ClassⅡ細菌素乳酸菌的篩選與定性及群體感應系統鑒定

吳林昊，錢宇，汪慧超，薛秀恒

(安徽農業大學 茶與食品科技學院,安徽農產品加工工程實驗室，安徽 合肥，230036)

ClassⅡ細菌素乳酸菌的篩選與定性及群體感應系統鑒定

吳林昊，錢宇，汪慧超，薛秀恒*

(安徽農業大學 茶與食品科技學院,安徽農產品加工工程實驗室，安徽 合肥，230036)

篩選具有ClassⅡ細菌素群體感應系統廣譜抑菌作用的乳酸菌并進行鑒定，為產ClassⅡ細菌素乳酸菌的研究應用奠定基礎。將排除過氧化氫和有機酸干擾作用的10株乳酸菌，經胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K處理，采用牛津杯法篩選具有分泌細菌素廣譜抑菌效果的乳酸菌和最小抑菌實驗檢測其最小抑菌濃度，通過16S rDNA同源性分析構建系統發育樹，設計合成乳桿菌ClassⅡ細菌素5個操縱子plnEFI、plnJKLR、plnGHSTUV、plnABCD和plnMNOP的特異性引物，PCR和電泳鑒定L-4分泌ClassⅡ細菌素基因群體感應系統，通過UPLC和尿素-SDS-PAGE確定細菌素的分子質量。L-4為可能具有廣譜抑菌作用革蘭氏陽性植物乳桿菌，它對指示菌產生的抑菌圈分別為(18.83±0.39) mm和(19.96±0.49) mm，最小抑菌濃度分別為55 μg/mL和57 μg/mL；L-4具有分泌Class Ⅱ細菌素群體感應基因系統，能夠分泌分子質量為10 ku蛋白類細菌素且符合ClassⅡ細菌素分子量大小范圍。L-4是1株具廣譜抑菌作用且能分泌10 ku Class Ⅱ細菌素的植物乳桿菌。

乳酸菌；細菌素；16S rDNA鑒定；系統進化樹；Class Ⅱ細菌素群體感應系統

乳酸菌能夠產生有機酸如乳酸、丁酸和乙酸等以及過氧化氫和細菌素等化合物，這些物質不僅能保持食品的風味和良好的組織狀態，還可以抑制腐敗菌和病原菌的生長，從而防止腐敗并延長食品的保藏期[1]。

根據細菌素分子量大小和化學結構將其分為Ⅳ類：I類細菌素為羊毛硫細菌素，他們是經過大量翻譯后修飾的核糖體合成的分子質量小的多肽，長度為19～25個氨基酸；Ⅱ類細菌素為小分子、熱穩定的核糖體合成多肽；Ⅲ類細菌素為分子量大，對熱不穩定的蛋白質；Ⅳ類細菌素為含有脂肪或者碳水化合物部分組成的復雜大分子。

在細菌素的應用方面，目前僅有Nisin被聯合國糧農組織和美國食品藥品管理局所認可，批量商業化生產，作為一種天然防腐劑被廣泛應用于食品加工業[2]。但Nisin僅對蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)、產氣莢膜桿菌(Clostridiumperfringens)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和單增李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)等革蘭氏陽性菌有抑制作用，對革蘭氏陰性菌沒有抑制作用。而Ⅱ類乳酸菌細菌素具有較好的理化性質但且研究相對較少，前鑒定產Ⅱ類細菌素乳酸菌的步驟繁瑣、需要耗費大量的人力、物力和時間。用于產細菌素乳酸菌生長的天然培養基是非常復雜的，因為乳酸菌是非常苛刻的微生物，它的生長需要各種氨基酸、維生素和礦物質等，這些營養元素一般是通過大豆粉、酵母提取物、肉提取物等來供給。所有這些原料就組成了乳酸菌所需要的氨基酸來源的蛋白質和肽,這些蛋白質和肽與細菌素的分子量及性質是極其相近的。因此導致乳酸菌細菌素分離純化步驟繁瑣、抑菌活性大量損失、細菌素回收率低、很難純化為純體。

本文通過篩選出1株具有廣譜抑菌作用并具有產Ⅱ類細菌素的乳酸菌，從菌株鑒定，菌株抑菌活性檢測及最終對該菌株分泌Ⅱ類細菌素分離純化進行了研究。從而鑒別出1株具有廣譜抑菌作用、分泌Ⅱ類細菌的植物乳桿菌，從而在后續的研究中用于食品工業。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌株：10株乳酸菌L-1、L-2、L-3、L-4、L-5、L-6、L-7、S-1、S-2、S-3，來源于南京農業大學，于2014年平板畫線法分離純化，冷凍干燥法保藏菌種。指示菌株為大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，來自安徽農業大學畜產品加工實驗室。

試劑：過氧化氫酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K，購自阿拉丁；DNA提取試劑盒TAKARA MRS、LB購自國藥集團化學有限公司。

1.2 方法

株活化及保藏→牛津杯[8-12]法篩選產抑菌物質乳酸菌→產細菌素乳酸菌的鑒定→乳酸菌DNA提取→16S rDNA同源性分析及系統發育進化樹構建→特異性引物設計→群體感應系統鑒定。

1.2.1 牛津杯法篩選具有抑菌作用[13-14]的乳酸菌

將目標菌株與指示菌置于MRS液體培養基活化3次備用。將10 mL滅菌營養瓊脂培養基傾注于直徑90 mm培養皿中凝固后作底層，每皿放入4個牛津杯，0.1 mL指示菌液(1×108CFU/mL)加入5 mL冷卻至45 ℃的LB培養基，使其凝固作為菌層。向牛津杯形成直徑10 mm圓孔孔洞內加入待檢測抑菌活性菌液，接種量為1×106CFU/mL，適宜溫度下培養18 h后，測量抑菌圈直徑。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌作為指示菌，挑選抑菌圈最大的乳酸菌株后續研究。

1.2.2 有機酸、過氧化氫抑菌作用

將1.2.1抑菌圈最大的乳酸菌菌株經10 000 r/min、2 min離心取發酵上清液，2 mol/L NaOH溶液中和到pH為5.0后，牛津杯法抑菌實驗，并設pH為5.0的乙酸和乳酸、未調pH值的發酵上清液作為對照，檢測抑菌活性并測量其抑菌圈直徑。

將菌接種于MRS液體，10 000 r/min離心2 min，取過氧化氫酶溶液100 μL，加入0.9 mL pH為5.0的發酵上清液中使過氧化氫酶終濃度為50 U/mL，并設未加過氧化氫酶的pH為5.0發酵上清液和產細菌素菌株為對照，牛津杯法檢測抑菌活性。

1.2.3 抑菌物質的蛋白酶水解作用

將1.2.1抑菌圈最大的乳酸菌菌株，調節pH為不同蛋白酶的最適作用pH，按1.0 mg/mL分別加入胰蛋白酶、蛋白酶K和胃蛋白酶，37 ℃下溫育1 h，將pH值調回到細菌素pH=5牛津杯抑菌試驗，重復3次。發酵上清液作為對照，驗證乳酸菌發酵上清液的抑菌活性是否為蛋白質。

1.2.4 MIC試驗

將1.2.1抑菌圈最大的乳酸菌菌株，利用96孔微量滴定板，分別測定上述牛津杯試驗中發酵上清、無有機酸的發酵上清、無過氧化氫的發酵上清及蛋白酶處理的發酵上清對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度的變化。

1.2.5 產細菌素乳酸菌菌體的形態特征

將1.2.1抑菌圈最大的乳酸菌菌株在MRS固體培養基上平板四區劃線，37 ℃培養24 h后，挑取大小適中單一菌落進行革蘭氏染色觀察菌體形態。

1.2.6 乳酸菌菌株的菌種鑒定[15]

將1.2.1抑菌圈最大的乳酸菌菌株進行細菌基因組DNA提取，參照細菌DNA提取試劑盒(德國 QIAGEN)說明書步驟進行。

1.2.7 16S rDNA基因保守序列擴增

根據文獻中乳酸菌上、下游通用引物27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492r(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)擴增16S rDNA基因[16]。PCR反應體系25 μL：模板DNA 2.0 μL，Mix(2×TaqDNA Polymerase，2×PCR Buffer，2×dNTP)12.5 μL，上下游引物各1.0 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應：94 ℃預變性300 s；94 ℃變性30 s，56 ℃退火60 s，72 ℃延伸120 s，循環30次；72 ℃終延伸600 s。5 μL擴增片段電泳觀察結果。

1.2.8 菌種鑒定并構建系統進化樹

將1.2.1抑菌圈最大的乳酸菌菌株，PCR擴增結果16S rDNA基因電泳檢測，將PCR產物送上海生工測序。將菌株序列結果與GenBank數據庫中已知菌株序列比對，通過MEGA4軟件序列分析目的基因序列的同源性，構建系統發育樹[17]。

1.2.9 Class Ⅱ細菌素群體感應系統的鑒定

根據系統進化樹同源性比對結果，設計乳桿菌ClassⅡ細菌素5個操縱子plnEFI、plnJKLR、plnGHUV、plnABCD和plnMNOP的特異性引物見表1。

反應體系25 μL：2×TapPCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物1.0 μL，DNA 2.0 μL，ddH2O 8.5 μL，設置空白對照。PCR反應條件：94 ℃變性5 min； 94 ℃變性30 s，退火溫度采用各引物要求溫度、72 ℃延伸2 min，30個循環；最后72 ℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳在標準條件下檢測并送至上海生工測序比對。

表1 Class II細菌素特異性引物

續表1

名稱上游引物下游引物產物長度(bp)退火溫度/℃plnkCTGTAAGCATTGCTAACCAATCACTGCTGACGCTGAAAAG141575plnLAGATGCCGCTCCGTAAAGTAGTGCATCGTATTTGCGTGTC26160plnRCCCATCACTAAGCCCTTGATGCTTGCTGGTAGCGCTTATT10159plnGTGCGGTTATCAGTATGTCAAAGCCTCGAAACAATTTCCCCC141575plnHTCTTACACGATCAAGGCAACTGTGCCACTTACCTGTTTC131585plnUCTCGGCCATGGTTATCAGTTGACATCCCATTGCGGTACTC66157plnVCGGAGAATGTTGCTGACTTGGAAGAAATTGCCGCGAATAA57157plnAGTAGGTGGAAAGAGTAGTGCGTAACAGTTTCTTTACCTGTTTAATTGC141595plnBTTCAGAGCAAGCCTAAATGACGCCACTGTAACACCATGAC111615plnCAGATGAAATTCGGCAGCAGTATAATCCAACGGTGCAATCC12160plnDTGAGGACAAACAGACTGGACGCATCGGAAAAATTGCGGATAC10158plnMTAAACAGGTAAAGCAGGTTGGAAGATAATCCTGACCAGACACC48157plnNCCGGGTTAGGTATCGAAATGCACTCGAAGTTCCCTCTGCT12159plnOGGCTGAAGGAGCATCAGTGTTTTGCAGTATCCGCCTTTCT22160plnPTTTGCAAGTGGTCTGCTTTGATTAATTGAGGGCGGGTAGG12160

1.2.10 ClassⅡ細菌素分子量測定

乳酸菌株37 ℃下靜置培養傳代至第3代，4 ℃、8 000 r/min離心10 min取上清液。細菌素初提液水系0.22 μm濾處理上清，超濾系統(50 ku)超濾細菌素，截取分子量1～50 ku的物質，進一步通過UPLC H-Class系統分離純化細菌素，檢測方法：C18柱，V(水)∶V(乙腈)∶V(乙酸)=95∶4∶1，流速為0.1 mL/min，紫外波長218 mm，上樣量0.1 μL，采用Tricine-SDS-PAGE電泳來確定其分子質量大小,并通過牛津杯法確定該細菌素的蛋白性質。

2 結果與分析

2.1 產抑菌物質的乳酸菌篩選

10株乳酸菌分別命名：L-1、L-2、L-3、L-4、L-5、L-6、L-7、S-1、S-2、S-3。經牛津杯法篩選后，圖1、圖2和圖3表明，這10株菌對2株指示菌均具有良好抑菌效果。

圖1 十株乳酸菌對大腸桿菌抑菌效果Fig.1 The antimicrobial effect of 10 strains of lactic acid bacteria against E.coli

圖2 十株乳酸菌對金黃色葡萄球菌抑菌效果Fig.2 The antimicrobial effect of 10 strains of lactic acid bacteria against S.aureus

圖3 十株乳酸菌的抑菌效果Fig.3 The antibacterial effect of the 10 strains of lactic acid bacteria

2.2 有機酸抑菌試驗[18]

乳酸菌發酵液對指示菌抑制作用，可能是代謝合成的細菌素或酸性末端產物如乙酸、乳酸及其他有機酸作用的結果。圖4說明，pH=5的L-4發酵上清液與發酵原液抑菌效果相近，與發酵上清液pH值相同的乳酸、乙酸實驗組對2種指示菌的抑菌效果明顯較小，這說明在排除酸性末端產物的抑菌干擾后，發酵液中還存在其他抑菌活性物質，L-4的發酵上清液產生的主要抑菌物質并非有機酸。

圖4 排除有機酸抑菌實驗結果Fig.4 Results of antibacterial by supernatant without organic acid

2.3 過氧化氫抑菌試驗

乳酸菌代謝過程中的過氧化氫也可抑制指示菌生長。過氧化氫酶處理發酵上清，以未經過氧化氫酶處理的乳酸菌原液、發酵上清液為對照，結果見圖5。圖5可以看出，L-4菌株發酵液經過氧化氫酶處理后，抑菌圈直徑與發酵上清原液、細菌原液的抑菌圈直徑相比變化不大，活性下降了9.5%，從而可以證明L-4菌株發酵液中抑菌物質不完全是過氧化氫，有其他抑菌物質對指示菌起抑制作用。

圖5 過氧化氫酶處理后的抑菌活性Fig.5 Results of antibacterial after treated with catalase

2.4 細菌素的蛋白酶敏感性試驗

為確定抑菌物質是否具有蛋白質性質，用胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K對發酵液處理。從圖6可以看出，發酵液經胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K處理后，抑菌圈直徑顯著減小，經胰蛋白酶處理后活性分別下降58.9%、61.4%，經胃蛋白酶處理后活性分別下降62.1%、61.3%，蛋白酶K處理后活性分別下降63.4%、66.9%。可見抑菌物質對胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K敏感。初步確定這種抑菌物質具有蛋白性質，是一種細菌素。

圖6 胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K處理后抑菌實驗結果Fig.6 Results of antibacterial after treated with trypsin，pepsin and proteinase K

2.5 MIC試驗

MIC試驗結果與牛津杯抑菌試驗結果相符，L-4未經處理的發酵上清(圖7-A)最小抑菌濃度為36、37 μg/mL;與發酵上清液經過排除有機酸(圖7-B)、過氧化氫(圖7-C)，蛋白酶(圖7-D)處理后的抑菌作用相比，最小抑菌濃度分別為45、48、55和57 μg/mL。L-4最小抑菌濃度均有所上升，抑菌活性均有所減小，蛋白酶處理后L-4發酵上清液(圖7-D)基本無抑菌作用，說明發酵上清液中起主要抑菌作用的是L-4分泌的蛋白類細菌素。

圖7 MIC試驗結果Fig.7 Results of MIC

2.6 乳酸菌形態觀察

圖8為革蘭氏染色鏡檢結果，L-4為革蘭氏陽性棒狀乳桿菌。

圖8 L-4革蘭氏染色鏡檢結果Fig.8 Microscopic examination resuLts of Gram staining

2.7 同源性分析及系統發育樹構建

乳酸菌L-4基因組經16S rRNA基因PCR 擴增后，其條帶大小為1 500 bp。經上海生工測序比對基因序列為1 409 bp。菌株L-4的16S rDNA基因序列與GenBank比對結果表明，菌株L-4與其他植物乳桿菌有較高同源性。為比較菌株L-4與其菌種之間親緣關系及其系統地位，使用生物信息學軟件Clustal X和MEGA 4.0 中的鄰接法進行序列同源性比對構建系統進化樹[19-20]，結果如圖9所示。從圖9可以看出，菌株L-4與植物乳桿菌有親緣關系，相似性達到98%。使用DNAMAN軟件比對同一菌屬符合上述結果，說明菌株L-4在分類學地位上歸屬于乳桿菌屬，為植物乳桿菌。

圖9 L-4菌株系統發育樹Fig.9 The phylogenetic trees of L-4注：水平距離與虛擬的進化變化成正比，樹上的分支數是驗證信譽度。

2.8 ClassⅡ細菌素基因分析

ClassⅡ類細菌素5操縱子plnEFI，plnJKLR，plnGHUV，plnABC和plnMNOPPCR擴增電泳結果見圖10。植物乳桿菌WCFS1具有ClassⅡ細菌素5操縱子基因，根據菌株系統發育樹的結果，設計出5個操縱子的特異引物并通過電泳測序結果比對序列。說明L-4與WCFS1具有相似的ClassⅡ細菌素群體感應系統，且每個基因的表達量不一樣導致電泳條帶明暗程度不一，因為群體系統中不同基因操縱子表達調控的功能作用不一樣，由于相互之間有協同與滯后作用導致基因的表達量不一樣。

M-100 bp DNA梯度分子marker圖10 群體感應基因表達結果Fig.10 The quorum sensing gene expression

2.9 ClassⅡ細菌素分子質量確定

將L-4發酵上清液通過超濾系統截留下1～50 ku的小分子蛋白后，UPLC檢測結果如圖11所示，分別收集圖中A、B、C、D后，經過Tricine-SDS-PAGE，結果顯示發酵上清液(圖12-A)中含有多種蛋白分子條帶，說明L-4分泌的細菌素中含有多種小分子蛋白，并且有2條條帶小于10 ku的小分子蛋白；圖12-B主要含有20 ku蛋白類物質，還含有30～40 ku蛋白，可能是因為在收集A峰蛋白物質拖尾導致參入其他蛋白；圖12-C主要含有10 ku蛋白類物質；圖11-D峰無條帶。牛津杯法顯示峰C的具有抑菌活性，對兩株指示菌的抑菌直徑分別為(7.13±0.23) mm和(6.61±0.17) mm經蛋白酶處理后無抑菌性，說明收集的圖11峰C是均有抑菌作用分子質量為10 ku蛋白類物質。

圖11 UPLC檢測結果Fig.11 Results of UPLC

圖12 蛋白電泳結果Fig.12 Results of protein electrophoresis

3 結論

由于乳酸菌菌種繁多，傳統的鑒定方法比較繁瑣、低效，存在一定的缺陷。近來許多研究人員將眼光放在了分子水平上，從環境微生態系統中直接分離提取16S rRNA或DNA并進行序列分析。16S rRNA是原核生物糖體小亞單位上的一個RNA分子，分子質量約為0.6×106u，由1 500多個核苷酸組成。16S rRNA的一級結構非常保守，而決定其一級結構的16S rRNA基因序列也非常保守。隨著16S rRNA基因庫的建立，可以發現同屆或同種微生物16S rDNA序列之間保持很高的同源性。這種同源性與物種間的親緣關系有著密切的對應關系。一般來講，在種這個分類等級上，如果2個分類單位區間的16S rRNA序列同源性大于95%，則認為它們屬于同一個屬[21]。

本文以分子鑒定為主，理化鑒定為輔，分子鑒定和理化鑒定相結合來鑒定篩選出的產細菌素的L-4乳酸菌。革蘭氏染色顯微鏡檢結果說明，L-4菌為革蘭氏棒狀乳桿菌；牛津杯法排酸、排過氧化氫抑菌，細菌素蛋白酶敏感性試驗和MIC試驗，確定該菌株所產生的抑菌物質是蛋白類細菌素；后經16S rDNA 序列分析和同源性比對，綜合鑒定L-4菌為革蘭氏陽性棒狀植物乳桿菌。通過PCR基因表達鑒定，該菌株含有分泌Ⅱ類細菌素的群體感應系統，超濾系統、UPLC和蛋白電泳鑒定顯示L-4分泌的細菌素中的確含有10 ku小分子蛋白Ⅱ類細菌素。

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Identification and screening of Class II bacteriocins of lactic acid bacteria and quorum sensing system

WU Lin-hao, QIAN Yu, WANG Hui-chao, XUE Xiu-heng*

(Engineering Laboratory of Agricultural Products Processing of Anhui, Shool of Tea and Food Science & Technology, Anhui Agriculture University, Hefei 230036,China)

The lactic acid bacteria with broad-spectrum antimicrobial effect of Class II bacteriocin quorum sensing system were screened and identified. After exclusion of hydrogen peroxide and organic acid interference and treatment with trypsin， pepsin and proteinase K， lactic acid bacteria secreting bacteriocin with broad-spectrum antibacterial effect was screened by Oxford cup method. The minimal inhibitory concentration was detected by assay on minimal inhibitory activity. Phylogenetic tree was constructed based on 16S rDNA homology analysis. The primers specific for five operon plnEFI, plnJKLR, plnGHSTUV, plnABCD, and plnMNOP of the class II bacteriocins were designed. Class II bacteriocin genes of quorum sensing system were identified by PCR and electrophoresis. The molecular size of bacteriocin was determined by UPLC and urea-sds-page. L-4 was a kind of gram positive bacteria with broad spectrum antimicrobial activity. The diameters of inhibition zones for indicator bacteria were (18.83±0.39) mm and (19.96±0.49) mm, with the minimal inhibitory concentrations of 55.68 μg/mL and 57.31 μg/mL. L-4 had Class II bacteriocin gene of quorum sensing system. It could secrete a bacteriocin with molecular weight of 10 ku in the molecular range of Class II bacteriocin. L-4 was a strain ofLactobacillusplantarumsecreting 10 ku of Class II bacteriocin with broad-spectrum antimicrobial activity.

lactic acid bacteria; bacteriocin;16S rDNA identification; phylogenetic tree; Class II bacteriocin quorum sensing system

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201704003

碩士研究生(薛秀恒教授為通訊作者，E-mail:358896335@qq.com)。

2016-09-29，改回日期：2017-01-03