郫縣豆瓣發(fā)酵過程可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性及其演化分析

關(guān)統(tǒng)偉，王鵬昊，鄧奧宇，田蕾，董丹，趙順先，向慧平，張習(xí)超

(西華大學(xué) 微生物研究所，食品生物技術(shù)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都，610039)

郫縣豆瓣發(fā)酵過程可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性及其演化分析

關(guān)統(tǒng)偉*，王鵬昊，鄧奧宇，田蕾，董丹，趙順先，向慧平，張習(xí)超

(西華大學(xué) 微生物研究所，食品生物技術(shù)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都，610039)

以郫縣豆瓣不同發(fā)酵期的樣品為原料，采用6種培養(yǎng)基分離，經(jīng)過系統(tǒng)發(fā)育分析，共獲得11個(gè)屬的細(xì)菌(Bacillus、Oceanobacillus、Halomonas、Lactobacillus、Virgibacillus、Aidingimonas、Pantoea、Weissell、Enterobacter、Glycomyces和Gracilibacillus)，其中芽孢桿菌屬細(xì)菌種類最為豐富。Bacillus、Oceanobacillus、Halomonas、Lactobacillus、Virgibacillus、Weissella、Enterobacter和Gracilibacillus伴隨于豆瓣發(fā)酵的整個(gè)過程，其中Bacillus、Oceanobacillus和Halomonas是郫縣豆瓣發(fā)酵過程中的優(yōu)勢(shì)菌群，占可培養(yǎng)細(xì)菌總量的84.9%。郫縣豆瓣細(xì)菌多樣性豐富，并且存在著新的細(xì)菌種類，其中菌株XHU5999與已知同源關(guān)系最近的菌株Glycomyceshalotolerans相似性僅為96%；菌株XHU5135與Aidingimonashalophila的同源性最近，相似性為97%。研究結(jié)果表明，郫縣豆瓣在發(fā)酵過程中豐富的細(xì)菌種類和數(shù)量是隨著環(huán)境變化而變化的，細(xì)菌在豆瓣風(fēng)味形成過程中扮演著重要角色。

郫縣豆瓣；發(fā)酵過程；細(xì)菌多樣性；動(dòng)態(tài)分析

郫縣豆瓣憑借其獨(dú)特的原料(四川和云南的優(yōu)質(zhì)蠶豆以及郫縣及其周邊的二荊條辣椒)，特殊的長(zhǎng)時(shí)間開放式傳統(tǒng)發(fā)酵工藝(制曲、固態(tài)發(fā)酵和長(zhǎng)期陳釀，涉及到自然界眾微生物菌系的參與)[1-3]和區(qū)域性小氣候(溫度、濕度等環(huán)境)最終釀成了風(fēng)味獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)健康且不可復(fù)制的國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品。300年以來，郫縣豆瓣始終秉承開放式傳統(tǒng)工藝，使得大量空氣、原材料、工具、設(shè)備等環(huán)境中的細(xì)菌參與了郫縣豆瓣的發(fā)酵生產(chǎn)。開放式自然環(huán)境細(xì)菌發(fā)酵經(jīng)常引起產(chǎn)品漲袋，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失；而且不同季節(jié)的環(huán)境微生物不同，使得不同季節(jié)產(chǎn)品的風(fēng)味差異大，穩(wěn)定性難以保障，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。雖然有一些學(xué)者從郫縣豆瓣的制曲階段和發(fā)酵階段分離到不同的細(xì)菌純培養(yǎng)，如乳酸菌、芽孢桿菌等[4-6]，但目前對(duì)其發(fā)酵過程的細(xì)菌純培養(yǎng)并沒有系統(tǒng)全面的研究。本研究利用多種培養(yǎng)基獲取不同發(fā)酵時(shí)期的細(xì)菌純培養(yǎng)，探討其細(xì)菌種群及其消長(zhǎng)情況，為郫縣豆瓣的純種發(fā)酵、質(zhì)量控制和工藝優(yōu)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

Goldview、EDTA、Tris堿等，上海生工生物工程有限公司；甘油、無(wú)水乙醇、異戊醇等，成都市科龍劑化工廠；pGM-T試劑盒、Extaq DNA聚合酶、dNTP等，大連寶生物公司；胰蛋白酶、蛋白酶K等，Sigma公司；生化培養(yǎng)箱，上海福瑪實(shí)驗(yàn)有限公司；臺(tái)式高速離心機(jī)，湘儀離心機(jī)有限公司；PCR儀，美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料為郫縣豆瓣，采集于四川恒豐和食品有限公司。試驗(yàn)中總共采集了6個(gè)發(fā)酵時(shí)期的樣本，豆瓣樣本編號(hào)分別為： BZ1、BZ5、BZ10、PJ3、HE1和HE5。樣品采集使用多點(diǎn)取樣法，通過在發(fā)酵池的兩端以及中間3個(gè)位置分別取上、中、下層等量豆瓣樣品，混合均勻備用。6個(gè)時(shí)期的樣本信息分別為：編號(hào)BZ1、BZ5、BZ103個(gè)樣本分別在2013年11月30日(瓣子發(fā)酵1個(gè)月)、2014年3月30日(瓣子發(fā)酵5個(gè)月)和2014年8月30日(瓣子發(fā)酵10個(gè)月)取樣；編號(hào)PJ3(取樣時(shí)間為2014年9月1日)來自發(fā)酵3個(gè)月成熟辣椒醅；編號(hào)HE1和HE5(分別取2014年10月30日和2015年2月30)來自混合發(fā)酵階段，混合發(fā)酵時(shí)間分別為1個(gè)月和5個(gè)月。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分離培養(yǎng)基

為了全面反映豆瓣發(fā)酵過程中的細(xì)菌情況，結(jié)合生態(tài)環(huán)境，實(shí)驗(yàn)人員采用了以下6種培養(yǎng)基，用于分離豆瓣醬中的細(xì)菌。

CM培養(yǎng)基：酪素水解物7.5 g，酵母粉10 g，檸檬酸三鈉3 g，MgSO40.1 g，KCl 2 g，NaCl 1 g；

ACM培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g，KNO31 g，NaCl 0.5 g，K2HPO40.5 g，MgSO40.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g；

MM培養(yǎng)基：葡萄糖0.5 g，酵母抽提物0.5 g，K2HPO4, 1 g，NaCl, 0.5 g，MgSO4. 7H2O, 0.5 g；

MAM培養(yǎng)基：麥芽汁抽提物20 g，蛋白胨1 g，葡萄糖20 g；

SDA培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，麥芽糖40 g，KCl 1 g，1 mL精濾發(fā)酵豆瓣液；

YC培養(yǎng)基：酵母抽提物(Difco)2 g、酪蛋白氨基酸(Difco)2 g、谷氨酸鈉1 g、檸檬酸鈉3 g、MgSO41 g、CaCl21 g、KCl 1 g、FeCl2·4H2O 0.3 g、MnCl2·4H2O 0.3 g。

以上培養(yǎng)基采用不同鹽濃度梯度(原培養(yǎng)基及分別補(bǔ)充5%、10%、15%、20%的NaCl)，補(bǔ)水至1 L，溶解混勻，制備成無(wú)菌培養(yǎng)基進(jìn)行樣品分離。

1.3.2 菌株的分離

無(wú)菌操作條件下，選取采集的豆瓣醬樣品1 g，放于100 mL無(wú)菌生理鹽水中，37 ℃恒溫200 r/min搖床過夜，制成10-2懸濁液。吸取0.1 mL懸濁液均勻涂布于預(yù)先配置好的固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃下恒溫保濕培養(yǎng)，以減少培養(yǎng)基水分的散失，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間。

1.3.3 菌株的DNA的提取與PCR擴(kuò)增

菌株總DNA的提取、16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增均采用CUI等[7]使用的方法進(jìn)行。以提取得到的DNA為模板，選擇細(xì)菌通用引物Eμ27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)；1490R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。反應(yīng)條件：95 ℃ 4 min；95 ℃ 60 s，56 ℃ 60 s，72 ℃ 120 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10min。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物的純化參照OMEGA公司E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit試劑盒的說明進(jìn)行。PCR產(chǎn)物純化后送往生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.3.4 菌株16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析

測(cè)序結(jié)果提交NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行Blast(Basic Local Alignment Search Tool)序列比對(duì)分析。系統(tǒng)進(jìn)化矩陣根據(jù)Kimura模型估算[8], 用MEGA6.0(Molecular Evolutionary Genetics Analy-sis)軟件采用鄰接法(Neighbor-Joining)聚類分析構(gòu)建出系統(tǒng)進(jìn)化樹[9]。同時(shí), 重復(fù)取樣1 000次進(jìn)行自展值(bootstrap value)分析來評(píng)估系統(tǒng)進(jìn)化樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。定義16S rRNA基因序列相似性低于98%作為不同的分類單元，相似性大于98%的歸于同一個(gè)物種來計(jì)算[10]。

1.3.5 細(xì)菌菌落數(shù)量統(tǒng)計(jì)

食品中細(xì)菌總數(shù)的檢測(cè)采用平板計(jì)數(shù)法，參照GB 4789.2—2010操作進(jìn)行。培養(yǎng)基采用GB4789.2—2010中介紹的平板計(jì)數(shù)瓊脂(plate count agar，PCA)，選取菌落數(shù)在30～300 CFU、無(wú)蔓延菌落生長(zhǎng)的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 郫縣豆瓣發(fā)酵過程可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性動(dòng)態(tài)分析

通過6種培養(yǎng)基對(duì)郫縣豆瓣發(fā)酵過程中的細(xì)菌進(jìn)行分離，共獲得322株菌。經(jīng)過16S rRNA測(cè)序與序列比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)郫縣豆瓣發(fā)酵過程中存在眾多細(xì)菌的參與，共分離到11個(gè)屬的菌株，分別屬于細(xì)菌域的芽孢桿菌屬(Bacillus)、海洋芽孢桿菌屬(Oceanobacillus)、艾丁單孢菌屬(Aidingimonas)、鹽單孢菌屬(Halomonas)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、枝芽孢菌屬(Virgibacillus)、魏斯氏菌屬(Weissella)、糖霉菌屬(Glycomyces)、泛菌屬(Pantoea)、腸桿菌屬(Enterobacter)和糖球菌屬(Gracilibacillus)(如表1所示)。

表1 不同發(fā)酵期郫縣豆瓣可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性動(dòng)態(tài)變化

續(xù)表1

菌號(hào)相似性/%同源菌種BZ1BZ5BZ10PJ3HE1HE5XHU5943100Bacilluscereus+-+--+XHU541099Bacillusmethylotrophicus++--+-XHU5511100Bacillussubtilis++++--XHU5499100Bacillussafensis+-+++-XHU5413100Bacillusstratosphericus-+-+--XHU5624100Bacillusniabensis--+-+-XHU5555100Lactobacillusplantarum++--++XHU551699Oceanobacilluspicturae++++-+XHU5517100Oceanobacillusoncorhynchi+-+-+-XHU599996Glycomyceshalotolerans++----XHU561299Halomonasalkaliphila+-++-+XHU5491100Halomonaselongate+++-++XHU582099Enterobacterasburiae+---++XHU5821100Gracilibacillusdipsosauri+--+--XHU5672100Virgibacilluspicturae++--+-XHU582399Virgibacillussalarius+-+-+-XHU513597Aidingimonashalophila---++-XHU590199Weissellacibaria-++-++XHU572799Pantoeaagglomerans---+--

注：+，陽(yáng)性；-，陰性，即沒分離到該細(xì)菌。

這些細(xì)菌的屬中Bacillus分離得到的數(shù)量最多，占全部細(xì)菌總數(shù)的52.3%，其次是Oceanobacillus(17.4%)和Halomonas(15.2%)；其余8個(gè)屬的菌株所在比例較少，占15.1%的細(xì)菌總量，且Lactobacillus僅占1.7%。研究中發(fā)現(xiàn)2個(gè)值得關(guān)注的細(xì)菌，菌株XHU5135與Aidingimonashalophila(喜鹽艾丁單孢菌)的同源性最近，相似性為97%，在系統(tǒng)樹中形成一個(gè)獨(dú)立的分支，是一個(gè)潛在的細(xì)菌新種(如圖1系統(tǒng)發(fā)育樹所示)；菌株XHU5999與目前已知同源關(guān)系最近的菌株Glycomyceshalotolerans(耐鹽糖霉菌)相似性僅為96%，是一個(gè)新的細(xì)菌物種(如圖2系統(tǒng)發(fā)育樹所示)，其余其他菌株與已知菌株的相似性為99%～100%。

圖1 菌株XHU5135的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of the strain XHU5135 and near neighbours calculated from 16S rRNA gene

由表1可知，郫縣豆瓣傳統(tǒng)發(fā)酵過程中不同時(shí)期(BZ1、BZ5、BZ10、PJ3、HE1、HE5)可培養(yǎng)細(xì)菌組成具有較大差異。發(fā)酵初期的BZ1樣品中細(xì)菌多樣性最為豐富，共分離獲得8個(gè)屬的細(xì)菌，分別為：Bacillus、Oceanobacillus、Halomonas、Lactobacillus、Virgibacillus、Enterobacter、Glycomyces和Gracilibacillus。這可能經(jīng)過制曲階段，霉菌產(chǎn)生多種淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶等將原料中的大分子物質(zhì)(如淀粉和蛋白質(zhì))分解成小分子的氨基酸、有機(jī)酸、葡糖糖的緣故，使得瓣子加鹽發(fā)酵的初期豆瓣醬中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)極其豐富，原料和環(huán)境中的細(xì)菌大量進(jìn)入發(fā)酵體系，成為細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的主要碳源和氮源來源。因此，該時(shí)期微生物的生長(zhǎng)旺盛，種類豐富。發(fā)酵5個(gè)月后的BZ5樣品中總共獲得7個(gè)屬，分別為：Bacillus、Oceanobacillus、Virgibacillus、Lactobacillus、Halomonas、Weissella和Glycomyces。瓣子發(fā)酵10個(gè)月的BZ10Y樣品中總共分離得到5個(gè)屬的細(xì)菌，即Bacillus、Halomonas、Oceanobacillus、Virgibacillus和Weissella，該時(shí)期的屬一級(jí)的物種多樣性較少，可能是由于高濃度的鹽水，無(wú)氧的環(huán)境、pH值下降以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗有關(guān)，使得部分細(xì)菌在該時(shí)期無(wú)法生長(zhǎng)；還有些細(xì)菌可能由于分離與培養(yǎng)條件的限制沒有分離出來。成熟辣椒醅PJ3樣品中分離獲得6個(gè)屬的細(xì)菌，分別為Gracilibacillus、Bacillus、Oceanobacillus、Halomonas、Aidingimonas和Pantoea。 HE1樣品分離得到8個(gè)屬的細(xì)菌(Bacillus、Oceanobacillus、Halomonas、Lactobacillus、Virgibacillus、Aidingimonas、Enterobacter和Weissella)，該時(shí)期為BZ10Y與椒胚PJ3混勻發(fā)酵的初期，一部分細(xì)菌是兩個(gè)時(shí)期微生物組成的疊加，但同時(shí)，該時(shí)期再次出現(xiàn)了乳桿菌屬(Lactobacillus)和腸桿菌屬(Enterobacter)2個(gè)屬，是在BZ10Y和PJ3Y樣品中未檢測(cè)得到的，可能是受分離條件的影響，亦或是在混合操作中引入的環(huán)境細(xì)菌。從HE5樣品中獲得了6個(gè)屬的細(xì)菌，即Bacillus、Oceanobacillus、Halomonas、Lactobacillus、Enterobacter和Weissella。從各時(shí)期的細(xì)菌組成不難看出，在豆瓣醬發(fā)酵的各時(shí)期，Bacillus、Oceanobacillus、Halomonas、Lactobacillus、Weissella和Enterobacter始終伴隨于整個(gè)發(fā)酵過程，是主要的郫縣豆瓣菌群。另外，值得注意的是，芽孢桿菌屬是郫縣豆瓣發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)的可培養(yǎng)細(xì)菌9個(gè)屬中最為富的一個(gè)類群，共有12個(gè)不同的種，它們可能對(duì)郫縣豆瓣的呈香具有重要的作用，值得深入研究。而其他屬的細(xì)菌種的多樣性相對(duì)較少，除了Oceanobacillus、Halomonas和Virgibacillus各有2個(gè)不同種外，其他屬僅僅有1個(gè)種。

圖2 菌株XHU5999的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of the strain XHU5135 and nearneighbours calculated from 16S rRNA gene

2.2 不同發(fā)酵時(shí)期細(xì)菌總數(shù)的動(dòng)態(tài)變化

郫縣豆瓣不同發(fā)酵時(shí)期的6個(gè)樣品(BZ1、BZ5、BZ10、PJ3、HE1、HE5)的細(xì)菌菌落總數(shù)變化較大(圖3)。在BZ1中細(xì)菌菌落總數(shù)最多，為18.3×105CFU/g；隨后由于鹽濃度的增高、養(yǎng)分的不斷消耗以及不適應(yīng)生活環(huán)境細(xì)菌的死亡，在BZ10時(shí)期，菌落總數(shù)降到最低(2.2×105CFU/g)，與BZ1相比，減少了1個(gè)數(shù)量級(jí)。隨辣椒醅PJ3樣品環(huán)境細(xì)菌(12.6×105CFU/g)的加入，在HE1階段，細(xì)菌菌落總數(shù)上升為10.1×105CFU/g，但在HE5時(shí)期的細(xì)菌菌落總數(shù)又出現(xiàn)了明顯的下降，可能是辣椒醅中的部分細(xì)菌不適應(yīng)混合環(huán)境的緣故，造成部分細(xì)菌死亡，數(shù)量減少。這些變化也說明，不同發(fā)酵周期的環(huán)境因素對(duì)豆瓣細(xì)菌的繁殖具有重要影響。

圖3 不同發(fā)酵時(shí)期郫縣豆瓣細(xì)菌總數(shù)變化Fig.3 Change of bacterial quantity in different fermentation processes from Pixian bean paste

3 結(jié)論

(1)郫縣豆瓣發(fā)酵過程中存在豐富的細(xì)菌多樣性，共獲得11個(gè)屬的細(xì)菌，其中芽孢桿菌屬的種類最為豐富。趙輝平等[5]從郫縣豆瓣中分離得到了8個(gè)屬的細(xì)菌，芽孢桿菌屬也是優(yōu)勢(shì)菌群，這與我們的研究基本一致。本研究在瓣子發(fā)酵過程中獲得了Bacillus、Oceanobacillus、Halomonas、Lactobacillus、Virgibacillus、Weissella、Glycomyces、Enterobacter和Gracilibacillus9個(gè)屬的細(xì)菌；在辣椒醅中共分離得到Bacillus、Oceanobacillus、Halomonas、Aidingimonas、Pantoea和Gracilibacillus6個(gè)屬的細(xì)菌，并且Aidingimonas和Pantoea僅在辣椒醅中得到，而Lactobacillus、Virgibacillus、Weissella、Glycomyces和Enterobacter在辣椒醅中沒有獲得，應(yīng)該是來源于甜瓣子發(fā)酵。這些細(xì)菌伴隨著整個(gè)豆瓣發(fā)酵過程，可能對(duì)豆瓣風(fēng)味的形成具有重要影響。以前的研究主要探索了真菌(霉菌和酵母菌等)對(duì)郫縣豆瓣風(fēng)味形成的重要影響[11-12]，但是，這些真菌大多存在于制曲階段或者發(fā)酵初期的1個(gè)月，由于高鹽度環(huán)境的影響，以后的發(fā)酵中這些真菌極少出現(xiàn)，而細(xì)菌始終伴隨著郫縣豆瓣的發(fā)酵。客觀上，發(fā)酵時(shí)間越久郫縣豆瓣的醬酯香則越濃郁，產(chǎn)品質(zhì)量越好。因此，細(xì)菌在豆瓣長(zhǎng)時(shí)間發(fā)酵呈香方面扮演著極其重要的作用，而細(xì)菌對(duì)于郫縣豆瓣的呈香的貢獻(xiàn)極少有文獻(xiàn)報(bào)道，這將限制人們對(duì)細(xì)菌發(fā)酵郫縣豆瓣風(fēng)味物質(zhì)形成機(jī)理的深入認(rèn)識(shí)。

(2)首次在郫縣豆瓣中獲得Aidingimonas、Glycomyces和Pantoea屬的細(xì)菌純培養(yǎng)。純培養(yǎng)條件對(duì)于豆瓣環(huán)境中的細(xì)菌而言始終是一種制約，世界上也沒有一種萬(wàn)能的培養(yǎng)基可以完成所有環(huán)境微生物的分離。因此，要想更好地反映郫縣豆瓣細(xì)菌的實(shí)際情況，還需設(shè)計(jì)更多的培養(yǎng)基，并結(jié)合宏基因組學(xué)技術(shù)全面系統(tǒng)闡述。可喜的是，菌株XHU5999和XHU5135與已知的物種同源性都低于98%，STACKEBRANDT和EBERS(2006) 建議原核生物之間98.7%的同源性作為判斷菌株是否為新物種的金標(biāo)準(zhǔn)[14]。因此，XHU5999和XHU5135是郫縣豆瓣發(fā)酵細(xì)菌中的2個(gè)新物種。從表1可以看出，XHU5999來源于豆瓣中，而XHU5135來源于辣椒醅中。這2株菌的同源菌株都具有耐鹽性，那么這2株菌是郫縣豆瓣長(zhǎng)期發(fā)酵自然形成的土著細(xì)菌，還是自然環(huán)境隨意帶入的雜菌，以及在豆瓣發(fā)酵中起什么作用等值得深入研究。

(3)Bacillus、Oceanobacillus和Halomonas是郫縣豆瓣發(fā)酵過程中的優(yōu)勢(shì)菌群，占可培養(yǎng)細(xì)菌總量的84.9%，并且伴隨于豆瓣發(fā)酵的整個(gè)過程(表1)，對(duì)豆瓣風(fēng)味的影響起著重要作用，比如Bacillus屬的菌株通常具有很好的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和纖維素酶活性，它們的酶解產(chǎn)物是美拉德反應(yīng)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，有些產(chǎn)物本身就是風(fēng)味成分。另外，Lactobacillus、Virgibacillus、Weissella、Enterobacter和Gracilibacillus也是分布于豆瓣發(fā)酵的整個(gè)周期(表1)，對(duì)豆瓣發(fā)酵呈香有一定貢獻(xiàn)，如Lactobacillus發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸與酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生的醇類酯化為風(fēng)味物質(zhì)；Pantoea屬的細(xì)菌兼性厭氧，是具有代謝和發(fā)酵類型的化能異養(yǎng)菌，發(fā)酵D-葡萄糖和其它糖類可產(chǎn)酸；Weissella屬的菌株常用于醬油發(fā)酵等。這些菌株在郫縣豆瓣發(fā)酵中的功能特性都值得深入探討。

(4)整個(gè)發(fā)酵過程中，細(xì)菌數(shù)量一直處于動(dòng)態(tài)變化中。從最初的樣品BZ1中，細(xì)菌的數(shù)量是最多的，在發(fā)酵10個(gè)月(BZ10)后，受環(huán)境變化因素影響，細(xì)菌數(shù)量達(dá)到了最低水平(2.2×105個(gè)CFU/g)。隨著辣椒醅的融入發(fā)酵，細(xì)菌數(shù)量明顯提升，說明辣椒醅中的許多細(xì)菌是適應(yīng)于豆瓣發(fā)酵的，并對(duì)環(huán)境變化具有很好的適應(yīng)性。

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Phylogenetic diversity and change of culture-dependent bacteria of Pixian bean paste during fermentation processes

GUAN Tong-wei*, WANG Peng-hao, DENG Ao-yu, TIAN Lei, DONG Dan, ZHAO Shun-xian, XIANG Hui-ping, ZHANG Xi-chao

(Xihua University Institute of Microbiology, Food Biotechnology Laboratory of Sichuan Universities, Chengdu 610039，China)

Bacterial diversity and change of Pixian bean paste during fermentation processes were investigated using culture-dependent method. These bacteria isolated by 6 different media belonged to 11 genera based on 16S rRNA gene sequences analysis, namelyBacillus,Oceanobacillus,Halomonas,Lactobacillus,Virgibacillus,Aidingimonas,Pantoea,Weissell,Enterobacter,GlycomycesandGracilibacillus. Of all the bacteria, species of theBacillusgenus was one of the most abundant.Bacillus,Oceanobacillus,Halomonas,Lactobacillus,Virgibacillus,Weissella,EnterobacterandGracilibacilluswas in all fermentation processes andBacillus.OceanobacillusandHalomonaswere predominated microorganism with corresponding percentage of 84.9%. Phylogenetic analysis showed that strain XHU5999 having lower 16S rRNA gene sequence similarity of 96% withGlycomyceshalotoleransand strain XHU 5135 was the most closely related strain toAidingimonashalophila(97%). The two strains should be designated as two novel species. The results showed that species and quantity of bacteria were changed with environmental change, and they played an important role in flavor formation of Pixian bean paste during fermentation.

Pixian bean paste; fermentation processes; bacterial diversity; dynamic analysis

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201704004

博士，副教授(本文通訊作者，E-mail: guantongweily@163.com)。

食品生物技術(shù)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(Szjj2013-045)；企業(yè)委托項(xiàng)目(15205206、16205224、15205213)資助

2016-10-20，改回日期：2016-12-18