CCK-8測定液，孵育1 h后，酶標儀檢測490 nm吸光度A，計算細胞存活率，細胞存活率=A模型組/A對照組×100%。

2.6 對IR-HepG2細胞糖原含量的影響 復制2.3項中的模型，細胞分組如2.4項。給藥24 h時，將培養基棄去，用PBS清洗消化后，1 000 r·min^-1， 5 min收集細胞。棄去上清后加入1 mL PBS將細胞吹打均勻后分為2份后離心棄上清。一份加入糖原裂解液提取細胞內的糖原，以蒽酮法測定糖原含量[10]；另一份加入細胞裂解液提取細胞蛋白，用BCA試劑盒測定細胞內總蛋白含量。細胞糖原合成量=糖原量/細胞總蛋白量。

2.7 對IR-HepG2細胞IRS2，Ob-R，GLUT1和GLUT2蛋白表達影響 將培養基棄去加入裂解液覆蓋細胞表面，放冰上10 min后4 ℃離心，14 000 r·min^-1，15 min后取上清；用BCA測定蛋白濃度。取各組蛋白樣品40 μg，以10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白，然后濕轉法（280 mA，1 h）將蛋白質轉移至PVDF膜上，再用含5%脫脂奶粉的1×TBST室溫下封閉1 h后加入一抗蛋白，4 ℃過夜后，1×TBST洗膜3次，每次10 min；辣根過氧化物酶標記二抗蛋白，室溫輕搖1 h，充分洗滌后加入ECL工作液，放入化學發光凝膠成像儀檢測，采用BIO-RAD公司的Image Lab軟件分析。

2.8 統計分析 所有數據以±s表示。2組間比較用單因素方差分析（One-Way ANOVA），P<0.05為差異有統計學意義。采用德國Qiagen公司的Ingenuity Pathway Analysis（IPA）通路軟件對差異蛋白進行功能分析，網絡關聯并繪制相應示意圖。

3 結果

3.1 葛根含藥血清對IR-HepG2細胞葡萄糖消耗量的影響 在1×10-9 mol·L^-1胰島素加3.75×10-6 mol·L^-1地塞米松聯合培養48 h之后，與正常組相比，IR組葡萄糖消耗量顯著降低（P<0.01）；與IR組相比，5%和10%葛根含藥血清在給藥18，21，24 h均顯著上調IR-HepG2細胞葡萄糖消耗量（P<0.01），15%葛根含藥血清除給藥15 h上調葡萄糖消耗量較弱（P<0.05），18，21，24，30 h都顯著上調葡萄糖消耗量（P<0.01），呈現一定程度劑量依賴性。時效數據表明葛根含藥血清在給藥24 h增加IR-HepG2細胞的葡萄糖消耗量效果最好，見表1，認定24 h為最佳藥效時間點。葛根含藥血清按作用24 h進行后續糖原與蛋白實驗。

3.2 葛根含藥血清對IR-HepG2細胞活性的影響 不同劑量葛根含藥血清作用于IR-HepG2細胞24 h后，與正常組相比沒有明顯差異，表明葛根含藥血清對IR-HepG2細胞的活性沒有明顯影響，見表2。

3.3 葛根含藥血清對IR-HepG2細胞糖原含量影響 與正常組相比，IR組細胞糖原含量顯著降低（P<0.01）。給藥24 h后，與IR組相比，葛根含藥血清（5%，10%，15%）顯著增加IR-HepG2細胞的糖原含量，以10%和15%葛根含藥血清更為顯著（P<0.01），見表3。

3.4 對IRS2，Ob-R，GLUT1和GLUT2蛋白表達差異影響 與IR組相比，10%和15%葛根含藥血清作用24 h能顯著上調IRS2， Ob-R和GLUT2蛋白表達量（P<0.01）；葛根含藥血清（5%，10%，15%）明顯升高GLUT1蛋白表達，以5%和15%葛根含藥血清更為顯著（P<0.01），見圖1。根據干預蛋白表達差異繪制葛根含藥血清干預糖代謝途徑的示意圖，見圖2。

4 討論

糖尿病藥物研發以前多集中在單靶點的單成分藥物上，目前多靶點開發的西藥復方藥物不斷研發上市并獲得較為廣泛的接受。單味中藥和復方含有多個有效活性成分，可以多通路多靶點在多層次多水平多器官上作用于機體，可以產生較好療效，長期使用具有較小副作用，具有天然用藥優勢。

眾所周知，T2DM的主要病理基礎是IR，IR貫穿T2DM發生發展的整個過程。IR主要表現為機體三大外周組織（脂肪、肝臟和骨骼?。┘毎ど限D運和利用葡萄糖效率下降[11]。許多T2DM藥物的研發是基于影響胰島素信號通路的靶點來研發的，因為胰島素信號傳導障礙被認為是誘發糖尿病系統性IR的主因。胰島素信號轉導途徑是胰島素和細胞膜表面的胰島素受體結合后，磷酸化胰島素受體底物（insulin receptor substrate，IRS），與PI3K形成蛋白復合物，磷酸化的PI3K進一步通過PKB/Akt，PKC和一些下游通路，影響到葡萄糖轉運和糖原合成[12]。

葡萄糖轉運蛋白（glucose transporter，GLUT）是介導哺乳動物細胞內葡萄糖轉運和代謝的關鍵限速因子。GLUT蛋白表達和結構異常與糖尿病及其并發癥的發生發展密切相關，從血糖調節角度來說值得關注[13]。GLUT1分布最為廣泛，在哺乳動物各組織和細胞中均有表達，在細胞的基礎糖代謝中發揮重要作用。GLUT1的調節同GLUT4類似，可分為糖代謝前期的快調節和后期的慢調節2種形式，快調節主要是GLUT1從胞質轉位到細胞膜上，慢調節主要是增加GLUT1的合成或減少GLUT1的降解來增加GLUT1蛋白總量[12]。筆者的實驗結果顯示肝IR造成細胞外液葡萄糖堆積形成高糖環境導致GLUT1表達下調，與以往研究結果相一致[13]。多個劑量組葛根含藥血清可通過慢調節顯著增加IR-HepG2細胞中GLUT1蛋白總量。此外，葛根含藥血清升高肝細胞IRS2蛋白表達，可能增強磷酸化PI3K/ PDK/αPKC信號通路，加速GLUT1轉位到細胞膜上[14]。推測葛根可能以快慢2種方式調節GLUT1的數量和位置來主動調節IR-HepG2細胞的糖代謝，減輕肝葡萄糖轉運障礙。

除了GLUT1采用主要運輸的轉運方式外，其他GLUTs主要以易化擴散的被動運輸方式來穿過細胞膜的脂質雙分子層實現葡萄糖的轉運。GLUT2是一種和葡萄糖結合力很低但具有高轉運能力的蛋白，主要分布在肝腎和胰島β細胞中，GLUT2可與葡萄糖激酶共同形成葡萄糖感受器，轉運葡萄糖進入細胞中，經一系列信號傳遞，促成胰島β細胞的胰島素合成與分泌。GLUT2也是肝細胞中負責葡萄糖轉運的最主要媒介，可為糖原合成提供原料幫助抑制肝糖輸出來維持血糖穩態[13-14]。GLUT2不同于GLUT1/GLUT4從胞漿外翻至細胞質膜上執行功能，則主要是從細胞質膜上轉運葡萄糖進入細胞后內吞至胞漿內代謝[15]。本實驗研究結果顯示在無血清培養基孵育24 h后，正常HepG2細胞中GLUT2表達非常低，圖1上未見明顯條帶，與體外正常肝細胞中GLUT2可見明顯條帶不一致，推測原因可能是細胞外液葡萄糖堆積較少，加之作為癌細胞HepG2中GLUT1基礎表達較高，因而抑制GLUT2表達。IR細胞適應高糖環境升高肝細胞膜表面GLUT2的表達，但仍不足以快速消耗外液中過量堆積的葡萄糖。10%和15%葛根含藥血清明顯上調GLUT2的表達，加速葡萄糖轉運進入肝細胞中，為更多的肝糖原提供合成原料增強降糖效應，與其他復方制劑芪蛭降糖膠囊升高GLUT2表達相一致[16]。

瘦素是多功能多靶器官的神經免疫內分泌調節激素，可抑制食欲減少脂肪過度堆積。瘦素與Ob-R結合參與多種信號傳導，可在體內外調節胰島素誘導相關基因表達。Ob-R和瘦素的突變與胰島素分泌異常密切相關，且相互緊密關聯[17]。瘦素抵抗會明顯抑制胰島素受體的表達從而加重機體IR程度。正常的瘦素信號可以增強IRS和PI3K的結合。人肝細胞主要表達IRS2，是抑制肝糖異生必須的蛋白。IRS2是肝細胞中PI3K-Akt級聯中關鍵調控節點，缺失肝IRS2信號可導致營養過剩和肝能量代謝紊亂[18]。本實驗研究表明，與IR組相比，10%和15%葛根含藥血清增強IR-HepG2細胞Ob-R和IRS2表達。結合其他研究結果，推測葛根增強Ob-R和IRS2表達來減輕瘦素對胰島素受體表達抑制，增強IRS2和PI3K的結合，調節以磷酸化PI3K/PDK為中心節點的胰島素信號通路，通過PKC及其下游通路調節葡萄糖轉運，上調GLUT1和GLUT2表達及可能增加GLUT1的轉位到肝細胞膜上，從而減輕葡萄糖轉運障礙；通過PKB/Akt及其下游通路增加肝細胞內糖原合成來改善糖代謝來增強胰島素敏感性。

總之，葛根含藥血清能夠有效調節肝糖代謝來改善IR，具體的調節機制還需要對胰島素信號通路上重要節點IRS2，Ob-R，PI3K和AKT等蛋白磷酸化水平及活性進一步深入研究。對葛根體外細胞糖代謝的系列基礎研究將有助于從理論上指導以葛根為主要配伍的降糖復方制劑開發。

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[責任編輯 張寧寧]