氟對小鼠MC3T3-E成骨細胞內Ca2+，NO濃度的影響

邢艷剛，張丹丹，張文艷，周文麗，閻小艷，5

（1.山西農業大學動物科技學院，山西太谷030801；2.山西省農業科學院，山西太原030031；3.深圳大學生物科技學院，廣東深圳518000；4.華南師范大學生物科技學院，廣東廣州510000；5.山西醫科大學公共衛生系，山西太原030001）

氟對小鼠MC3T3-E成骨細胞內Ca2+，NO濃度的影響

邢艷剛1，張丹丹2，張文艷3，周文麗4，閻小艷1，5

（1.山西農業大學動物科技學院，山西太谷030801；2.山西省農業科學院，山西太原030031；3.深圳大學生物科技學院，廣東深圳518000；4.華南師范大學生物科技學院，廣東廣州510000；5.山西醫科大學公共衛生系，山西太原030001）

為了探究不同濃度的氟化鈉對小鼠MC3T3-E成骨細胞內Ca2+，NO濃度以及細胞凋亡的影響，建立細胞梯度染氟模型，獲取MTT細胞增殖曲線；通過DAPI和HE染色觀察細胞核及細胞形態學變化；運用熒光探針Fluo-3 AM和DAF-FMDA標記染氟成骨細胞，采用流式細胞儀測定成骨細胞內Ca2+，NO濃度變化。結果表明，隨著氟濃度的增加，細胞形態異常，細胞增殖率降低，成骨細胞內Ca2+，NO的濃度增加，高氟長時間作用會使細胞生命活性降低，生理反應減弱或缺失，從而影響Ca2+，NO的濃度。試驗證明，高氟通過增加細胞內Ca2+，NO的濃度抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡。

氟；成骨細胞；Ca2+；NO

氟是機體維持正常新陳代謝不可缺少的微量元素之一，但如果長期攝入過量氟會使機體發生氟中毒。氟中毒是一種慢性全身性疾病，主要形成氟斑牙和氟骨癥[1]。慢性氟中毒可引發骨硬化、骨軟化、骨質疏松、軟組織化骨以及軟骨和關節等不同性質的病變[2-4]。氟對骨骼系統的損害作用已經得到廣泛認可，但是關于高氟致成骨細胞凋亡機制仍不清楚。Ca2+和NO在引發細胞凋亡過程中具有重要的信號分子作用，國內外的一些文獻對此都有論述，GAO等[5]、馬軼杰等[6]、CHAO等[7]、ELROD等[8]、SHARP等[9]、LIU等[10]都已探討過鈣離子和NO對細胞的作用，但Ca2+和NO在氟致成骨細胞毒性中起什么作用及其機制尚不清楚。

本試驗通過建立氟對成骨細胞作用的體外模型，運用MTT法測定氟對成骨細胞增殖的影響，通過HE和DAPI染色觀察氟對成骨細胞形態，用熒光探針Fluo-3 AM和DAF-FM DA標記染氟成骨細胞的流式細胞術檢測氟致小鼠成骨細胞內Ca2+和NO的濃度變化，以探究氟誘導的小鼠成骨細胞凋亡過程中Ca2+，NO的濃度變化。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 細胞株MC3T3-E1 Subclone 14小鼠顱頂前骨細胞亞克隆14細胞株（中國科學院細胞庫）。

1.1.2 主要溶液胎牛血清，DMEM培養基，0.5% MTT，無Ca2+和Mg2+的無菌PBS緩沖液，DAF-FM DA稀釋液，Fluo-3 AM。

1.2 試驗方法

1.2.1 氟對成骨細胞作用的體外模型的影響用含有10%胎牛血清培養基培養MC3T3-E1 Subclone 14小鼠顱頂前骨細胞亞克隆14細胞，置于5%CO2培養箱，每3 d換液一次。細胞密度大于95%時，用含有0.02%EDTA的0.25%胰酶消化，傳代培養。待細胞貼壁后，進行后續測定。

1.2.2 氟對小鼠成骨細胞形態的影響細胞以1×105個/mL接種于24孔培養板，每孔1 mL。48 h后棄舊培養液，PBS洗滌，換不同質量濃度NaF（0，5，10，30 mg/L）處理，72 h后進行HE和DAPI染色。分別在相差顯微鏡和熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 MTT法測成骨細胞增殖率貼壁細胞以1×105個/mL接種于96孔板，不同質量濃度NaF（0，1，5，10，30 mg/L）處理，隔天換液。分別于藥物處理24，48，72，96 h后加入0.5%MTT，20 μL/孔，繼續培養4 h，加入二甲基亞砜（DMSO），用自動酶標儀570 nm處測定OD值。

1.2.4 氟誘導對小鼠成骨細胞Ca2+，NO水平的影響細胞接種于含10%胎牛血清培養液中。細胞貼壁后，不同質量濃度NaF（0，5，10，30 mg/L）作用72 h后，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，調整其濃度為1×106個/mL。Ca2+和NO測定分別加入10 μL Fluo-3 AM稀釋液和10 μL DAF-FMDA稀釋液混勻；37℃避光孵育20 min；1 h內用流式細胞儀檢測熒光強度。

2 結果與分析

2.1 氟誘導對小鼠成骨細胞形態的影響

2.1.1 HE染色由圖1可知，對照組細胞形態自然，細胞核完整呈卵圓形；5 mg/LNaF作用72 h后，對成骨細胞影響不明顯，少數細胞的胞質濃縮（圖2）；當10 mg/LNaF作用時，一些細胞出現了明顯的胞質濃縮（圖3）；當高濃度30 mg/L NaF作用時表現出明顯的毒性，很多細胞核膜破裂（圖4）。

2.1.2 DAPI染色由圖5可知，對照組細胞核完整，細胞生長旺盛；5 mg/LNaF作用72 h后，對細胞影響不明顯，少數細胞的胞核固縮（圖6）；10 mg/L NaF作用后，一些細胞細胞核固縮，有少量核分裂（圖7）；30 mg/LNaF作用時，表現出明顯的毒性，很多細胞核固縮，核分裂，有凋亡小體的形成（圖8）。

2.2 氟對體外培養小鼠成骨細胞增殖的影響

氟作用24，48，72 h后，較高質量濃度的氟（30 mg/L）對成骨細胞增殖率有明顯抑制作用，且差異極顯著（P＜0.01）；10 mg/L氟作用24，48，72 h后，也明顯抑制成骨細胞的增殖（P＜0.05）；而較低質量濃度的氟（1，5 mg/L）對成骨細胞的增殖沒有明顯影響。作用96 h后，5，10，30 mg/L氟均表現出明顯的抑制作用，且差異極顯著（P＜0.01），隨氟濃度的增加抑制作用增強（表1）。

表1 氟對成骨細胞增殖（M77法）的影響

2.3 氟誘導對小鼠成骨細胞Ca2+水平的影響

流式細胞儀檢測結果顯示，經5 mg/L氟化鈉處理72 h后，細胞熒光強度明顯增加，大約是對照組的3倍；10，30 mg/L氟化鈉處理的細胞熒光強度也有所增加，約為對照組的1.5倍，但不明顯（圖9），可能是由于成骨細胞在高氟的長時間作用下，細胞活性降低，生理反應減弱或缺失，說明氟化鈉可誘導成骨細胞胞內Ca2+水平升高。

2.4 氟誘導體外培養小鼠成骨細胞NO的分析

流式細胞儀檢測，經5，30mg/L氟化鈉處理72 h后，成骨細胞發出了亮綠色的熒光，與對照組相比，約為對照組的1.2倍。10 mg/L處理72 h后熒光強度明顯較對照組增強，約為對照組的2倍（圖10）。說明氟化鈉可誘導成骨細胞胞內NO水平升高。

3 討論

3.1 氟誘導對小鼠成骨細胞形態的影響

成骨細胞是氟進入機體的主要靶細胞之一，近年來研究表明，長期氟暴露對成骨細胞增殖會產生一定影響[11]，但Ca2+和NO對成骨細胞的影響機制仍不清楚。本試驗中，通過建立成骨細胞染氟模型（0，5，10，30 mg/L），觀察成骨細胞形態的變化。隨著氟濃度的升高，小鼠成骨細胞的病理損傷逐漸加重，高氟組損傷最明顯，胞膜破裂，胞質濃縮、核膜破裂，核固縮。DAPI染色顯示，隨著氟濃度的升高，小鼠成骨細胞發生了顯著的細胞核變，高氟組大多數細胞核固縮，核分裂，有凋亡小體的形成，表明高氟能誘導細胞發生明顯凋亡跡象。

3.2 氟對體外培養小鼠成骨細胞增殖的影響

郭曉東等[12]利用氟誘導成骨細胞MC3T3-E1，表明氟能明顯抑制成骨細胞MC3T3-E1增殖、誘發細胞凋亡，其抑制作用呈時間、劑量依賴性。本試驗利用MTT法檢測成骨細胞生長情況，結果表明，氟短期作用成骨細胞時，低劑量氟對細胞的增殖沒有影響，高劑量的氟對成骨細胞主要表現為抑制作用。隨著染氟時間的延長，低劑量氟對成骨細胞的增殖也出現抑制的情況。說明氟對成骨細胞的增殖作用呈現時間相關性。

3.3 氟誘導對小鼠成骨細胞Ca2+水平的測定

Ca2+作為一種重要的第2信使，在細胞生命活動中起著非常重要的作用，胞漿或線粒體內Ca2+超載是導致細胞凋亡的起始因素，同時通過直接或間接激活可觸發細胞凋亡多種酶，引起細胞凋亡。通常，逆境脅迫可導致胞內Ca2+濃度升高，而高濃度的Ca2+又導致細胞活性降低，甚至凋亡[13]。王俊玲等[14]對氟致神經細胞凋亡的研究表明，過量氟會刺激Ca2+濃度增多。本試驗表明，在NaF處理后，成骨細胞內Ca2+濃度顯著升高，可能是因為NaF進入細胞后激活了質膜上的Ca2+通道，導致胞外Ca2+內流，胞內較高Ca2+濃度可激活Ca2+依賴性酶，使DNA發生斷裂，細胞骨架破壞，最終誘導細胞凋亡；或者通過誘導胞內ROS上升使細胞凋亡。此外，Ca2+還可通過刺激PTP開放或cyt c釋放，進而激活下游的細胞凋亡途徑，導致細胞死亡[15]。本試驗檢測細胞內Ca2+濃度的升高或下降可引起細胞凋亡，由此推測，Ca2+濃度失衡是氟誘導成骨細胞凋亡的重要原因。氟致成骨細胞凋亡發生在Ca2+濃度失衡的狀況下。

3.4 氟誘導體外培養小鼠成骨細胞NO的分析

NO是骨重構過程中一個重要的信號分子，它既可作用于破骨細胞抑制骨吸收，還可以作用于成骨細胞促進骨形成，NO是L-精氨酸和分子氧在NOS作用下生成的一種自由基，在很多生理或病理過程中起著信號分子的作用。很多研究表明，氟誘導可使細胞內NO濃度增加。LOREDANA等[16]研究了氟致成骨細胞毒性作用；MESQUITA等[17]研究發現，H2O2誘導的酵母細胞凋亡過程中NO水平顯著升高；顏凌等[18]研究表明，小膠質細胞活化后導致細胞內ROS、培養液內NO含量增加，且與時間、劑量相關。本試驗利用NO熒光指示劑DAF-FMDA檢測了成骨細胞內的NO水平，結果發現，經10 mg/L氟化鈉作用72 h后，成骨細胞內NO水平顯著升高，可能是由于氟化鈉進入生物體內，誘導線粒體內Ca2+濃度升高，激活NOS，NOS在誘導刺激下催化L-精氨酸能力加強，迅速產生大量的NO，最終導致胞內NO水平升高。表明氟在誘導成骨細胞凋亡的過程中，NO的升高產生重要作用。

4 結論

本研究在模擬氟中毒試驗中，通過對小鼠成骨細胞進行HE和DAPI染色，結果發現，隨著氟濃度的升高，小鼠成骨細胞的胞質和細胞核均發生了顯著的病理變化；同時發現，高濃度的氟可以導致胞質形變及細胞核固縮或分裂，形成凋亡小體。高氟的刺激，使成骨細胞做出應激反應，使細胞內Ca2+，NO的濃度增加，證明氟作用小鼠成骨細胞，通過增加Ca2+，NO的濃度誘導細胞凋亡，而氟長時間的作用導致細胞凋亡甚至失去應激能力，無法產生Ca2+，NO。總之，高氟會對成骨細胞造成一定的損傷，誘導細胞凋亡，并且Ca2+，NO在此過程中起著重要的作用。但是Ca2+，NO誘導細胞凋亡的具體途徑還不清楚以及氟誘導成骨細胞凋亡的主要途徑還有待探究。

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Effects of Fluorine on the Concentration of Ca2+and NO in MC3T3-E Osteoblast of Mice

XINGYangang1，ZHANGDandan2，ZHANGWenyan3，ZHOUWenli4，YANXiaoyan1，5
（1.College ofAnimal Science and Technology，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China；2.Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Taiyuan 030031，China；3.College ofBiological Science and Technology，Shenzhen University，Shenzhen 518000，China；4.College ofBiological Science and Technology，Huanan Normal University，Guangzhou 510000，China；5.Department ofPublic Health，Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China）

To explore the effects ofdifferent concentrations ofsodium fluoride on the cell morphology,the concentration of Ca2+and NO in mice MC3T3-E osteoblast,the sodium fluoride concentration gradient model was established.According to the growth curve of MTT,the effect offluoride on the proliferation ofosteoblasts was determined.DAPI and HE stainingwere used toobserve the nucleus and morphology changes.Using fluorescent probes Fluo-3 AM and DAF-FM DA labeled with fluoride osteoblasts and changes in the concentration of Ca2+and NO in osteoblasts were tested by flow cytometry.The results showed that with the increase of fluoride concentration,the cell proliferation rate decreased and the cell morphology was more variable,cytoplasmic condensation and nuclear condensation.The concentration of NO and Ca2+in osteoblast increased.The long time effect of high fluoride can decrease the activity of cell and the physiological reaction,which can affect the concentration of Ca2+and NO.This study suggests that high concentration of fluoride can inhibit cell proliferation,change the cell morphology and cell apoptosis by increasing the concentration ofCa2+and NO in the cell.

fluorine;osteoblasts;Ca2+;NO

R599.9

：A

：1002-2481（2017）06-0940-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.06.19

2017-05-04

國家自然科學基金項目（31240009，31302158）；山西省回國留學人員科研資助項目（2012-079）；山西省科技廳軟科學項目（2013041084-03）

邢艷剛（1989-），男，山西太原人，在讀碩士，研究方向：動物營養代謝調控與食品質量安全。閻小艷為通信作者。