辣椒炭疽病菌抗啶氧菌酯突變體滲透壓敏感性及交互抗性

石玉星，曹俊宇，任璐，2，劉慧平

（1.山西農業大學農學院，山西太谷030801；2.農業有害生物綜合治理山西省重點實驗室，山西太原030031）

辣椒炭疽病菌抗啶氧菌酯突變體滲透壓敏感性及交互抗性

石玉星1，曹俊宇1，任璐1，2，劉慧平1

（1.山西農業大學農學院，山西太谷030801；2.農業有害生物綜合治理山西省重點實驗室，山西太原030031）

為了探討辣椒炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides敏感菌株與抗啶氧菌酯突變體對滲透壓敏感性的差異，室內誘導獲得了C.gloeosporioides對啶氧菌酯的抗性突變體，在此基礎上，對其抗感菌株滲透壓敏感性及交互抗性進行了研究。結果表明，抗感菌株在供試葡萄糖濃度下均可生長，相比無糖培養基，在含有葡萄糖的培養基上菌落直徑顯著增加；隨著培養基中NaCl濃度的升高，抗感菌株菌絲生長均受到抑制，且敏感菌株與不同抗性水平抗性突變體對高濃度NaCl滲透壓均敏感，但滲透壓敏感性沒有顯著差異。啶氧菌酯與嘧菌酯、醚菌酯、多菌靈、咪鮮胺的交互抗性測定結果顯示，啶氧菌酯與同屬甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的嘧菌酯、醚菌酯之間存在正交互抗性，與多菌靈、咪鮮胺之間均無交互抗性產生。該研究結果可為指導生產中合理用藥提供理論依據。

辣椒炭疽病菌；啶氧菌酯；滲透壓敏感性；交互抗性

辣椒既有一年生植物也有多年生植物，一般在溫帶多為一年生草本植物，而在熱帶是多年生灌木[1]。辣椒是一種大眾化蔬菜和調味品，是山西省蔬菜產業的主要栽培項目之一[2]。目前，國內對其研究報道主要集中在栽培技術、品種比較、病害防治以及生理等方面[3-6]。辣椒炭疽病是辣椒生產中一種常發病害，對辣椒果實的危害尤為嚴重，導致辣椒腐爛，失去經濟價值[7]。目前，生產上運用化學殺菌劑防治辣椒炭疽病在其病害綜合防治中占有重要地位，常用殺菌劑主要有芳烴類、有機硫類及苯并咪唑類殺菌劑等。由于殺菌劑的過量使用及不合理使用導致炭疽病菌對多種常用殺菌劑已產生較高水平的抗藥性[8]，而病原菌一旦產生抗藥性，藥劑的防治效果會顯著下降[9]。李洋等[10]就遼寧省葡萄炭疽菌對多菌靈敏感性測定結果顯示，某些地區已產生了抗性水平較高的菌株。葉佳等[11]對浙江地區的葡萄炭疽菌群體進行抗藥性研究，發現該病菌對甲基硫菌靈敏感性降低，表現出一定程度的抗藥性。上述報道進一步說明，由于該類殺菌劑的施用，已出現某些植物病原菌對其敏感性下降的現象[12]。

啶氧菌酯（Picoxystrobin）是甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑中內吸活性最強的，主要用于防治麥類的葉面病害如葉枯病、葉銹病、白粉病等，以及辣椒炭疽病、葡萄黑痘病等經濟作物病害。啶氧菌酯通過抑制細胞線粒體氧化呼吸所必經的細胞色素b和c1之間的電子轉移來阻斷生物的呼吸路徑，從而起到殺菌效果[13]。目前，國內對啶氧菌酯抗藥性的相關報道還很鮮見。

山西農業大學農學院蔬菜病害化學防治課題組在山西省范圍內采集分離的辣椒炭疽病菌經鑒定主要由Colletotrichum gloeosporioides和Colletotrichum capsici引起。啶氧菌酯作為甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑中的新品種，抗藥性分子突變位點單一，抗藥性風險較高，且啶氧菌酯還未在山西省的辣椒產區廣泛應用，因此，本研究在誘導辣椒炭疽病菌對啶氧菌酯抗性突變體的基礎上，對其抗感菌株滲透壓敏感性及交互抗性進行研究，旨在為指導生產中合理用藥提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試病原菌在山西省晉中市3個未使用過甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的辣椒種植區采集、分離并純化獲得45株辣椒炭疽病菌，經鑒定為Colletotrichum gloeosporioides。敏感菌株經過室內誘導得到6株低抗突變體和2株中抗突變體。

1.1.2 供試藥劑95%啶氧菌酯（Picoxystrobin）原藥：湖北健源化工有限公司，用丙酮制成10000μg/mL的母液，4℃保存備用。

嘧菌酯（Azoxystrobin）：陜西恒田化工有限公司，有效成分為250 g/L懸浮劑，采用無菌水配成10 000 μg/mL母液，4℃保存備用。

醚菌酯（Kresoxim-methyl）：陜西恒田化工有限公司，有效成分為250 g/L懸浮劑，用無菌水配成10 000 μg/mL母液，4℃保存備用。

90%多菌靈（Carbendazim）：四川國光農化有限公司，可濕性粉劑，用無菌水配成1 000 μg/mL母液，4℃保存備用。

25%咪鮮胺（Prochloraz）：河北省農藥化工有限公司，用無菌水配成1 000 μg/mL的母液，4℃保存備用。

1.1.3 培養基馬鈴薯葡萄糖培養基（PDA）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15～17 g、水1 000 mL。

含藥培養基：若為原藥先用適量丙酮溶解，之后用蒸餾水配制成10 mg/mL或1 mg/mL的母液（若為制劑則可直接用蒸餾水配制成10 mg/mL或1 mg/mL的母液），用時再用無菌水配制成適合的濃度，按照藥劑與培養基1∶9的比例進行稀釋，輕輕搖晃混勻即可得到含藥培養基（加藥時應先冷卻培養基至50℃左右，以防藥劑在高溫中不穩定）。

1.2 方法

1.2.1 抗感菌株滲透壓敏感性測定選取敏感菌株JX3，SN13，YZ6與抗性突變體JX3R2，SN13R1，YZ6R2，JX3MR3，YZ6MR4共8株，采用菌絲生長速率法進行滲透壓敏感性測定。

在PDA培養基中加入所需濃度的葡萄糖或NaCl，使得培養基中葡萄糖終質量濃度為10，20，40，80，100 g/L，NaCl終質量濃度為10，20，40，60，80 g/L。在已活化7 d的抗感菌株的菌落邊緣打取直徑5 mm的菌餅，分別接入含梯度濃度葡萄糖及NaCl的PDA平板上，每處理設3次重復，放置到25℃恒溫培養箱中培養。6 d后，用十字交叉法測量其菌落直徑（cm）。

1.2.2 交互抗性測定選取敏感菌株JX1，JX3，JX8，JX11，SN5，SN7，SN13，YZ3，YZ6，YZ13和抗性突變體JX3R1，JX3R2，SN13R1，YZ6R1，YZ6R2，YZ6R3，共16株，采用菌絲生長速率法，分別測定對醚菌酯、嘧菌酯、多菌靈和咪鮮胺的敏感性（EC50），用SPSS統計軟件（IBMSPSSStatistics 20）計算相關系數r值和顯著水平P值，分析啶氧菌酯與供試藥劑兩兩間是否存在交互抗性。

2 結果與分析

2.1 抗感菌株的滲透壓敏感性測定

表1 不同葡萄糖質量濃度下抗感菌株菌落直徑cm

從表1可以看出，抗感菌株在供試葡萄糖質量濃度下均可生長，相比無糖培養基，在含有葡萄糖的培養基上菌落直徑顯著增大，說明葡萄糖在質量濃度小于100 g/L時，其提供營養的作用大于滲透抑制作用。親本菌株JX3，SN13，YZ6與低抗突變體SN13R1，YZ6R2均在葡萄糖質量濃度為80 g/L的培養基中，菌落直徑最大，而低抗突變體JX3R2和中抗突變體JX3MR3，YZ6MR4分別在葡萄糖質量濃度為40，10 g/L時最大。

由表2可知，抗感菌株菌落直徑均隨NaCl質量濃度升高而呈現顯著下降的趨勢。當NaCl質量濃度為60 g/L時，抗感菌株菌落直徑均非常小；當NaCl質量濃度為80 g/L時，供試抗感菌株均不能生長。說明敏感菌株與不同抗性水平突變體對高鹽濃度滲透壓均都很敏感。

表2 不同NaCl質量濃度下抗感菌株菌落直徑cm

2.2 交互抗性測定

參照范子耀等[14]、馬建英等[15]的方法，進行線性回歸分析，由圖1可知，啶氧菌酯與其他4種藥劑（咪鮮胺、多菌靈、嘧菌酯、醚菌酯）的顯著水平P值分別為0.178，0.117，0.000和0.000。多菌靈和咪鮮胺的P值均大于0.05，在5%水平上差異不顯著，說明啶氧菌酯與這2種殺菌劑之間不存在交互抗性。嘧菌酯和醚菌酯的P值均小于0.05，在5%水平上差異顯著，說明啶氧菌酯與這2種殺菌劑之間存在正交互抗性。

3 結論與討論

ELLIS等[16]研究顯示，產生抗藥性可能會影響滲透壓的調節能力。因此，本試驗制成含不同質量濃度NaCl和葡萄糖的PDA培養基用以模擬滲透壓變化的環境，以此來衡量抗感菌株滲透壓調節能力的大小。結果表明，相比無糖培養基，在含有葡萄糖的培養基上菌落直徑會明顯增加，說明了葡萄糖在質量濃度低于100 g/L時，其提供營養作用大于滲透抑制作用，且抗感菌株對于葡萄糖滲透壓變化均不敏感。而在高鹽環境下，抗感菌株菌落直徑相比無鹽環境均明顯受到抑制。這一結果與ELLIS等[16]報道的病原菌在滲透壓較高的情況下，需要消耗大量能量用以合成甘油來保持細胞膨壓，從而度過高滲透壓這種極端環境，因此，病原菌本身生長就被抑制這一結果相一致。

通過對啶氧菌酯與咪鮮胺、多菌靈、嘧菌酯與醚菌酯4種藥劑的交互抗性研究表明，啶氧菌酯與醚菌酯、嘧菌酯這2種同屬甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑之間存在正交互抗性，與甾醇合成抑制劑殺菌劑咪鮮胺及苯并咪唑類殺菌劑多菌靈等作用機理不同的殺菌劑之間沒有交互抗性。因此，在生產中應該注意避免啶氧菌酯與同類殺菌劑同時或連續使用，建議與不同作用機制殺菌劑交替使用，延緩抗藥性的產生，延長藥劑的使用壽命。

［1］鄒學校，王鳴，郭家珍，等.中國辣椒[M].北京：中國農業出版社，2002.

［2］成妍，馬蓉麗，焦彥生，等.辣椒游離小孢子培養研究進展[J].山西農業科學，2012，40（3）：288-291.

［3］喬寧，馬蓉麗，王瑞麗，等.辣椒疫病的發生及抗性研究進展[J].山西農業科學，2016，44（6）：885-888.

［4］柴文臣，馬蓉麗，焦彥生，等.低溫脅迫對不同辣椒品種生長及生理指標的影響[J].華北農學報，2010，25（2）：168-171.

［5］陳世軍，韋美玉.外源NO對辣椒幼苗生長及生理特性的影響[J].河南農業科學，2009（4）：97-101.

［6］段曦，魏佑營，曹克友，等.低溫弱光脅迫及恢復過程對CMS三系辣椒幼苗保護酶活性與滲透調節物質的影響[J].天津農業科學，2012，18（1）：11-15.

［7］劉忠，宋滿剛.辣椒炭疽病的發生及綜合防治技術[J].內蒙古農業科技，2007（7）：11-16.

［8］汪曉紅，潘萬明，陳茜.啶氧菌酯250克/升懸浮劑防治辣椒炭疽病、葡萄黑痘病田間試驗研究[J].農藥科學與管理，2012，33（8）：59-62.

［9］OU J F，TU H，SHAN B，et al.Unsaturated fatty acids inhibit transcription of the sterol regulatory element-binding protein-1c（SREBP-1c）gene by antagonizing ligand-dependent activation of the LXR[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，2001，98（11）：6027-6032.

［10］李洋，劉長遠，陳秀蓉，等.遼寧省葡萄炭疽菌鑒定及對多菌靈敏感性研究[J].植物保護，2009，35（34）：74-77.

［11］葉佳，張傳清.葡萄炭疽病菌對甲基硫菌靈、戊唑醇和醚菌酯的敏感性檢測[J].農藥學學報，2012，14（1）：111-114.

［12］YOUNG J R.Two mutations in β-tubulin 2 gene associated with thiophanate-methyl resistance in Colletotrichum cereale isolates from creeping bentgrass in Mississippi and Alabama[J].Plant Disease，2010，94（2）：207-212.

［13］BARTLETT D W，CLOUGH J M，GODWIN J R.The strobilurin fungicides[J].Pest Management Science，2002，58（7）：648-663.

［14］范子耀，孟潤杰，韓秀英，等.馬鈴薯早疫病菌對咯菌腈的敏感基線及其對不同藥劑的交互抗性[J].植物保護學報，2012，39（2）：155-156.

［15］馬建英，張小風，王文嬌，等.灰葡萄孢霉Botrytis cinerea對啶菌惡唑的敏感性和不同殺菌劑的交互抗性[J].植物保護學報，2009，36（1）：63.

［16］ELLIS S W，GRINDLE M.Effect of osmotic stress on yield and polyolcontent of discarboximides sensitive and resistant of Neurospora crassa[J].Mycol Res，1991，95（4）：457-464.

Osmotic Pressure Sensitivity and Cross-resistance ofColletotrichum gloeosporioidesResistant Mutants to Picoxystrobin

SHI Yuxing1，CAOJunyu1，RENLu1，2，LIUHuiping1
（1.College ofAgronomy，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China；2.Shanxi Province KeyLaboratoryofIntegrated Pest Management in Agriculture，Taiyuan 030031，China）

To investigate the osmotic pressure sensitivity of Colletotrichum gloeosporioides picoxystrobin-resistant mutants and sensitive strains,the research induced and obtained C.gloeosporioides resistant mutants to picoxystrobin.On this basis,the osmotic pressure sensitivity and the cross-resistance were studied.The results showed that all isolates could growwell on the PDA medium with all of glucose concentrations and the colony diameters increased obviously in the medium containing glucose compared with no glucose. But all isolates grew poor with the increase of NaCl concentration and both resistant and parent sensitive isolates were sensitive to high NaCl concentration.The results of cross-resistance showed that picoxystrobin had positive cross-resistance with azoxystrobin and kresoxim-methyl,while no cross-resistance was detected between picoxystrobin and other type fungicides,such as carbendazim and prochloraz.The research results provide theoretical basis for the guidance of pesticides use in production.

Colletotrichum gloeosporioides;picoxystrobin;osmotic pressure sensitivity;cross-resistance

S436.418.1＋1

：A

：1002-2481（2017）06-1002-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.06.34

2017-01-13

農業有害生物綜合治理山西省重點實驗室開放課題（YHSW2015002）

石玉星（1993-），女，山西臨汾人，在讀碩士，研究方向：農藥毒理與生物農藥。劉慧平為通信作者。