茶樹精油電輔助加熱熏蒸處理對草莓品質和相關酶類的影響

魏彥珍 ，邵興鋒，韋瑩瑩，許鳳，王鴻飛

(寧波大學,食品科學與工程系,浙江 寧波,315211)

茶樹精油電輔助加熱熏蒸處理對草莓品質和相關酶類的影響

魏彥珍 ，邵興鋒*，韋瑩瑩，許鳳，王鴻飛

(寧波大學,食品科學與工程系,浙江 寧波,315211)

為了減少精油用量、節約成本，對茶樹精油采用電輔助加熱的熏蒸處理方法，分析該方法對草莓果實貯藏期間品質和代謝相關酶類的影響。結果表明，0.001%的茶樹精油熏蒸處理可以減緩可溶性固形物(total soluble solid ，TSS)含量和硬度的下降，維持果實表面的亮度和紅度，減緩果實貯藏期間過氧化氫(H2O2)含量的上升，提高過氧化氫酶(catalase，CAT)和多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)活性，降低抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)和苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase，PAL)的活性，對超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和β-1,3-葡聚糖酶幾乎無影響。可見，電輔助加熱茶樹精油熏蒸處理可以在節約精油用量的同時，較好地保持草莓的品質，延緩果實衰老。

茶樹精油；熏蒸；草莓；品質

草莓是種深受消費者的喜愛的水果。但草莓含水率高達90%～95%，組織嬌嫩，且無外皮保護作用，在采收和貯運中易受損傷或微生物侵染而腐爛變質，極不耐貯藏[1-4]。目前，化學防腐劑在果蔬采后貯藏保鮮中的應用已十分廣泛，但許多人工合成的化學防腐劑存在誘癌性、致畸性和易引起食物慢性中毒等不安全問題[5]。在食品安全性越來越重視的今天，天然安全的食品保鮮劑的開發與應用顯得尤為重要。

植物精油是植物的次生代謝產物，作為天然源保鮮劑的重要來源，具有較好的揮發性，以直接接觸或熏蒸的方式在食物周圍形成抑菌氛圍，從而達到防腐保鮮的效果[6]。茶樹精油(tea tree oil，TTO)具有良好的廣譜殺菌抑菌和保健作用，并有宜人的肉蔻香氣，是公認優良的天然芳香劑、抗菌劑、防腐劑，主要應用在日化、制藥、食品等行業[7]。SHI等[8]發現，TTO抑制金黃色葡萄球菌，同時減少金黃色葡萄球菌腸毒素含量。SZCZERBANIK等[9]研究發現，TTO在熏蒸條件下可不同程度的抑制多種果蔬病原菌的生長。CHUTIA等[10]認為植物精油熏蒸處理對水果的防腐保鮮作用效果明顯好于浸泡等處理方法；邵興鋒等[11]發現，0.66 mL/L TTO熏蒸可對草莓起到較好的保鮮效果，但精油用量大、殘留多。為了節約TTO的用量，本實驗研究電輔助加熱的TTO熏蒸保鮮草莓，分析該處理方式對草莓常溫貯藏期間果實品質和相關酶類的影響，以期為植物精油的商業化應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試草莓采摘于浙江省寧波市江北區的草莓種植基地，品種為＂紅顏＂。采摘時，選擇大小相對一致的果實。早晨采摘后立即運送回實驗室，挑選無機械損傷、無病蟲害的正常商業成熟度的果實。

NaCl，Na2HPO4·12H2O，NaH2PO4·2H2O，抗壞血酸(均為分析純)，鄰苯二酚(化學純)國藥集團化學試劑；H2O2(30%)上海阿拉丁生化科技股份有限公司；TTO由福州美樂蓮生物科技有限公司提供。

1.2 儀器與設備

LE2002E/02電子天平、FE20實驗室pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；90-3雙向定時磁力攪拌器，上海青浦滬西儀器廠；UV-1600型紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；GL-20G-Ⅱ型冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠；HH-2數顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；GY-1型果實硬度計，杭州托普儀器有限公司；WYH型手持折射糖度儀，泉州光學儀器廠；CR-400色差儀，柯尼卡美能達公司。

1.3 處理方法及分組

1.3.1 熏蒸裝置的設計及濃度的選擇

為了使精油充分揮發，本試驗自主設計了簡易熏蒸裝置。裝置由4個部分組成：8 L密封的塑料箱，20 W電熱杯墊，培養皿和簡易支架(圖1)。為了促進精油的揮發，將精油加到培養皿上，立即密封箱體，打開電源通電30 min，隨后關閉電源。密閉熏蒸12 h后，打開箱體通風以散發精油。

在預實驗中，分別嘗試了0.001%、0.003%、0.005%、0.01%、0.03%、0.06%、0.09%的濃度梯度和2、3、4、12 h的時間梯度。綜合考慮藥傷、品質變化等，最終選擇0.001% TTO熏蒸處理12 h。

圖1 TTO電輔助加熱的熏蒸裝置Fig.1 Fumigation device for TTO electric auxiliary heating

1.3.2 草莓熏蒸處理

將草莓果實隨機分成2組：第1組為熏蒸組(TTO)，將草莓果實置于裝有加熱裝置的保鮮盒中，加入80 μL TTO(0.001%，v/v)密閉熏蒸12 h。熏蒸結束后將果實置于(20±1) ℃環境中貯藏以模擬貨架期4 d。第2組果實為對照組(CK)，未作任何處理。每個處理組設3個重復試驗，每個重復含90個果實；每天從每個重復試驗組中取15個果實進行分析。樣品用液氮速凍研磨成粉末，并于-40 ℃保存用于測定各項指標。

1.4 測定方法

1.4.1 硬度

硬度采用GY-1型果實硬度計測定，隨機取5個果實，每個果實分別測定陰陽面赤道部位，重復10 次，取平均值[12]。

1.4.2 可溶性固形物(TSS)含量

采用手持折射儀測定。

1.4.3 可滴定酸(TA)含量

采用NaOH滴定法。稱取10 g果肉，用均質機打成勻漿，加入10 mL蒸餾水，勻漿蒸餾水定容至250 mL，過濾收集濾液，用標準NaOH溶液滴定，結果以檸檬酸百分數表示[13]。

1.4.4 果實顏色

采用 CR-400 色彩色差儀測定表示果實表面色澤的L*、a*值。L*值代表亮度，a*值代表紅綠度。

1.4.5 腐爛指數

腐爛指數的測定參照LIU等[14]的方法并做調整。按腐爛面積大小將果實劃分為5級：0級，無腐爛；1級，腐爛面積占果實面積的0 ～ 25%；2級，腐爛面積占果實面積的25%～50%；3級，腐爛面積大于果實面積50%～75%，4級，腐爛面積大于果實面積75%。計算公式為：(0×N0+1×N1+2×N2+3×N3+4×N4)/(4×N)，N0、N1、N2、N3、N4、分別為各級腐爛個數，N為總的草莓個數。

1.4.6 過氧化氫和抗氧化相關酶類活性的測定

過氧化氫(hydrogen peroxide, H2O2)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性均采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒進行測定。抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)活性的測定參照Pedro等[15]的方法，以每分鐘酶促反應體系吸光度變化0.01為一個APX活力單位(U)。過氧化氫酶(catalase，CAT)活性的測定參照田平平[16]的方法，以每分鐘酶促反應體系吸光度變化0.1為1個U。

1.4.7 抗病相關酶類的活性測定

苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase，PAL)參照CAI等[17]的方法。β-1,3-葡聚糖酶和多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)酶活參照WANG等[18]的方法。PAL以每小時酶促反應體系吸光度變化0.01為1個U。β-1,3葡聚糖酶以每小時從昆布多糖中釋放出1 μmol葡萄糖所要的酶量為1個U。PPO每分鐘酶促反應體系吸光度變化0.01為1個PPO活力單位(U)。

1.5 數據處理與分析

采用Origin 8.0進行數據處理，SAS統計軟件進行方差分析，用鄧肯多重比較方法進行差異顯著性分析。當P<0.05時，表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 TTO熏蒸處理對草莓硬度的影響

硬度是評價草莓果實品質的重要指標。如圖2所示，隨著貯藏時間的延長草莓果實的硬度呈先小幅上升后下降的趨勢，TTO熏蒸能減緩硬度的下降。在貯藏的第4天，對照組草莓硬度為3.9 N，而處理組為4.7 N，顯著高于對照果實(P<0.05)。

圖2 茶樹精油熏蒸處理對草莓硬度的影響Fig.2 Effects of tea tree oil fumigation on hardness of strawberry fruit

2.2 TTO熏蒸處理對草莓TSS和TA含量的影響

果實TSS和 TA 含量是評價果實風味的的重要指標。在貯藏期間，草莓果實的TSS隨著時間的延長而降低(圖3A)，TTO熏蒸可以減緩TSS的減少，且在第4天，處理組顯著高于對照組(P<0.05)。由圖3B可見，處理組草莓果實的 TA 含量低于對照組，且在貯藏的第2和第3天，均有明顯差異(P<0.05)。

圖3 茶樹精油熏蒸對草莓TSS(A)和TA(B)的影響Fig.3 Effects of tea tree oil fumigation on the TSS(A) and TA(B) of strawberry fruit

2.3 TTO熏蒸處理對草莓果實顏色的影響

從L*、a*值可以看出草莓果實表面色澤的變化。如圖4A所示，L*值隨著貯藏時間的增加而增加，且對照組高于處理組。在貯藏過程中，草莓表面a*值在貯藏前期升高(圖4B)，后期逐漸降低。從第2天起，處理組的a*值顯著高于對照組(P<0.05)，且在第3天時高出15%。

圖4 茶樹精油熏蒸對草莓果實顏色L*值(A)和a*值(B)的影響Fig.4 Effects of tea tree oil fumigation on L* value (A) and a* value(B) of strawberry fruit color

2.4 TTO熏蒸處理對草莓腐爛的影響

采用腐爛指數這一反映腐爛發生和嚴重程度的綜合性指標來體現草莓貯藏過程中的自然腐爛(圖5)。貯藏2 d后，處理組和對照組果實均可見果實腐爛的發生。隨后腐爛指數逐漸增加，TTO熏蒸處理組的腐爛指數一直低于對照組。在第4天時，對照組的腐爛指數顯著高于處理組(P<0.05)，且高出38%。對照組在室溫下貯藏3天后，腐爛指數就接近0.3，而處理組是在第4天才達到0.3以上。

圖5 茶樹精油熏蒸對草莓腐爛指數的影響Fig.5 Effects of tea tree oil fumigation on the decay index of strawberry fruit

2.5 H2O2含量、SOD、CAT和APX活性的變化

在整個貯藏過程中，H2O2含量隨著貯藏時間的增加而升高(圖6A)。與對照組相比，TTO熏蒸處理后草莓果實H2O2含量一直保持在較低的水平，這表明TTO熏蒸有利于抑制H2O2含量。在貯藏的第2天和第3天，處理組H2O2含量分別比對照高11.4%和21.9%(P<0.05)。草莓采后SOD活性呈現先升高后下降的趨勢(圖6B)。除第3天時處理組SOD活性顯著低于對照組(P<0.05)外，其他時間點2組均無顯著差異。如圖6C所示，草莓的CAT活性整體上是先升高后下降。在采后貯藏的第2天，處理組的CAT活性比對照組高158.4%，而在第3天時，處理組CAT活性比對照組高19.0%，均有顯著差異(P<0.05)，但在其他時間上均無顯著差異。APX 也是清除H2O2的重要酶。如圖6D所示，對照組和處理組APX活性的變化趨勢大致相似。與對照組相比，處理組的APX活性在第2、3天時顯著(P<0.05)低，但在其他時間點無顯著差異。

圖6 茶樹精油熏蒸對草莓H2O2含量(A)、SOD(B)、CAT(C)和APX活性(D)的影響Fig.6 Effects of tea tree oil fumigation on the content of H2O2(A) and the activity of SOD(B), CAT(C) and APX (D) in strawberry

2.6 PAL、PPO和β-1,3-葡聚糖酶活性的變化

從圖7A可知，在整個貯藏過程中，對照組PAL活性先升高后下降，而處理組的PAL的活性一直維持在一個穩定的狀態，且對照組PAL活性一直高于處理組。從圖7B可知，在貯藏1 d以后，處理組的PPO活性高于對照組，且在第2天和第4天時差異顯著(P<0.05)。從圖7C可知，2組果實的β-1,3-葡聚糖酶活性都是先升高后下降的趨勢，且均在第3天達到峰值。對照組酶活性在第3天時顯著(P<0.05)高于處理組。

圖7 茶樹精油熏蒸對草莓PAL(A)、PPO(B)和β-1,3-葡聚糖酶活性(C)的影響Fig.7 Effects of tea tree oil fumigation on the activity of PAL (A), PPO (B) and β-1,3-glucanase in Strawberry

3 討論

草莓是一種非呼吸躍變型果實[19]，采后沒有后熟作用。所以為了達到其最佳的食用品質，一般在完全成熟時采收。在銷售過程中，能引起消費者購買欲望的第一商品價值指標應該是外觀和硬度，口感是購買后消費產生的第二商品價值[20]。因此，維持草莓的外觀品質和口感就尤為重要。本研究結果表明，TTO電輔助加熱熏蒸處理可以有效地維持草莓果實的硬度和亮度，并維持草莓的紅度，從而使草莓保有誘人的光澤度。同時還對維持可溶性固形物的含量的降低和可滴定酸的含量有一定作用，使得處理后的草莓保有較好的口感。同時，TTO熏蒸能有效降低草莓果實的腐爛。這與程賽等[21]研究2 000 mg/L TTO熏蒸可以維持草莓品質、降低草莓腐爛的結果一致。但是程賽實驗中TTO用量較大，且自然熏蒸處理后還有大量的精油殘留，造成浪費。本研究采用電輔助加熱的方法，促進精油的揮發，極大的降低了TTO濃度(僅為0.001%)，也能發揮較好的保鮮作用，并延長貨架期。

果實衰老是由于果實機體內活性氧生成能力增強而清除能力下降, 從而使活性氧水平升高, 促使細胞發生膜脂過氧化而引起膜降解導致果實傷害[22]，加速衰老。LAKIMOVA等[23]研究發現NO能顯著減少H2O2的含量，并在貯藏期間一直保持較低水平，這與延長貨架期和降低電解質滲透率相關，從而減緩衰老。GAO等[24]研究發現褪黑素能減少桃果實中H2O2含量，也與減緩衰老相關。植物在逆境脅迫下,體內活性氧產生和清除系統間的平衡被打破,因此SOD、CAT和APX活性的變化反映了植物在逆境下通過自身對環境脅迫做出保護性應激反應[25]。SOD能清除超氧陰離子過多造成的毒害作用，在生命體的自我保護系統中起著重要的作用。H2O2的清除則由 CAT、APX 等酶的共同反應完成。本實驗中，TTO電輔助加熱熏蒸處理使草莓果實H2O2含量保持在較低水平，說明該處理較好的延緩了果實H2O2的積累，延緩衰老進程。WANG等[18]研究發現,熱空氣處理可以通過保持更高的SOD、CAT和較低的APX活性可以減少甜櫻桃青霉腐爛。SHAN等[26]研究發現LaCl3處理可以通過提高抗氧化酶活清除過量的H2O2防止鮮切百合花的衰老。本研究結果表明，TTO熏蒸可以通過較高的CAT活性和較低的SOD、APX保持較低的H2O2含量，從而延緩草莓果實衰老，減少腐爛。

PAL、PPO和β-1,3-葡聚糖酶都參與植物的抗病防御機制。PAL對生物合成酚類、植物抗毒素及木質素有重要作用；β-1,3-葡聚糖酶是重要的病程相關蛋白，可以分解病原菌細胞壁；而PPO則可以通過氧化酚類成為有抗菌作用的醌。吳新[27]發現異硫氰酸烯丙酯精油雖然不能提高抗病相關酶活，但是它的抑菌效果好。同時，ARREBOLA等[28]也發現植物精油(百里香精油和檸檬草精油)可減少桃果實腐爛，但并沒有提高抗病相關酶活。但是，SHAO等[12]研究發現0.9 g/L TTO提高了草莓的誘導抗性。本研究采用較低濃度TTO熏蒸對草莓進行處理，沒能有效提高草莓果實的抗病性，但依然可以減小腐爛指數，這主要是由于TTO對病原真菌的直接抑制作用。

4 結論

本實驗通過研究，發現0.001%的TTO電輔助加熱熏蒸能一定程度維持草莓貯藏品質，減少果實采后腐爛，延緩草莓衰老，延長果實貯藏期。探究改進傳統熏蒸方法，能極大地減少TTO的用量，在發揮防腐保鮮效果的同時，節約了使用成本。這將更有利于該技術在生產實際中的應用。

[1] 張紅印,馬龍傳,姜松,等.臭氧結合拮抗酵母對草莓采后灰霉病的控制[J].農業工程學報,2009,25(5):258-263.

[2] 龔吉軍,唐靜,李振華,等.臭氧與高氧處理對采后草莓品質的影響[J].中南林業科技大學學報, 2010,30(9):76-80.

[3] ALVAREZ-FERNANDEZ M A,HORNEDO-ORTEGA R,CEREZO A B,et al.Effects of the strawberry (Fragariaananassa) puree elaboration process on non-anthocyanin phenolic composition and antioxidant activity[J].Food chemistry,2014,164:104-112.

[4] PAN Lei-qing,ZHANG Wei,ZHU Na,et al. Early detection and classification of pathogenic fungal disease in post-harvest strawberry fruit by electronic nose and gas chromatography-mass spectrometry[J]. Food Research International,2014,62:162-168.

[5] FARZANEH M,KIANI H,SHARIFI R,et al.Chemical composition and antifungal effects of three species of Satureja (S. hortensis, S. spicigera, and S. khuzistanica) essential oils on the main pathogens of strawberry fruit[J]. Postharvest Biology and Technology,2015,109:145-151.

[6] 段偉麗,包怡紅.植物精油在食品保鮮中的應用研究[J].中國林副特產,2015(1):94-97.

[7] 靜瑋,蘇子鵬,朱德明,等.茶樹油熏蒸處理對香蕉采后炭疽病害的影響[J].農業工程學報, 2011,27(5):378-384.

[8] SHI Ce,ZHAO Xing-chen,YAN Hai-yang,et al. Effect of tea tree oil on Staphylococcus aureus growth and enterotoxin production[J]. Food Control, 2016，62:257-263.

[9] SZCZERBANIK M,JOBING J,MORRIS S,et al.Essential oil vapours control some common postharvest fungal pathogens[J]. Australian Journal of Experimental Agriculture, 2007,47(1):103-109.

[10] CHUTIA M,DEKA BHUYAN P,PATHAK M G,et al.Antifungal activity and chemical composition of Citrus reticulata Blanco essential oil against phytopathogens from North East India[J].LWT-Food Science and Technology, 2009,42(3):777-780.

[11] 邵興鋒,程賽,王鴻飛,等.茶樹精油熏蒸處理保鮮草莓的工藝優化[J]. 農業工程學報, 2012,28(19):279-286.

[12] SHAO Xing-feng,WANG Hong-fei,XU Feng,et al. Effects and possible mechanisms of tea tree oil vapor treatment on the main disease in postharvest strawberry fruit[J]. Postharvest Biology and Technology, 2013,77:94-101.

[13] 蔡艷,施麗愉,陳偉,等. UV-C處理對采后草莓果實品質和活性氧代謝的影響[J].中國食品學報,2015,15(3):128-136.

[14] LIU Feng-juan,TU Kang,SHAO Xing-feng,et al.Effect of hot air treatment in combination with Pichia guilliermondii on postharvest anthracnose rot of loquat fruit[J].Postharvest Biology and Technology,2010,58(1):65-71.

[15] ZAPATA Pedro J,MART NEZ-ESPL Alejandra,GUILL N Fabián,et al.Preharvest application of methyl jasmonate (MeJA) in two plum cultivars. 2.Improvement of fruit quality and antioxidant systems during postharvest storage[J].Postharvest Biology and Technology, 2014,98:115-122.

[16] 田平平,王杰,秦曉藝,等.采后處理對杏鮑菇貯藏品質及抗氧化酶系統的影響[J].中國農業科學, 2015,48(5):941-951.

[17] CAI Zi-kang,YANG Rong,XIAO Hong-mei,et al.Effect of preharvest application of Hanseniaspora uvarum on postharvest diseases in strawberries[J]. Postharvest Biology and Technology, 2015,100:52-58.

[18] WANG Lei , JIN Peng , WANG Jing ,et al. Hot air treatment induces resistance against blue mold decay caused by Penicillium expansum in sweet cherry (Prunus cerasus L.) fruit[J]. Scientia Horticulturae, 2015,189:74-80.

[19] 余丹丹,邵興鋒,許鳳,等.茶樹精油在果實采后保鮮中的作用及其機制研究進展[J]. 果樹學報, 2014,31(2):313-319.

[20] 包清彬,劉建偉.預冷條件及采摘熟度對草莓品質影響的研究[J].食品科技,2004(8):77-81.

[21] 程賽, 邵興鋒,郭安南,等.茶樹油熏蒸對草莓采后病害和品質的影響[J].農業工程學報, 2011,27(4):383-388.

[22] 鞏惠芳,杜正順,汪良駒,等.熱空氣處理對冷藏草莓果實品質與生理的效應[J].江西農業學報, 2008,20(4):33-36.

[23] IAKIMOVA E T,WOLTERING E J.Nitric oxide prevents wound-induced browning and delays senescence through inhibition of hydrogen peroxide accumulation in fresh-cut lettuce[J]. Innovative Food Science & Emerging Technologies,2015,30:157-169.

[24] GAO Hui,ZHANG Zheng Ke,CHAI Hong Kang,et al.Melatonin treatment delays postharvest senescence and regulates reactive oxygen species metabolism in peach fruit[J].Postharvest Biology and Technology,2016,118:103-110.

[25] 王宏民,李亞芳,張仙紅,等.幾種殺蟲劑脅迫對黃瓜幼苗抗氧化酶活性和相關生理指標的影響[J].中國生態農業學報, 2015,23(9):1 185-1 190.

[26] SHAN Chang-juan,ZHAO Xin-liang.Lanthanum delays the senescence of Lilium longiflorum cut flowers by improving antioxidant defense system and water retaining capacity[J]. Scientia Horticulturae,2015,197:516-520.

[27] 吳新.植物精油對草莓和楊梅果實保鮮的作用及機理研究[D].南京:南京農業大學, 2010.

[28] ARREBOLA E,SIVAKUMAR D,BACIGALUPO R,et al. Combined application of antagonist bacillus amyloliquefaciens and essential oils for the control of peach postharvest diseases[J].Crop Protection, 2010,29(4):369-377.

Effect of tea tree oil electric auxiliary heating fumigation on quality of strawberry fruit and its related enzymes

WEI Yan-zhen, SHAO Xing-feng*, Wei Ying-ying, XU Feng, WANG Hong-fei

(Department of Food Science and Engineering, Ningbo University, Ningbo 315211,China)

In order to reduce the amount of essential oil and save the cost, effects of electric auxiliary heating tea tree oil fumigation on fruit quality of strawberry fruit and related metabolic enzymes during its storage were investigated. The results showed that the 0.01‰ tea tree essential oil fumigation treatment could inhibit the decrease of total soluble solid (TSS) content and hardness, and maintain the brightness and red color of the surface of the fruit. The treatment also reduced hydrogen peroxide (H2O2) content, increased the activity of catalase (CAT) and polyphenol oxidase (PPO), and reduced the activity of ascorbate peroxidase (APX) and phenylalanine ammonia lyase (PAL). It had almost no effect on the superoxide dismutase (SOD) and β-1,3-glucanase. Thus, the improvement of electric auxiliary heating tea tree oil fumigation treatment could not only greatly save the amount of essential oil, but also maintain the quality of strawberry and delay fruit senescence.

tea tree essential oil; fumigation; strawberry; quality

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201704021

碩士研究生(邵興鋒教授為通訊作者，E-mail:shaoxingfeng@nbu.edu.cn)。

國家自然科學基金(31371860)；浙江省公益技術應用研究(2017C32010)；寧波市農業和社會發展攻關項目(2014C50084)

2016-08-02，改回日期：2016-09-01