植物乳桿菌SCP53生物膜的形成條件

張國麗，彭瑤，魏露，余茜，敖曉琳*，劉書亮，趙珂

1(四川農業大學 食品學院，四川 雅安，625000) 2(四川農業大學 資源環境學院，四川 成都，611100)

植物乳桿菌SCP53生物膜的形成條件

張國麗1，彭瑤1，魏露1，余茜1，敖曉琳1*，劉書亮1，趙珂2

1(四川農業大學 食品學院，四川 雅安，625000) 2(四川農業大學 資源環境學院，四川 成都，611100)

研究了不同狀態下植物乳桿菌SPC53生物膜形成能力的情況。通過改變其生長的環境條件與營養狀況，采用結晶紫染色法和掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)觀察，定量及定性分析其生物膜的形成。結果表明：接種量5×107CFU/mL，培養時間36 h，培養溫度42 ℃，pH值5.8是植物乳桿菌SCP53生物膜形成的最適培養條件，在MRS肉湯中依次添加200 mg/mL NaCl、75 mg/mL葡萄糖、7.5 mg/mL果膠、75 mg/mL全脂乳粉，可以促進植物乳桿菌生物膜的形成，形成后的生物膜A490值為4.492 3。對照組A490值為0.136 5，掃描電鏡結果顯示生物膜與浮游菌體有明顯差異。

植物乳桿菌；生物膜；形成條件；掃描電鏡

1978年美國學者COSTERTON[1-2]提出了Biofilm這一專有名詞，它主要是由細菌細胞(附著于生物或者非生物實體表面)和包裹著細菌的水合性基質所組成。當細菌受到各種脅迫，如營養缺乏或營養過剩，低pH值，高滲透壓，抗菌劑和抗生素等，在這些不利的環境下，大量的細菌通過自身合成的水合多聚物黏附在固體表面，以固著的方式生長從而形成生物膜。這是細菌所具有的一種非常重要的環境適應機制[3]。

生物膜在食品加工與安全領域具有重要的研究價值[4]。食品工業的原料、食品加工機械表面和管道內以及生產環境中很容易出現生物膜，生物膜的特殊結構可以使其耐受消毒劑的作用而得以殘存，進而再次污染食品，若病原菌殘存，會造成極大的食品安全隱患。另一方面，生物膜的形成能促進有益微生物對不利環境的適應能力，使其具有良好的穩定性[5]，從而可以解決發酵劑在食品中不穩定的問題。如果利用微生物生物膜有利于抵抗環境脅迫壓力，同時可增強種群間的交流合作并影響菌體的行為與代謝這一優勢，通過調控生物膜的形成促進有益微生物聚集，可以提高發酵菌種穩定性與活力，改善發酵食品品質。

植物乳桿菌作為發酵食品中應用非常廣泛的發酵菌種，研究其生物膜形成特性以及后續研究對發酵食品高效、安全的生產具有重要的指導意義。本實驗室前期從泡菜樣品中分離出1株能發酵產生良好泡菜風味的植物乳桿菌，研究其生物膜形成條件，旨在為其后續在發酵食品中的加工利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種：植物乳桿菌(LactobacillusplantarumSCP53，NCBI登錄號：AB617650)。

MRS肉湯、結晶紫、乳酸、檸檬酸、胰蛋白胨、(NH4)2SO4、CaCl2、NaCl、FeCl2、CuSO4等試劑均為國產分析純，果膠、明膠、全脂乳粉等均為市售。

1.2 儀器與設備

3001型酶標儀，Thermo Scientific公司；BPC-250F生化培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；DHG-9245A電熱鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；SW-CJ-1F超凈操作臺，SYQ-DSX-280B壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；PHS-4C+酸度計，成都世紀方舟科技有限公司；D2KW-5-4電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫療儀器有限公司；96孔細胞培養板，Haimen Boyang儀器設備公司；EVO18掃描電鏡，Carl Zeiss公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 生物膜形成菌株的制備

將活化好的植物乳桿菌接入供試培養基，培養基成分及培養條件根據單因素及正交實驗在MRS肉湯培養基基礎上調整。觀察不同條件對植物乳桿菌生物膜形成的影響。

1.3.2 植物乳桿菌生物膜形成的半定量測定

將按比例接種菌株的不同培養基振蕩搖勻后按照每孔200 μL的添加量添加到96孔板中，在一定溫度下培養，以相應等體積空白培養基作為陰性對照。培養結束后將培養液倒出，每孔加入200～300 μL無菌水清除結合不緊密的游離菌體，自然風干后每孔加入0.5%結晶紫染液50 μL，染色30 min后倒掉染液，每孔加入250 μL無菌水洗滌3次。將孔板倒置，風干。然后用酶標儀在490 nm處檢測OD值。以A490值定量生物膜形成量，A490≤0.17時表明無生物膜形成，A490>0.34時表明生物膜大量形成[6]。

1.3.3 植物乳桿菌生物膜形態觀察

將約1 cm×1 cm經過70%酒精浸泡、清潔的蓋玻片置于優化后的培養基中，在最佳培養條件下讓植物乳桿菌自然黏附聚集在玻片上，培養完成之后取出玻片，置于2%戊二醛磷酸緩沖液中，于4 ℃冰箱中固定過夜，次日以磷酸緩沖液沖洗，分別用40%、70%、90%、100%的乙醇依次脫水，每次15 min。脫水后，用醋酸戊酯置換乙醇，再進行干燥、鍍金及掃描電鏡觀察[7]。以MRS肉湯培養基37 ℃下培養36 h作為對照。觀察最佳營養條件及培養條件下生物膜的形成情況。

1.3.4 培養條件對植物乳桿菌生物膜形成的影響

1.3.4.1 單因素試驗

接種量：按照1.3.1的方法，同時參考任曉鏷[8]的方法以5×1010、1×1010、5×109、1×109、5×108、1×108、5×107、1×107CFU/mL接種植物乳桿菌至MRS肉湯培養基，在37 ℃下培養24 h，取出后按照1.3.2的方法測定生物膜形成量。

培養時間：根據不同接種量試驗結果，選取最佳接種濃度接種植物乳桿菌至MRS肉湯培養基中，參照任曉鏷[8]的方法在37 ℃下培養12、24、36、48、60、72 h，取出后按照1.3.2的方法測定生物膜形成量。

溫度：選取最佳接種濃度接種植物乳桿菌至MRS肉湯培養基中，參照任曉鏷[8]的方法分別于8、16、20、28、37、42 ℃培養，培養時間依據前期實驗結果，取出后按照1.3.2的方法測定生物膜形成量。

pH值：選取最佳接種濃度接種植物乳桿菌至pH值分別為2.8、3.8、4.8、5.8、6.8、7.8、8.8、9.8的MRS肉湯培養基[8]，培養溫度和時間依據前期實驗結果，取出后按照1.3.2測定生物膜形成量。

1.3.4.2 正交實驗設計

根據單因素試驗結果，選擇培養溫度、培養時間、培養基pH值、接種量4個因素中合適的水平進行正交試驗，以植物乳桿菌生物膜形成量作為主要考察指標，確定培養條件。

表1 培養條件正交因素水平表

1.3.5 營養條件對生物膜形成的影響

在MRS肉湯中按不同比例替換或添加不同物質，改變營養狀況，以MRS肉湯作為對照組，實驗結果以相對成膜量分析不同物質對其生物膜形成的影響，培養條件采用1.3.4方法中所得的最適培養條件。

(1)

1.3.5.1 單因素試驗

酸類物質：對食品中常用的酸類物質乳酸和檸檬酸進行初篩，添加量均為100 mg/mL；最后選取對生物膜形成影響較大的檸檬酸進行試驗，考察添加量分別為25、50、75、100、125、150、175、200 mg/mL的培養基對植物乳桿菌生物膜形成的影響[9]。

碳源類物質：對葡萄糖、乳糖、淀粉進行初篩，添加量均為100 mg/mL；最后選取對生物膜形成影響較大的葡萄糖進行試驗，考察添加量為25、50、75、100、125、150、175、200 mg/mL的培養基對植物乳桿菌生物膜形成的影響[10]。

氮源類物質：對胰蛋白胨/硫酸銨/乳粉(酪蛋白)進行初篩，添加量均為100 mg/mL；最后選取對生物膜形成影響較大的乳粉進行試驗，考察添加量為25、50、75、100、125、150、175、200 mg/mL的培養基對植物乳桿菌生物膜形成的影響。

金屬離子：對常見的金屬離子Fe2+/Cu2+/Ca2+/Na+進行初篩，添加量均為100 mg/mL；最后選取對生物膜形成影響較大的Na+進行試驗，考察添加量(以NaCl計)為25、50、75、100、125、150、175、200 mg/mL的培養基對植物乳桿菌生物膜形成的影響。

增稠劑：對食品加工中常用的增稠劑果膠、明膠進行初篩，添加量均為10 mg/mL；最后選取對生物膜形成影響較大的果膠進行試驗，考察添加量為2.5、5.0、7.5、10、12.5、15 mg/mL[9]。

1.3.5.2 正交試驗

根據單因素試驗結果，選擇NaCl、葡萄糖、果膠、乳粉4個對植物乳桿菌生物膜影響較大的因素進行正交試驗，以植物乳桿菌生物膜相對形成量作為主要考察指標，確定培養條件。

表2 營養條件正交因素水平表

1.4 數據分析

采用EXCEL2010、SPSS19.0數據分析統計軟件對所得數據進行統計與分析。

2 結果與分析

2.1 不同培養條件對植物乳桿菌生物膜形成的影響

2.1.1 接種量對生物膜形成的影響

不同接種量對生物膜形成能力的影響如圖1所示。不同接種量水平下所測OD值均小于0.17，說明只改變接種量不能明顯促進植物乳桿菌生物膜的形成。接種量為5×107CFU/mL時OD值有最大值，表明該接種量下植物乳桿菌長勢最佳。接種量的大小會對細菌生長產生影響，接種量較大時菌體因缺乏營養物質，不能良好生長，接種量過小則可能會導致延滯期增長，細菌總數過小，為促進菌體聚集，選擇5×107CFU/mL作為后續實驗接種量。

圖1 37 ℃下不同接種量植物乳桿菌生物膜的形成能力Fig.1 Lactobacillus plantarum biofilm formation with different inoculum ratio at 37 ℃(不同小寫字母代表差異顯著，P<0.05)

2.1.2 時間對生物膜形成的影響

生物膜的形成涉及幾個明顯的階段：起始的附著、細胞與細胞之間的吸附與增殖、生物膜的成熟及最后細菌的脫離過程等5個階段[6,11]。本研究中植物乳桿菌SCP53也同樣具有明顯的幾個生物膜形成過程，如圖2所示。生物膜形成前期可能由于附著能力不強，容易被洗脫，形成后期由于其脫離解聚等原因導致成膜量也較低。生物膜在36 h處于成熟時期，具有最大的成膜量，其形成量與其他幾個時間段具有顯著性差異(P<0.05)。

圖2 培養時間對生物膜形成能力的影響Fig.2 Lactobacillus plantarum biofilm formation for different time(不同小寫字母代表差異顯著，P<0.05)

2.1.3 溫度對生物膜形成的影響

從圖3看出，植物乳桿菌生物膜形成量在不同溫度下呈現較大起伏。成膜量較高的有3處，分別在37、20和42 ℃。37 ℃一般為乳酸菌的最適培養溫度，而溫度極低如8 ℃時，菌體生長受抑制，數量過小，可能不利于聚集成膜，所以二者間成膜量有顯著性差異(P<0.05)。42 ℃為適宜的高溫脅迫，20 ℃為適宜的低溫脅迫，溫度的脅迫可能對生物膜形成相關基因的表達等造成影響，促進生物膜形成。高溫脅迫較之低溫脅迫下生物膜的形成量更多，可能因為低溫脅迫下，溫度過低，不利于菌體的生長，導致菌體數量累積不夠，難以形成較為緊密的生物膜，在受到外力時極易被破壞。

圖3 不同溫度下培養24 h植物乳桿菌生物膜形成能力Fig.3 Lactobacillus plantarum biofilm formation with different temperature for 24 h(不同小寫字母代表差異顯著，P<0.05)

2.1.4 不同pH值對生物膜形成的影響

不同pH值對生物膜形成的影響如圖4所示。

圖4 不同環境pH值對生物膜形成能力的影響Fig.4 Lactobacillus plantarum biofilm formation in different pH(不同小寫字母代表差異顯著，P<0.05)

在pH值小于3.8以及大于6.8時，植物乳桿菌生物膜的形成能力明顯降低，在pH值5.8處有最大成膜量。微生物生長有其最適的pH值范圍，pH值過高或過低都不利于其生長，會導致其生長速率過慢，菌體數量過低，難以聚集成膜。雖然較低的pH值可能會脅迫誘導生物膜的形成，但是同時菌體的生長也同樣受到抑制，可能在二者的相互作用下最后表現出反促進作用。PAVONI等也提到[12]，隨pH值增加，由于胞外聚合物的電離官能團增加，絮凝作用增強，但當pH值超過一定范圍后絮凝作用下降，生物膜的形成能力隨之下降。

2.1.5 培養條件正交實驗結果

進行4因素3水平的正交試驗，以OD值為評定指標，利用極差分析法對其結果進行極差分析，得出各因素的最佳組合。由表3中可以看出，4個因素中對植物乳桿菌生物膜形成影響的主次順序為A>B>D>C，即溫度時間>接種量>pH值，得出最佳的組合水平為A1B2C2D2，即培養溫度42 ℃，培養時間36h，pH值5.8，接種量5×107CFU/mL。

表3 培養條件正交試驗結果分析

2.2 不同添加物對植物乳桿菌生物膜形成的影響

2.2.1 不同金屬離子對生物膜形成的影響

如圖5所示，Cu2+、Ca2+、Fe2+對植物乳桿菌生物膜形成能力沒有明顯促進作用，與胡學偉[13]、王堯禹[14]的研究結果類似，學者的研究表明Cu2+可以通過抑制胞外多糖的分泌來抑制生物膜的形成；氫氧化鈣可通過抑制糞腸球菌毒力因子gelE等的表達來抑制生物膜的形成。

而一定濃度的Na+則可以促進生物膜的形成，與徐文生[10]等對NaCl影響長雙歧桿菌生物膜的研究結果類似。如圖6所示，低濃度下的Na+對植物乳桿菌生物膜沒有促進作用，隨著濃度增加到一定范圍，生物膜形成量與其濃度正相關，可能是因為細菌受到高滲透壓的脅迫誘導，或者高濃度的Na+影響了與生物膜形成相關基因的表達，從而促進了生物膜形成。

圖5 不同金屬離子對植物乳桿菌生物膜形成能力的影響Fig.5 The effection of different metal ions on Lactobacillus plantarum biofilm formation ability(不同小寫字母代表差異顯著，P<0.05)

圖6 Na+對植物乳桿菌生物膜形成能力的影響Fig.6 The effection of Na+ on Lactobacillus plantarum biofilm formation ability(不同小寫字母代表差異顯著，P<0.05)

2.2.2 不同碳源物質對生物膜形成的影響

圖7 不同碳源對植物乳桿菌生物膜形成能力的影響Fig.7 The effection of different carbon sources on Lactobacillus plantarum biofilm formation ability(不同小寫字母代表差異顯著，P<0.05)

圖8 葡萄糖對植物乳桿菌生物膜形成能力的影響Fig.8 The effection of glucose on Lactobacillus plantarum biofilm formation ability(不同小寫字母代表差異顯著，P<0.05)

如圖7所示，經過初步篩選，葡萄糖對植物乳桿菌生物膜的形成有顯著影響，而乳糖與淀粉的添加對植物乳桿菌生物膜形成的影響不明顯。如圖8所示，葡萄糖在一定濃度內能促進植物乳桿菌生物膜形成，隨著濃度的增大，其生物膜相對形成量呈現先增加后減小的趨勢，在添加量100 mg/mL處有最大促進作用，濃度再增加時，細菌對其利用率已達最大值，故可能對其成膜能力不再促進。這可能與其對碳氮源的偏好以及利用率有關，也有研究表明，碳源可能影響細胞的生長速率，黏附蛋白基因及參與胞外物質分泌的基因的表達[11,15]，從而影響生物膜的形成。

2.2.3 不同氮源物質對生物膜形成的影響

如圖9所示，乳粉較之硫酸銨與胰蛋白胨作為氮源物質更有利于生物膜的形成，乳粉的添加對植物乳桿生物膜的形成有顯著的促進作用。如圖10所示，隨著乳粉添加量的增加，成膜量有些許波動，在添加量75 mg/mL處相對成膜量達到最大值469.88%。氮源影響植物乳桿菌生物膜形成的機理可能與碳源的影響機理類似，另外，張燕[16]的研究結果表明，碳氮比的改變會影響生物膜胞外聚合物中蛋白質以及多糖等含量從而影響菌體包被以及生物膜的形成。且乳粉的添加會使培養基形成乳濁液，給生物膜提供更佳的附著點。

圖9 不同氮源對植物乳桿菌生物膜形成能力的影響Fig.9 The effection of different nitrogen source on Lactobacillus plantarum biofilm formation ability(不同小寫字母代表差異顯著，P<0.05)

圖10 乳粉對植物乳桿菌生物膜形成能力的影響Fig.10 The effection of milk powder on Lactobacillus plantarum biofilm formation(不同小寫字母代表差異顯著，P<0.05)

2.2.4 不同酸類物質對生物膜形成的影響

有機酸對植物乳桿菌生物膜形成的影響如圖11所示，2種有機酸的添加對植物乳桿菌生物膜的形成均無促進作用，從圖12可以看出檸檬酸對植物乳桿菌生物膜形成無顯著影響，各濃度的影響差異也不顯著，可能與有機酸引起的酸度變化影響菌體生長，從而影響其成膜有關，也有學者的研究表明沒食子酸、綠原酸分別對白色念珠菌和煙曲霉生物膜同樣存在抑制作用，主要機理可能為抑制細胞黏附和菌絲生長，從而抑制生物膜的形成[17]。

圖11 不同有機酸對植物乳桿菌生物膜形成能力的影響Fig.11 The effection of different organic acids on Lactobacillus plantarum biofilm formation ability(不同小寫字母代表差異顯著，P<0.05)

圖12 檸檬酸對植物乳桿菌生物膜形成能力的影響Fig.12 The effection of citric acid on Lactobacillu splantarum biofilm formation ability(不同小寫字母代表差異顯著，P<0.05)

2.2.5 不同增稠劑對生物膜形成的影響

發酵食品中增稠劑的應用廣泛，可提高產品稠度，降低流動性，保持產品形狀。如圖13所示，果膠對其成膜的促進作用顯著高于明膠。對果膠不同添加量的考察結果如圖14所示，添加量超過5.0 mg/mL時，隨著果膠添加量的增大，植物乳桿菌生物膜相對形成量減小，可能因為增稠劑添加量增加，培養基的流動性變差，抑制了植物乳桿菌的營養吸收與利用以及浮游菌體的移動，導致聚集度下降，生物膜形成能力降低。濃度較低時，果膠則能粘連部分胞外聚合物，促進菌體聚集，進而促進生物膜形成。但是果膠濃度過低則不利于包裹菌體，在洗脫時黏附能力弱，導致成膜量低。

圖13 不同增稠劑對植物乳桿菌生物膜形成能力的影響Fig.13 The effection of different thickener on Lactobacillu splantarum biofilm formation ability(不同小寫字母代表差異顯著，P<0.05)

不同小寫字母代表差異顯著，P<0.05圖14 果膠對植物乳桿菌生物膜形成能力的影響Fig.14 The effection ofpectin on Lactobacillusplantarum biofilm formation ability

2.2.6 營養條件正交實驗

在單因素基礎上進行4因素3水平正交試驗，以相對成膜量為評定指標，利用極差分析法對結果進行極差分析。由表4可以看出，4個因素中對植物乳桿菌生物膜形成影響的主次順序為A>C>B>D，即NaCl>果膠>葡萄糖>乳粉，得出最佳組合水平為A3B1C3D2，即NaCl添加量為200mg/mL，葡萄糖添加量75mg/mL，果膠添加量7.5mg/mL，乳粉添加量75mg/mL。

2.3 生物膜以及浮游菌株定量分析以及掃描電鏡結果

采用掃描電鏡和結晶紫染色法對以上最佳實驗條件所獲得的植物乳桿菌生物膜進行形態觀察與定量分析，以普通MRS肉湯培養的植物乳桿菌作為對照。結果表明，生物膜A490值為4.492 3。對照組A490值為0.136 5，如圖15所示，經優化實驗條件培養的植物乳桿菌生物膜菌體表面被胞外聚合物所包被，膜上有孔洞，具有典型的生物膜結構(圖15b)，而對照組中植物乳桿菌菌體形態清晰可見，沒有包被物，菌體呈游離狀態(圖15a)。

表4 營養條件正交試驗結果分析

圖15 植物乳桿菌生物膜以及游離菌體掃描電鏡圖Fig.15 SEM of biofilm and planktonic Lactobacillus plantarum

3 討論與結論

本實驗主要研究了多種環境因素對植物乳桿菌生物膜形成的影響。不同環境因子的影響機理與效果均不同，其中共同機理可能為影響調控生物膜形成基因的轉錄與表達，這為后續試驗提供了思路與方向。

環境中的微生物種類、數量以及活性、運動性等也可能對植物乳桿菌生物膜的形成造成影響。植物乳桿菌自身數量的變化亦可引起生物膜形成量的變化，當細菌達到一定的數量會誘發群體感應，可刺激胞外聚合物分泌以及成分改變，從而影響細菌黏附性繼而影響生物膜形成與結構[18-19]。胞外聚合物中的多種有機分子如多糖、蛋白質、核酸等，可以包裹細菌以提高生物膜結構穩定性。另外，多種微生物之間可能存在協同或拮抗關系，各自分泌的產物或群體感應信號都會對其他微生物產生影響，共同應對環境壓力的同時形成混合生物膜，但本試驗未能一一研究，旨在為后續研究提供參考。

本文研究了能夠促進植物乳桿菌生物膜形成的培養條件以及營養條件，優化的培養條件為接種量5×107CFU/mL，培養時間36 h，培養溫度42 ℃，pH值為5.8；最佳營養條件為MRS肉湯中添加NaCl 200 mg/mL，葡萄糖75 mg/mL，果膠7.5 mg/mL，全脂乳粉75 mg/mL。對在優化培養條件和營養條件下培養的植物乳桿菌生物膜進行定量分析，生物膜A490值為4.492 3，對照組A490值為0.136 5，掃描電鏡觀察結果表明該培養方法較之普通的乳酸菌培養方式更有利于植物乳桿菌生物膜的形成，所形成的生物膜較游離菌體具有大量的胞外聚合物包被，整個膜有孔洞，具有典型的生物膜結構。

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Study on biofilm formation conditions ofLactobacillusplantarumSCP53

ZHANG Guo-li1, PENGYao1, WEI Lu1, YU Xi1, AO Xiao-lin1*, LIU Shu-liang1, ZHAO Ke2

1(College of Food, Sichuan Agricultural University, Ya′an 625000, China) 2(College of Resource and Environmental, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611100, China)

The biofilm formation ability ofLactobacillusplantarumSCP53 under different status was studied herein. The biofilm formed byLactobacillusplantarumunder different environmental conditions and nutrition had been quantitatively and qualitatively evaluated through determination of crystal violet stain in OD490and scanning electron microscope(SEM). The results showed that the optimum culture condition for biofilm formation ofLactobacillusplantarumSCP53 was incubation at 42 ℃for 36 h with inoculums size of 5×107CFU/mL and pH value of 5.8. Addition of NaCl (200 mg/mL), glucose (75 mg/mL), pectin (7.5 mg/mL), milk powder (75 mg/mL) in MRS could promote biofilm formation ofLactobacillusplantarum. BiofilmsA490values of formed biofilm was 4.492 3, while this value in control group was 0.136 5. Results from scanning electron microscopy (SEM) showed that there was obvious difference between the biological membrane and planktonic bacteria.

Lactobacillusplantarum; biofilm; formation conditions; scanning electron microscope (SEM)

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201704002

碩士研究生(敖曉琳副教授為通訊作者，E-mail：huavslin@163.com)。

國家自然科學基金(31171726)；四川省科技支撐計劃項目(2012N0002)

2016-10-13，改回日期：2017-01-03