紫薯莜麥酒釀造工藝優(yōu)化

吳芳彤，劉春卯，羅同陽(yáng)，曹倩榮，鄭翔，楊何寶

(河北省微生物研究所，河北 保定，071000)

紫薯莜麥酒釀造工藝優(yōu)化

吳芳彤*，劉春卯，羅同陽(yáng)，曹倩榮，鄭翔，楊何寶

(河北省微生物研究所，河北 保定，071000)

以紫薯、莜麥為原料，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用三步響應(yīng)面法優(yōu)化紫薯莜麥酒的釀造工藝。得到紫薯莜麥酒發(fā)酵工藝條件為：發(fā)酵時(shí)間6 d，發(fā)酵溫度18 ℃，SO2添加量96 mg/L。在該發(fā)酵條件下釀造而成的紫薯莜麥酒酒精度11.00 % vol，花色苷和β-葡聚糖含量分別為21.23和36.85 mg/L，顯著高于對(duì)照組。

紫薯；莜麥；果酒；花色苷；β-葡聚糖

莜麥，又稱裸燕麥，是我國(guó)燕麥種植的主要品種之一，主要分布于我國(guó)西北、西南、華北和湖北等地。與我國(guó)市場(chǎng)上常見(jiàn)的皮燕麥，同屬燕麥屬的不同種。莜麥脂肪和碳水化合物含量低，富含優(yōu)質(zhì)蛋白、亞油酸、維生素、β-葡聚糖、礦物質(zhì)元素等[1-3]。莜麥β-葡聚糖，是一種高分子無(wú)分支線性黏多糖，主要通過(guò)β-(1，3)和 β-(1，4)糖苷鍵連接而成[4]。與其他來(lái)源的β-葡聚糖相比，莜麥β-葡聚糖水溶性和皮膚滲透性更好，更容易被人體吸收利用[5]。紫薯是我國(guó)近年來(lái)從國(guó)外引進(jìn)的紅薯新品種，肉呈紫色至深紫色。紫薯營(yíng)養(yǎng)豐富，除具有普通紅薯的生理保健功效外，還具有其獨(dú)特的保健藥用價(jià)值[6-7]。

本文以紫薯和莜麥為原料，經(jīng)液化、糖化處理后，采用響應(yīng)面優(yōu)化法優(yōu)化其發(fā)酵工藝，以期釀造出不僅具有紫薯酒瑰麗的色澤[8]，而且含有紫薯和莜麥的雙重營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，富含花色苷和β-葡聚糖的發(fā)酵酒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫薯，市售；蔗糖、檸檬酸、NaOH，市售，食品級(jí)；葡萄酒、果酒專用酵母、甜酒曲，均為安琪酵母股份有限公司；α-淀粉酶(30 U/mg)、糖化酶(100 000 U/g)，北京化邁科技生物技術(shù)有限公司；β-葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma-Aldrich股份有限公司；偏重亞硫酸鉀，意大利Enartis股份有限公司，食品級(jí)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紫薯莜麥酒釀造工藝流程

1.2.2 菌種的活化

將5%的安琪葡萄酒、果酒專用干酵母，加入到含糖2%的溶液中，在35～40 ℃下攪拌活化約15～30 min，直至糖水中出現(xiàn)大量的小氣泡為止。

1.2.4 紫薯和莜麥的預(yù)處理

紫薯的液化采用工業(yè)酶液化法。挑選無(wú)霉變、病蟲(chóng)傷害的新鮮紫薯，洗凈，隔水蒸煮30 min左右至無(wú)硬心，與純凈水按照1∶1.5(g∶mL)的料液比混勻打漿。用檸檬酸和NaOH調(diào)節(jié)pH至6.5，0.25% α-淀粉酶添加量，95 ℃液化70 min。得到的紫薯液繼續(xù)添加0.1%的糖化酶，調(diào)節(jié)pH至4.0，65 ℃糖化95 min。即得處理好的紫薯發(fā)酵醪。

莜麥液化處理采用恒溫浸出糖化法。莜麥挑選去除雜質(zhì)霉變，粉碎過(guò)40目篩，隔水蒸煮30 min，將蒸好的莜麥，采用淋水冷卻法，冷卻到30～37 ℃，備用。以0.5%的接種量(以干莜麥量為計(jì))將甜酒曲均勻的撒入其中，攪拌均勻，溫度控制在28 ℃左右。發(fā)酵30～36 h時(shí)，莜麥表面出現(xiàn)糖化菌絲，此時(shí)將莜麥二次攪拌混勻，發(fā)酵72 h結(jié)束。

將預(yù)處理好的紫薯和莜麥發(fā)酵醪按照2∶1的比例混合，調(diào)節(jié)pH和糖度，按照一定比例添加SO2，115～117 ℃高溫高壓滅菌15～20 min，冷卻到室溫，備用。

1.2.5 單因素試驗(yàn)對(duì)紫薯莜麥酒的發(fā)酵工藝的優(yōu)化

本試驗(yàn)選取對(duì)紫薯莜麥酒影響較大的6個(gè)因素：初始pH、發(fā)酵溫度、接種量、發(fā)酵時(shí)間、初始糖度、SO2添加量。每個(gè)因素設(shè)5個(gè)梯度，初始pH 2.5、3.0、3.5、4.0、4.5；發(fā)酵溫度 16、18、20、22、24 ℃；接種量0.05%、0.10%、0.15%、0.2%、0.25 %；發(fā)酵時(shí)間 3、5、7、9、11 d；初始糖度 14、16、18、20、22 Brix；SO2添加量50、55、60、65、70 mg/L。以酒精度、花色苷和β-葡聚糖為檢測(cè)指標(biāo)，考察這6個(gè)因素在紫薯莜麥酒釀造中的最優(yōu)指標(biāo)。

1.2.6 響應(yīng)面法優(yōu)化紫薯莜麥酒的發(fā)酵工藝

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以酒精度作為響應(yīng)目標(biāo)，采用三步法進(jìn)行優(yōu)化：首先通過(guò)Plackett-Burman設(shè)計(jì)找到對(duì)響應(yīng)影響的顯著因素；接著通過(guò)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)快速逼近最佳值區(qū)域；最后利用響應(yīng)面方法中的中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，擬合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得到二階響應(yīng)面模型，進(jìn)而得到紫薯莜麥酒最優(yōu)發(fā)酵工藝，并進(jìn)行驗(yàn)證。采用Design-Expert 8.0.6進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析及處理。

1.2.6.1 Plackett Burman的篩選設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)

選取6個(gè)因素作為考察對(duì)象：初始pH、發(fā)酵溫度、接種量、發(fā)酵時(shí)間、初始糖度、SO2添加量。

1.2.6.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)

響應(yīng)面擬合方程只有在接近最佳值區(qū)域才近似于真實(shí)情況，因此要盡可能逼近最大產(chǎn)酒精區(qū)域才能建立有效地響應(yīng)面方程[9]。根據(jù)1.3.3.1 PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選得到對(duì)酒精度影響顯著的3個(gè)因素做最陡爬坡實(shí)驗(yàn)。

1.2.6.3 中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)(CCD)

根據(jù)PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取影響顯著的3個(gè)變量，每個(gè)因素選取-1、0、+1，在最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定的最佳區(qū)域內(nèi)，以酒精度作為響應(yīng)值(Y)，利用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析及處理。

1.2.7 酒精度和糖度含量的測(cè)定方法

酒精度采用GB/T15038—2006中酒精計(jì)法，以20 ℃時(shí)容量百分?jǐn)?shù)表示的酒精水溶液濃度計(jì)算。糖度的測(cè)量采用SB/T10203—1994中阿貝折光儀法測(cè)定。

1.2.8 花色苷的測(cè)定方法

pH示差法。吸取一定量酒樣于50 mL燒杯中，用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液調(diào)節(jié)pH 3.0，定容到50 mL即為稀釋酒樣。取稀釋酒樣1 mL，分別加入pH 1.0和pH 4.5的緩沖溶液 9 mL，40 ℃水浴平衡 30 min，以蒸餾水為空白對(duì)照，分別測(cè)定A510 nm和A700 nm[10]。

稀釋后樣品的吸光度ΔA按公式(1)計(jì)算：

ΔA=(A510-A700)pH 1.0- (A510-A700)pH 4.5

(1)

樣品的花色苷含量(mg/L)按公式(2)計(jì)算：

花色苷含量=[ (ΔA×MW)/(ε×1)]×DF×1 000

(2)

其中：MW，矢車(chē)菊素葡萄糖苷的相對(duì)分子質(zhì)量(484.82 mg/mol)；ε，矢車(chē)菊素葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)(24 825 mol-1)；DF，稀釋因子(樣品總的稀釋倍數(shù))。

1.2.9 β-葡聚糖的測(cè)定方法

剛果紅法。分別配制5、10、15、20、25、30、35 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)β-葡聚糖溶液，在545 nm處分別測(cè)定吸光度，在曲線上求A為1時(shí)的β-葡聚糖含量(即為K值)。以β-葡聚糖濃度(C)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取稀釋的紫薯莜麥保健酒飲料2.0 mL分別加入4.0 mL的剛果紅，20 ℃水浴30 min以蒸餾水為空白對(duì)照，545 nm處測(cè)定吸光度(A1)。為了消除酒樣顏色對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，同時(shí)測(cè)定了各酒樣的吸光度(A0)，即最終酒樣吸光度為ΔA=A1-A0[11-12]。

β-葡聚糖含量/(mg·L-1)=K×ΔA×稀釋倍數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素優(yōu)化紫薯莜麥酒發(fā)酵工藝的結(jié)果

紫薯莜麥酒發(fā)酵工藝單因素選擇結(jié)果如圖1所示，隨著各項(xiàng)工藝參數(shù)的遞增，酒精度、花色苷和β-葡聚糖均呈現(xiàn)先增加后減少或平穩(wěn)的趨勢(shì)。當(dāng)發(fā)酵醪初始pH 3.5、發(fā)酵溫度20 ℃、發(fā)酵時(shí)間7 d、初始糖度18 Brix、SO2添加量為60 mg/L時(shí)，酒精度、花色苷和β-葡聚糖均達(dá)到最大值。這可能是花色苷的穩(wěn)定性較差，溫度、pH、糖、SO2添加量等均對(duì)其有影響。

本品采用的安琪葡萄酒果酒專用酵母最適溫度在20 ℃左右，溫度和pH過(guò)高或過(guò)低均不利于酵母的繁殖和催化酒精反應(yīng)。糖度與酒精度有直接關(guān)系，糖在酵母菌的作用下轉(zhuǎn)化成為酒精和SO2，但在自然釀酒條件下，達(dá)到一定酒精濃度后，隨著糖度的增加酒精度基本保持不變。釀酒酵母對(duì)SO2的抗性較強(qiáng)，在發(fā)酵過(guò)程中添加SO2從而達(dá)到抑制其他雜菌生長(zhǎng)的作用，提高酵母菌的發(fā)酵能力。

花色苷是類黃酮化合物，在植物、食品中以多種形式存在，目前已知種類有22大類。花色苷的穩(wěn)定性受溫度影響非常大，在一定范圍內(nèi)隨溫度的升高，花色苷向著無(wú)色的查爾酮和甲醇假堿形式轉(zhuǎn)化；在酸性條件下，隨著溫度的降低，其結(jié)構(gòu)可逆轉(zhuǎn)變成紅色的花色苷陽(yáng)離子形式[13]。高濃度的糖分含量有利于花色苷顏色的保護(hù)，低濃度的糖分含量，加速花色苷的降解[14]。SO2是食品中常用的防腐劑和漂白劑，在果酒中添加SO2具有殺菌、澄清、護(hù)色、改善酒的味感質(zhì)量等作用，根據(jù)我國(guó)《NYT 1508—2007 綠色食品 果酒》中規(guī)定成品酒中SO2含量≤250 mg/L，過(guò)多或過(guò)少的SO2在酸性環(huán)境中形成亞硫酸氫根，親核攻擊花色苷C2或C4位生成無(wú)色的花色苷亞硫酸鹽復(fù)合物[15]。

圖1 單因素優(yōu)化結(jié)果Fig.1 The optimal results of single factor design

β-葡聚糖在莜麥內(nèi)以多種結(jié)構(gòu)形式存在，但都是通過(guò)β-1,3鍵和β-1,4鍵連接而成的直鏈β-D-葡萄糖。發(fā)酵過(guò)程中β-葡聚糖基本不參與，但與酒精度有較強(qiáng)的聯(lián)系。β-葡聚糖的含量，隨著酒精度的升高，呈上升趨勢(shì)。這可能是因?yàn)檩^高的乙醇濃度增強(qiáng)了β-葡聚糖內(nèi)的交鏈作用。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化紫薯莜麥酒發(fā)酵工藝的結(jié)果

2.2.1 PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1.1 PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以單因素最優(yōu)指標(biāo)為“-1”變量，“+1”取最低水平的1.5倍，選取6個(gè)因素，共進(jìn)行12次實(shí)驗(yàn)以確定每個(gè)因素的影響水平。編碼表見(jiàn)表1。以酒精度(Y)作為實(shí)驗(yàn)響應(yīng)值，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。運(yùn)用Design Expert8.0.6軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，回歸方程：Y=10.6-0.53X1-100X2+0.12X3+1.27X4-0.20X5-1.53X6，R2=0.918 0。

表1 Plackett Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平

表2 PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2.1.2 PB實(shí)驗(yàn)的回歸模型方差分析

表3 PB實(shí)驗(yàn)的回歸模型方差分析

注：**表示極顯著(P<0.01);*表示顯著(P<0.05)。

2.2.1.3 PB實(shí)驗(yàn)的回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)

PB實(shí)驗(yàn)的回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，見(jiàn)表4。各因素對(duì)紫薯莜麥酒酒精度的影響順序?yàn)椋篠O2添加量>發(fā)酵時(shí)間>發(fā)酵溫度>初始pH>初始糖度>接種量。其中SO2添加量、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度是顯著因素，其余為不顯著因素。

表4 PB實(shí)驗(yàn)的回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)

注：**表示極顯著(P<0.01);*表示顯著(P<0.05)。

2.2.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

由PB實(shí)驗(yàn)可知，發(fā)酵溫度和SO2添加量均呈顯著負(fù)效應(yīng)，應(yīng)逐漸減小，發(fā)酵時(shí)間呈顯著正效應(yīng)，應(yīng)逐步增加發(fā)酵時(shí)間。根據(jù)這3個(gè)因素效應(yīng)大小比例設(shè)定他們的變化方向及步長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。3號(hào)實(shí)驗(yàn)的酒精度最高，因此以實(shí)驗(yàn)3為中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

表5 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2.3 中心組合設(shè)計(jì)(CCD)

2.2.3.1 CCD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)和最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定了3個(gè)對(duì)紫薯莜麥酒發(fā)酵影響顯著的因素并設(shè)定中心點(diǎn)。以(A)發(fā)酵溫度、(B)發(fā)酵時(shí)間和(C)SO2添加量為自變量，以酒精度(Y)作為實(shí)驗(yàn)響應(yīng)值，利用Design-Expert軟件中的CCD實(shí)驗(yàn)對(duì)上述3個(gè)因素進(jìn)行通用旋轉(zhuǎn)中心組合設(shè)計(jì)(表6)。

表6 CCD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平

PB實(shí)驗(yàn)確定了發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和SO2添加量為影響紫薯莜麥酒的主要因素，最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定了這3個(gè)因素的中心點(diǎn)，利用CCD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3因素2水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，以酒精度(Y)作為響應(yīng)值，以酒精度最大為優(yōu)化目標(biāo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值見(jiàn)表7。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用逐步回歸的方法進(jìn)行二次回歸分析，剔除不顯著的因素，得到的回歸方程如下式：

Y=10.97+0.54A+0.20B-0.18C-0.90AB+0.63BC-1.39A2-1.41B2-0.34C2

表7 CCD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值

2.2.3.2 CCD實(shí)驗(yàn)回歸模型方差分析及響應(yīng)面與等高線分析

表8 二次逐步回歸模型方差分析表

注：**表示極顯著(P<0.01);*表示顯著(P<0.05)。

由圖1和圖2的響應(yīng)面圖可知，在無(wú)SO2添加的情況下，隨著發(fā)酵溫度升高和發(fā)酵時(shí)間的不斷增加，酒精度呈上升趨勢(shì)至最高點(diǎn)，但發(fā)酵溫度過(guò)高和時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，也會(huì)導(dǎo)致酒精度的小幅度下降；在發(fā)酵時(shí)間一定的情況下，SO2添加量的減少和發(fā)酵溫度的降低有利于酒精度的提高，但過(guò)低的SO2含量和過(guò)低的發(fā)酵溫度也不利于酒精的生成。

圖2 發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度對(duì)酒精度交互用影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.2 Response surface plot and contour plot for the interactive effects of fermentation time and fermentation temperature on alcohol content

圖3 發(fā)酵溫度和SO2添加量對(duì)酒精度交互用影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.3 Response surface plot and contour plot for the interactive effects of fermentation temperature and additive amount of SO2 on alcohol content

2.2.3.3 紫薯莜麥酒最優(yōu)發(fā)酵工藝條件的確定

根據(jù)CCD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)獲得的結(jié)果和回歸方程，經(jīng)分析獲得，最佳紫薯莜麥酒發(fā)酵工藝條件為：發(fā)酵時(shí)間6 d，發(fā)酵溫度18 ℃，SO2添加量96 mg/L。預(yù)測(cè)紫薯莜麥酒的酒精度理論值為10.97 %vol。為驗(yàn)證響應(yīng)面優(yōu)化法的可靠性，在其他條件一定的情況下，采用上述最優(yōu)發(fā)酵工藝條件，經(jīng)3次平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得紫薯莜麥酒的酒精度為11.00 %vol，與理論值相比高出0.03 %，無(wú)顯著差異。因此，基于PB實(shí)驗(yàn)的中心組合實(shí)驗(yàn)得到的最優(yōu)紫薯莜麥酒發(fā)酵工藝條件具有可靠性。

2.4 紫薯莜麥酒特有功能性成分分析

對(duì)基于2.3得到的最優(yōu)發(fā)酵工藝條件下釀造而成的紫薯莜麥酒，進(jìn)行花色苷和β-葡聚糖含量的分析，以張?jiān)＝厌劷獍偌{、長(zhǎng)城干紅和農(nóng)家自釀紫薯酒作為對(duì)照。測(cè)得在最佳發(fā)酵工藝條件下釀造的紫薯莜麥酒花色苷和β-葡聚糖含量分別為21.23和36.85 mg/L，而張?jiān)＝厌劷獍偌{、長(zhǎng)城干紅和農(nóng)家自釀紫薯酒的花色苷含量分別為15.64、11.46 mg/L和15.68 mg/L，β-葡聚糖含量分別為6.44 mg/L、6.35 mg/L和7.32 mg/L。因此，本品花色苷和β-葡聚糖含量均高于對(duì)照樣品，具有良好的抗氧化活性和抗衰老的功效。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)得到初始pH、發(fā)酵溫度、接種量、發(fā)酵時(shí)間、初始糖度、SO2添加量的最優(yōu)條件為：pH 3.5、20 ℃、0.2%、7 d、18 Brix、60 mg/L。在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以酒精度作為響應(yīng)目標(biāo)，采用三步法進(jìn)行優(yōu)化,得到最佳紫薯莜麥酒發(fā)酵工藝條件為：發(fā)酵時(shí)間6 d，發(fā)酵溫度18 ℃，SO2添加量96 mg/L。在該發(fā)酵條件下釀造而成的紫薯莜麥酒酒精度11.00 %vol，花色苷和β-葡聚糖含量分別為21.23和36.85 mg/L，均高于對(duì)照組。因此，優(yōu)化得到的紫薯莜麥酒發(fā)酵工藝條件結(jié)果可靠，獲得的成品酒色澤瑰麗，口感綿柔，并且富含花色苷和β-葡聚糖。

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Brewing technology of purple sweet potato and hulless oat wine

WU Fang-tong*, LIU Chun-mao, LU Tong-yang, CAO Qian-rong, ZHENG Xiang, YANG He-bao

(Hebei Research Institute of Microbiology,Baoding 071000, China)

On the basis of single factor experiment, the brewing technology of purple sweet potato and hulless oat wine was optimized by three steps response surface methodology. Results showed that the optimal fermentation condition of purple sweet potato and hulless oat wine was fermentation at 18 ℃ for 6 d with addition of SO296 mg/L. Under these optimized conditions, the alcohol degree was 11.00 %vol, and the contents of anthocyanin and β-glucan were 11.00 %vol, 21.23 and 36.85 mg/L, respectively, which were significantly higher than those of the control group.

purple sweet potato; hulless oat; anthocyanin; β-glucan

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201704020

碩士，講師(本文通訊作者，E-mail:yayawu710@hotmail.com)。

2016-10-14，改回日期：2016-11-18