雙孢蘑菇固態發酵對玉米營養成分的影響

劉紅艷，翟飛紅，韓建榮

（山西大學生命科學學院，山西太原030006）

雙孢蘑菇固態發酵對玉米營養成分的影響

劉紅艷，翟飛紅，韓建榮

（山西大學生命科學學院，山西太原030006）

初步研究了雙孢蘑菇固態發酵對玉米碳水化合物和蛋白質的影響，并通過氨基酸評分（AAS）、必需氨基酸指數（EEAI）、營養指數（NI）等方法對發酵產物的營養價值進行了全面評價。結果表明，玉米經雙孢蘑菇固態發酵30 d后，淀粉含量從57.64 g/100 g降到49.93 g/100 g，總糖含量從58.51 g/100 g降到51.22 g/100 g，總膳食纖維含量從21.75 g/100 g降到17.49 g/100 g，還原糖含量從9.63 g/100 g增加到14.29 g/100 g，粗蛋白含量由8.25 g/100 g增加到9.13 g/100 g，水溶性蛋白含量由1.82 g/100 g增加到4.32 g/100 g；發酵產物中蛋白質的必需氨基酸種類更加齊全，氨基酸含量、比例更接近WTO/FAO推薦的理想模式，AAS，EEAI和NI均高于對照組，其中，第1限制氨基酸為蛋氨酸+半胱氨酸，第2限制氨基酸為賴氨酸；將雞蛋蛋白作為標準蛋白，發酵后產物中的蛋白質與雞蛋蛋白的貼近度（CD）較高，說明發酵后玉米蛋白質的營養價值明顯優于未發酵的玉米。

雙孢蘑菇；玉米；碳水化合物；蛋白質

雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）又稱白蘑菇，其子實體含有多種氨基酸、維生素、類黃酮以及酚類化合物等，具有很高的營養價值[1]。除了其子實體可以利用外，還可以對其菌絲體通過發酵等方式加以利用[2]。研究發現，雙孢蘑菇具有抑制腫瘤、降低血脂、抗癌、抗凝血等功效，可提高機體免疫力，預防心腦血管疾病[3]。

玉米屬于禾本科植物，是人們日常生活中最常見的糧食作物。其含有蛋白質、脂肪、淀粉、纖維素以及鈣、磷、鐵等礦物質，具有很高的營養價值。但是，玉米蛋白質中往往缺少色氨酸和賴氨酸，研究表明，蛋白質中缺少某種必需氨基酸時，其他氨基酸就不能被充分利用，從而降低了總蛋白質的消化率和食物的營養價值[4]。

微生物中含有豐富的酶系，將谷物中的大分子物質降解成小分子物質利于人體吸收利用；微生物在發酵過程中會產生新的代謝產物，使谷物的營養成分更加豐富和均衡。因此，利用微生物發酵谷物來提高谷物營養價值引起了國內外諸多研究者的注意[5]。

目前在谷物發酵方面，常用的發酵菌株有乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌、霉菌以及多菌株混合發酵等，通過微生物發酵產生相應的酶來改變谷物中糖分、淀粉、蛋白質及多酚類等物質的結構，從而改善谷物的營養成分并提高其營養價值[6-7]。但是，關于利用雙孢蘑菇對玉米進行固態發酵的研究還未見報道。

本試驗選用玉米作為培養基，初步研究雙孢蘑菇固態發酵對玉米中營養成分的影響，并對發酵產物蛋白質的營養價值進行評價，旨在為提高玉米的營養價值、豐富谷物發酵食品和開發純天然的保健食品提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）由山西大學生命科學學院微生物實驗室提供，保存于馬糞瓊脂培養基中。

1.1.2 試劑與儀器標準葡萄糖、3，5-二硝基水楊酸（DNS）、鹽酸、氫氧化鈉、碘-碘化鉀、乙醚、乙醇、α-淀粉酶、甲基紅、十二烷基苯磺酸、乙酸、馬鈴薯直鏈淀粉、支鏈淀粉、丙酮、三羥甲基甲烷、2-（N-嗎啉代）乙烷磺酸、木瓜蛋白酶、糖化酶、硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸、硼酸、考馬斯亮藍G-250、酒石酸鉀鈉、結晶酚和亞硫酸鈉均為國產分析純。

TU-1810紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；電子天平，上海精密科學儀器有限公司；SC-3614低速離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司；臺式全溫振蕩培養箱，上海知楚儀器有限公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；GZX-9076MBE電熱鼓風干燥箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；SSXF-2.2.18型馬弗爐，上?？德穬x器設備有限公司。

1.2 培養基的制備

準確稱取800 g（干質量）除去谷殼和石子等雜物的玉米，在100℃沸水中煮沸至無白心，瀝干水分，攤開晾干至不黏手（水分含量大約為40%），然后將處理好的玉米平均分裝在16個250 mL的錐形瓶中，用透氣塑料膜封口，121℃滅菌1 h。

1.3 固態發酵

將活化后的雙孢蘑菇斜面菌種切成1 cm×1 cm的小塊，接種至滅菌后的玉米培養基中，每瓶接種3塊，置于25℃培養箱中培養，待菌絲長滿瓶后開始計時，在第30天取出。將取出的樣品用玻璃棒攪拌均勻，在40℃烘箱中烘干并粉碎過0.177 mm篩，用來測定發酵產物的營養成分。每個處理設3次重復，未接種的培養基作為對照。

1.4 發酵產物中碳水化合物含量的測定

還原糖和總糖含量采用3，5-二硝基水楊酸法（DNS法）測定[8]；淀粉含量采用GB/T 5514—2008《糧食、油料中淀粉含量的測定》進行檢測；膳食纖維含量采用GB 5009.88—2014《食品中膳食纖維的測定》進行檢測。

1.5 酶活測定

1.5.1 α-淀粉酶活測定

1.5.1.1 粗酶液的制備分別稱取2 g發酵5，10，15，20，30d的玉米發酵產物，加蒸餾水約2mL，冰浴研磨成勻漿，轉入離心管中，并用6 mL的蒸餾水沖洗研缽2～3次，洗出液轉入離心管中，12 000 r/min，4℃離心10 min，上清即為粗酶液。

1.5.1.2 α-淀粉酶活測定參照MILLER[9]的方法，略作改動。酶活力單位為在25℃，每分鐘能催化水解底物產生1 μmol麥芽糖的酶量為1個酶活單位（IU）。

1.5.2 纖維素酶活測定

1.5.2.1 粗酶液的制備其同α-淀粉酶粗酶液的提取方法。

1.5.2.2 纖維素酶活力的測定采用周慧敏等[10]的方法，略作改動。酶活力單位為1 mL酶液反應1 h產生1 mol葡萄糖為1個酶活單位（U）。

1.5.3 β-葡萄糖苷酶活測定

1.5.3.1 粗酶液的制備分別準確稱取1 g發酵5，10，15，20，30 d的玉米發酵產物，加入2 mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（0.2 mol/L，pH值4.6）和聚乙烯吡咯烷酮（PVP），冰浴研磨成勻漿，轉入離心管中，并用6 mL的蒸餾水沖洗研缽2～3次，洗出液轉入離心管中，12 000 r/min，4℃離心10 min，上清即為粗酶液。

1.5.3.2 β-葡萄糖苷酶活的測定采用pNPG法[11-12]，略作改動。酶活力單位為每分鐘每克谷物水解1 μmol pNPG的酶活力為1個酶活單位。

1.6 蛋白質含量測定

粗蛋白含量根據GB/T 5009.5—2003，采用凱氏定氮法測定。水溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍G-250結合法進行測定[8]。

1.7 氨基酸含量測定

根據GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》，委托山西糧食質量檢測中心測定17種氨基酸含量。根據GB 7650—1987，采用分光光度計測定色氨酸含量。

1.8 發酵產物營養價值評價

氨基酸評分（AAS）采用FAO/WHO評分標準，采用文獻[13]計算蛋白質中必需氨基酸的評分值；必需氨基酸指數（EAAI）根據劉利娥[14]的方法計算；營養指數（NI）根據CRISAN等[15]的方法計算；與雞蛋蛋白的貼近度（CD）采用模糊識別法（fuzzy discernment）[16]，將雞蛋蛋白作為模式蛋白評價發酵產物的營養價值[17]。

1.9 數據分析

以上試驗均設3次重復，數據采用SPSS19.0的Duncan多重比較法[18]進行多個均值間的兩兩比較。

2 結果與分析

2.1 發酵產物中的碳水化合物分析

從表1可以看出，對照組玉米中，淀粉含量為57.64 g/100 g，總糖含量為58.51 g/100 g，還原糖含量為9.63 g/100 g；但玉米經雙孢蘑菇固態發酵30 d后，淀粉、總糖和總膳食纖維的含量明顯降低（P＜0.05），淀粉含量從57.64 g/100 g降到49.93 g/100 g，總糖含量從58.51 g/100 g降到51.22 g/100 g，總膳食纖維含量從21.75 g/100 g降到17.49 g/100 g；而還原糖含量卻明顯增加（P＜0.05），從9.63 g/100 g增加到14.29 g/100 g。

表1 玉米發酵產物中的碳水化合物含量

從圖1可以看出，在整個發酵過程中均產生了α-淀粉酶、纖維素酶以及β-葡萄糖苷酶。結合表1可以得出，玉米經雙孢蘑菇固態發酵過程中產生的α-淀粉酶、纖維素酶以及β-葡萄糖苷酶能夠將谷物中的大分子物質（總糖、淀粉和膳食纖維）水解成小分子物質（還原糖），從而導致發酵產物中還原糖含量的增加。

2.2 發酵產物中蛋白質和氨基酸的含量分析

表2 玉米發酵產物中蛋白質和氨基酸的組成與含量

從表2可以看出，玉米經雙孢蘑菇固態發酵后，發酵產物中的氨基酸含量與對照存在顯著性差異（P＜0.05），發酵產物中的氨基酸種類更加齊全且氨基酸的總量增加，為8.29 g/100 g；色氨酸含量由0增加到0.07 g/100 g。除此之外，發酵產物中的粗蛋白和水溶性蛋白含量與對照相比均存在顯著性差異（P＜0.05），發酵產物中的粗蛋白含量由8.25 g/100 g增加到9.13 g/100 g，水溶性蛋白含量由1.82 g/100 g增加到4.32 g/100 g。由表3可知，玉米經雙孢蘑菇固態發酵后,氨基酸總量、必需氨基酸總量和必需氨基酸總量/氨基酸總量均顯著增加。由此可知，玉米經雙孢蘑菇固態發酵后，不僅豐富了氨基酸的種類，也提高了蛋白質的含量。

表3 玉米發酵產物中氨基酸的組成與含量

2.3 蛋白質的氨基酸評分分析

依據1.8方法的評價標準，氨基酸評分為試驗蛋白質中某一必需氨基酸占世界衛生組織（World Health Organization，WHO）/FAO評分模式中相應氨基酸含量的百分比。AAS值越接近100，反映食物蛋白與人體蛋白越接近，蛋白質的營養價值也就越高[19]。玉米經雙孢蘑菇發酵30 d后蛋白質的氨基酸評分如表4所示。

表4 玉米發酵產物蛋白質的氨基酸評分（AAS）

由表4可知，玉米經雙孢蘑菇固態發酵后蛋白質的氨基酸評分明顯高于對照組的氨基酸評分。對照組中，亮氨酸和苯丙氨酸+酪氨酸的評分均超過100，而氨基酸評分為0，第1限制氨基酸為色氨酸，第2限制氨基酸為蛋氨酸＋半胱氨酸。研究表明，蛋白質的營養價值不僅取決于蛋白質的含量，還與氨基酸的種類、必需氨基酸的組成及比例、限制氨基酸的最低含量等有關[20]。然而，對照組的氨基酸種類不僅不齊全，而且組成比例非常不均衡，由此說明對照組的營養價值較低。玉米經雙孢蘑菇發酵后，除了含硫的氨基酸評分低于對照組，其余氨基酸評分基本高于對照組。結果表明，玉米經雙孢蘑菇發酵后，玉米蛋白中缺少的色氨酸不僅被得到彌補，而且使得蛋白質的營養價值得到提高。

2.4 蛋白質的EEI，NI及CD分析

蛋白質的營養價值與蛋白質的氨基酸組成密切相關，其在被人體消化吸收時，食物蛋白質的氨基酸組成越接近人體蛋白質的組成，其營養價值越高[21]。由表5可知，發酵產物蛋白質的EEAI，NI和CD均高于對照組，表明玉米經雙孢蘑菇固態發酵后，產物中蛋白質的氨基酸模式與人體蛋白質的組成更接近，蛋白質在體內的消化吸收利用程度被提高，蛋白質的營養價值被提高。

表5 玉米發酵產物蛋白質的EEAI，NI及CD

3 討論

隨著生活水平的逐步提高，人們對飲食健康越來越重視，谷物成為現代人青睞的保健食品，在現代綠色保健食品中占有重要地位。它能有效彌補因長期進食高脂肪、高蛋白、高熱能食品而導致的在維生素、膳食纖維等方面的攝入不足，使飲食結構更為合理[22]。但是，由于玉米中缺少色氨酸和賴氨酸，導致玉米的營養價值不能被人體充分吸收利用。

玉米經雙孢蘑菇固態發酵后，淀粉、總糖和總膳食纖維的含量顯著降低（P＜0.05），還原糖含量顯著增加（P＜0.05），這主要是因為雙孢蘑菇菌絲體在生長過程中消耗谷物的營養物質，產生高活性的碳水化合物水解酶（α-淀粉酶、纖維素酶和β-葡萄糖苷酶），使得淀粉、總糖和總膳食纖維在碳水化合物水解酶的作用下被分解成還原糖和其他的小分子物質，最終導致還原糖的含量顯著增加。

玉米經雙孢蘑菇固態發酵后，與對照相比，產物中的水溶性蛋白和粗蛋白含量均增加了，氨基酸和必需氨基酸總量也增加了。此外，發酵后氨基酸的種類更加齊全，營養更加豐富。HAN[17]用猴頭菇（Hericium erinaceum）固態發酵玉米粉，結果表明，玉米粉經猴頭菇固態發酵后，由于猴頭菇具有合成氨基酸的能力，玉米粉中色氨酸和賴氨酸含量得到顯著提高；由于發酵過程中產生α-淀粉酶而導致淀粉被降解。DE TEMMERMAN等[23]研究整粒玉米經發酵后，某些維生素的含量有所增加。除此之外，大米和黑鷹嘴豆混合發酵后，蛋氨酸含量也顯著增加。本試驗結果表明，利用雙孢蘑菇固態發酵后，谷物中氨基酸的含量和營養價值均得到顯著提高。這主要是在發酵期間，雙孢蘑菇分解谷物中蛋白質的同時又利用分解的產物合成自身蛋白質。

利用雙孢蘑菇固態發酵可以提高谷物中某些必需氨基酸的含量，改變谷物食品的營養價值，并可以使某些不易消化的大分子物質水解成易于人體吸收的小分子物質。因而，利用一些食用真菌通過固態發酵將谷物轉變成多種特殊功能的食品，這對谷物食品的開發與利用具有重要意義。

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《山西農業科學》編輯部

Effect of Solid-state Fermentation withAgaricus bisporus on Nutritional Ingredient of Corn

LIUHongyan，ZHAI Feihong，HANJianrong
（College ofLife Science，Shanxi University，Taiyuan 030006，China）

In this study,the effect of solid-state fermentation with Agaricus bisporus on carbohydrates and proteins of corn were studied.Further,the paper evaluated the nutritional values of fermentation products based on amino acid score（AAS）,essential amino acid index（EEAI）and nutritional index（NI）.The results showed that after solid-state fermentation of 30 days,the starch content in the product decreased from 57.64 g/100 g to 49.93 g/100 g,the total sugar content decreased from 58.51 g/100 g to 51.22 g/100 g,the total dietary fiber content decreased from 21.75 g/100 g to 17.49 g/100 g,the reducing sugar content increased from 9.63 g/100 g to 14.29 g/100 g,the crude protein increased from 8.25 g/100 g to 9.13 g/100 g and the water soluble protein content increased from 1.82 g/100 g to 4.32 g/100 g.The fermentation products contained a wide variety of amino acids and the amino acid composition was close to the WHO/FAO recommended ideal pattern,AAS,EEAI and NI were higher than those in the control group,in which methionine and cysfine being the first limiting amino acids and lysine being the second limiting amino acid.Using egg protein as a standard,the protein offermentation products was closer tothe chicken protein.These results showed that the protein nutritional value ofthe fermention products was superior tothe nonfermented control.

Agaricus bisporus;corn;carbohydrates;protein

TQ920.6

：A

：1002-2481（2017）06-0918-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.06.14

2017-01-20

山西省煤基重點科技攻關項目（FT2014-03-15）

劉紅艷（1990-），女，山西交城人，在讀碩士，研究方向：資源微生物。韓建榮為通信作者。