半夏葉柄愈傷組織誘導與分化最適培養基篩選

溫琳，惠國強，楊海鵬，宋紅霞，梁藝，孫毅，劉小紅，張紅梅，4

（1.山西大學生物工程學院，山西太原030006；2.山西省農業科學院玉米研究所，山西忻州034000；3.山西省農業科學院生物技術研究中心，山西太原030031；4.農業部黃土高原作物基因資源和種質創制重點實驗室，山西太原030031；5.西華師范大學生命科學學院，四川南充637002）

半夏葉柄愈傷組織誘導與分化最適培養基篩選

溫琳1，惠國強2，楊海鵬2，宋紅霞1，梁藝2，孫毅3，4，劉小紅5，張紅梅2，4

（1.山西大學生物工程學院，山西太原030006；2.山西省農業科學院玉米研究所，山西忻州034000；3.山西省農業科學院生物技術研究中心，山西太原030031；4.農業部黃土高原作物基因資源和種質創制重點實驗室，山西太原030031；5.西華師范大學生命科學學院，四川南充637002）

以半夏（Pinellia ternata（Thunb.）Breit）葉柄為外植體，研究不同培養基配方對誘導脫分化、愈傷組織增殖及分化的影響。結果表明，適合半夏葉柄誘導脫分化的最佳培養基是MS＋1.0 mg/L2，4-D＋0.2 mg/L6-BA；最適愈傷組織增殖培養基是MS＋1.0 mg/L2，4-D＋0.2 mg/L6-BA；最適分化培養基是MS＋0.5 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L NAA。

半夏；葉柄；組織培養；愈傷組織

半夏（Pinellia ternata（Thunb.）Breit），別名三葉半夏、三興草，屬天南星科，主要產于四川、云南、貴州、江南等地。半夏是多年生宿根小草本植物，塊莖入藥，具有燥濕化痰、和胃止嘔，主治痰濕水飲、嘔吐、咳喘等病癥[1-2]。半夏已有2 000多年的用藥歷史，始載于《神農本草經》，其良好的應用價值備受國內外的關注，社會需求量較大[3]。但是近年來，由于土地開發、放牧、環境污染及野生資源過度采挖等原因，我國大部分地區的半夏棲息地遭到不同程度的破壞，導致野生半夏資源日益減少[4-8]。

半夏組培苗具有生長速度快、繁殖系數高、不帶病毒等特點，所以，利用組織培養再生苗或者用于提取有效成分已成為半夏生產發展的趨勢[9-12]。徐秀梅等[13]通過對半夏葉片和葉柄的誘導，得到半夏叢生芽誘導最適培養基為MS＋2 mg/L 6-BA＋0.1 mg/LNAA。萬美亮等[14]采用葉片、葉柄得到一次成苗的最適培養基為MS＋0.2 mg/L2，4-D＋1 mg/L KT。夏海武等[15]在半夏出苗期、生長旺盛期、珠芽成熟期、倒苗期分別取葉片、葉柄、塊莖接種，結果發現，材料的采集時間與再生愈傷組織的數量有密切的關系，出苗期和生長旺盛期材料分生能力較強，而珠芽成熟期和倒苗期材料分生能力逐漸減弱。半夏塊莖的誘導率較高，最高可達94%，且塊莖的誘導率與采集時間關系不大。

本試驗選用半夏葉柄進行誘導脫分化、愈傷組織增殖和分化的最適培養基的研究，旨在為工廠化、規模化生產脫毒種苗奠定基礎，提供技術支持[16-20]。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料選自陵川縣栽培的半夏珠芽及種子。

1.2 方法

1.2.1 無菌苗的獲得分別取半夏的珠芽、種子，先用流水洗去表面的灰塵及泥土等，再用洗滌劑漂洗。珠芽清洗干凈后需要剝去外層皮，清水洗凈，避免傷到生長點；種子剝去種皮，清水洗凈，流水下沖洗30 min。珠芽和種子處理好后進行第1輪消毒，75%酒精處理30 s，無菌水沖洗3～4次，然后將珠芽、種子各分成4份，每份都用0.1%HgCl2進行第2輪消毒，消毒時間依次是4，8，10，12 min共4個處理，第2輪消毒處理后都經無菌水沖洗3～4次，轉至未添加任何激素的MS培養基中，珠芽每瓶放置1個，每個處理接種50瓶，種子每瓶放置5個，每處理接種10瓶。接種后置于25℃，光強2 000 lx的培養室內進行無菌苗培養，30 d后統計珠芽和種子的染菌率和成活率。

1.2.2 半夏葉柄的脫分化以MS為基本培養基，分別添加不同濃度的2，4-D和6-BA，共9個處理組（表1）。切取長勢良好的半夏無菌苗葉柄接種于9種培養基中，每瓶接種3個，每個處理接種10瓶，重復3次，接種后置于培養室內進行暗培養，培養溫度25℃。培養30 d后觀察統計半夏愈傷組織誘導率及生長情況。

表1 半夏愈傷組織誘導培養基不同激素配比mg/L

1.2.3 半夏愈傷組織增殖選取長勢一致的半夏愈傷組織分別接種到以下3種培養基上，Ⅰ號：MS＋1.0mg/L2，4-D＋0.2mg/L6-BA；Ⅱ號：MS＋1.5mg/L 6-BA＋0.2 mg/L IAA；Ⅲ號：MS＋0.5 mg/L 2，4-D＋0.2 mg/LNAA；每個培養瓶接4塊愈傷組織，每種培養基接20瓶。培養溫度25℃，光照強度2 000 lx，30 d后觀察統計愈傷組織生長情況。

1.2.4 半夏愈傷組織分化分化培養基為MS添加不同濃度的6-BA和NAA。6-BA和NAA濃度設計為9個處理，如表2所示。選取生長狀態相同的增殖愈傷組織接種到分化培養基上，每瓶接種4塊，每個處理接種10瓶，每個處理重復3次。接種后暗培養5 d，然后轉入光培養，培養溫度25℃，光照強度2 000 lx，光照為16 h/d。每10 d觀察出苗數（葉柄高于5 mm為1苗）。

表2 半夏愈傷組織分化培養基不同激素配比mg/L

2 結果與分析

2.1 滅菌時間對珠芽和種子的影響

以半夏珠芽、種子獲得無菌苗時，滅菌時間對滅菌效果和成活率的影響如圖1所示。試驗結果表明，用0.1%的升汞消毒，消毒時間越長滅菌效果越好，但外植體的成活率隨之降低；種子消毒8 min就可獲得理想的滅菌效果，污染率是0，而成活率可達81.8%，珠芽消毒時間達到10 min才可獲得較理想的滅菌效果，污染率僅4.3%，而成活率可高達91.5%。試驗結果表明，珠芽與種子相比，種子滅菌較為容易。珠芽滅菌困難主要由于其接觸土壤，自身攜帶生物細菌、真菌或者霉菌較多，且珠芽外表皮質地略硬，較難清潔干凈，因此，滅菌較困難。種子最外有佛焰苞包被，又具有易分離的種皮包裹，生存環境相對純凈，因此，滅菌較容易。

試驗表明，用0.1%的升汞消毒，消毒時間8～12 min，種子的存活率差異較小，但珠芽隨滅菌時間的延長，成活率呈下降趨勢。這個現象可能是珠芽生長點的包被層較薄，生長點易遭到傷害使其無法生長。種子生長點包被的相對較厚，不易受到傷害。但珠芽得到的無菌苗比由種子獲得的無菌苗健壯，表現為葉柄粗，葉子大，顏色深，根系粗且長，這可能與半夏珠芽本身含營養物質較多有關。

在自然環境中，半夏的發芽率只有20%左右，采用本試驗的方法，可將發芽率提高到87.5%，這對于提高雜交選育半夏優良品種的效率是個突破。

2.2 半夏葉柄的脫分化

外植體葉柄接種到培養基上20 d時，葉柄兩端上翹或彎曲，并且膨大，出現大量黃綠色疏松愈傷組織，隨著時間延長，愈傷組織不斷增大，此外還有白色疏松狀的愈傷組織，質地疏松無器官分化，分散性好，但數量較少。表3顯示，除T1外，其他培養基皆可誘導得到愈傷組織，其中，T5的愈傷誘導率最高。

表3 不同激素組合對半夏愈傷組織發生的影響

從圖2可以看出，不添加6-BA時，愈傷組織誘導率隨2，4-D質量濃度的增加而增大；6-BA質量濃度是0.4 mg/L時，愈傷組織誘導率隨2，4-D質量濃度的增加而降低；6-BA質量濃度是0.2 mg/L時，3種2，4-D質量濃度的愈傷組織誘導率均較高，但以2，4-D質量濃度是1.0 mg/L時愈傷組織誘導率最高，為93.3%。所以，誘導愈傷組織的最佳培養基是MS＋1.0 mg/L2，4-D＋0.2 mg/L6-BA。

2.3 半夏愈傷組織的增殖

愈傷組織在3種培養基上的增殖情況如圖3所示，Ⅰ號培養基上愈傷組織可大量增殖，無明顯分化現象，適合做增殖培養基；Ⅱ號培養基上愈傷組織增殖很少，出現少量分化的苗；Ⅲ號培養基上愈傷組織分化明顯，分化苗周圍伴隨顆粒狀愈傷生長。因此，Ⅰ號培養基MS＋1.0mg/L2，4-D＋0.2mg/L 6-BA適合用作增殖培養基，Ⅱ號培養基適合用作1次成苗培養基，Ⅲ號培養基適合用作分化培養基。

2.4 半夏愈傷組織的分化

9種分化培養基均可分化出苗（表4、圖4），但分化出苗數量和質量在不同培養基上有差異。由圖4可知，培養基中不添加NAA時，6-BA對分化率的影響呈正效應，隨6-BA質量濃度的增高分化率也增高。但加入NAA后，在NAA質量濃度一定的情況下，分化率隨6-BA質量濃度的增高呈下降趨勢。說明NAA和6-BA之間存在互作，根據表4，圖4，5分析得出，分化最佳培養基為MS＋0.5 mg/L 6-BA＋0.2 mg/LNAA。

表4 不同激素組合對半夏愈傷組織分化的影響

3 討論

半夏種子數量較多，活力較強，易于滅菌，因此，種子是培養基初步篩選的較好材料[4]。在影響半夏出芽的外界因素中，外植體的年齡對植株再生有重要影響，無菌苗苗齡低，接種過程中容易造成機械損傷，使傷口褐化，導致外植體死亡，出芽率下降；苗齡過高，易形成倒苗，葉片和葉柄老化甚至枯萎，不能用作外植體；生長旺盛期和珠芽成熟期的半夏材料，其外植體的分化率都較高[21]。將種子接種在MS培養基時，87.5%以上的種子可以萌發成幼苗，前人的研究結果在自然狀態下半夏種子的發芽率只有20%，因此，本研究獲得的結果為通過雜交選育半夏優良品種奠定了良好的基礎。

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Screening of Optimal Medium for Callus Inducing and Differentiation of Petiole ofPinellia ternata（Thunb.）Breit

WENLin1，HUI Guoqiang2，YANGHaipeng2，SONGHongxia1，LIANGYi2，SUNYi3，4，LIUXiaohong5，ZHANGHongmei2，4
（1.College ofBiological Engineering，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2.Institute ofMaize，Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Xinzhou 034000，China；3.Research Center ofBiotechnology，Shanxi Academyof Agricultural Sciences，Taiyuan 030031，China；4.KeyLaboratoryofCrop Gene Resources and GermplasmEnhancement on Loess Plateau，MinistyofAgriculture，Taiyuan 030031，China；5.College ofLife Science，China West Normal University，Nanchong637002，China）

Petioles of Pinellia ternata（Thunb.）Breit were used to investigate the effects of several mediums on the induced dedifferentiation ratio,callus proliferation ratioofpetioles of Pinellia ternata（Thunb.）Breit.The results showed that the optimal medium for petioles dedifferentiation,callus proliferation and differentiation were MS＋1.0 mg/L 2,4-D＋0.2 mg/L 6-BA,MS＋1.0 mg/L 2, 4-D＋0.2 mg/L6-BA,MS＋0.5 mg/L6-BA＋0.2 mg/LNAA.

Pinellia ternata（Thunb.）Breit;petiole;tissue culture;callus

S567.23＋9

：A

：1002-2481（2017）06-0905-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.06.11

2017-01-19

國家轉基因生物新品種培育重大專項（2016ZX08003-001）

溫琳（1992-），女，山西介休人，在讀碩士，研究方向：作物遺傳與育種。張紅梅為通信作者。