超聲預處理影響金槍魚皮膠原酶解工藝及機理初探

黃丹丹，馬良,2，韓霜，楊暉，張宇昊,2*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715) 2(西南大學，國家食品科學與工程實驗教學中心，重慶，400715)

超聲預處理影響金槍魚皮膠原酶解工藝及機理初探

黃丹丹1，馬良1,2，韓霜1，楊暉1，張宇昊1,2*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715) 2(西南大學，國家食品科學與工程實驗教學中心，重慶，400715)

以金槍魚皮為原料，研究超聲時間、超聲功率、超聲料液比等因素對酶解效果的影響；并從魚皮膠原結構和酶解液分子量分布的角度分析了超聲預處理提高酶解效率的原因。結果表明，超聲預處理時間為20 min、功率為30%(195 W)、料液比為1∶15(g∶mL)時，水解度(DH)可達14.89%，羥脯氨酸(Hyp)含量為0.046 g，比未處理組DH(4.90%)、Hyp含量(0.015 g)均有明顯提高。傅里葉紅外光譜(FTIR)結果表明超聲通過斷裂金槍魚皮膠原蛋白氫鍵，松散三螺旋結構，利于蛋白酶與膠原三螺旋區內部酶切位點的接觸從而提高酶解效率。酶解液分子量分布對比顯示未處理組10 kDa以下小分子量占45.62%，超聲預處理后為88.67%，提高了94.36%。因此超聲預處理促進了膠原三螺旋區的活性肽段的釋放，為金槍魚皮膠原小分子活性肽的高效開發奠定基礎。

超聲；預處理；金槍魚皮；酶解液

金槍魚又稱吞拿魚、鮪魚，是一種重要的世界經濟魚類，一般被加工成壽司、罐頭等產品，加工過程產生的魚皮、魚鱗副產品富含膠原蛋白，但未得到充分利用，造成極大的資源浪費和環境污染。研究表明，膠原多肽具有多種生物活性功能，王雪芹[1]從鮐魚膠原蛋白中提取的多肽具有抗氧化和抗疲勞功能，KATO等[2]從非洲鯽魚魚皮中提取的膠原多肽通過動物實驗證明具有減脂作用，SAIGA等[3]提取的雞肉膠原蛋白多肽和KIM等[4]從豬皮中提取的膠原多肽均具有抑制血管緊張素(ACE)轉化的功能。多肽序列和氨基酸分析顯示，這些生物活性肽均富含脯氨酸(Pro)或羥脯氨酸(Hyp)，說明其主要來源于膠原蛋白三螺旋結構區域。但膠原蛋白的三螺旋結構異常穩定，很難被金屬基質蛋白酶以外的商品蛋白酶降解。為了在酶解過程中可以更多地釋放膠原蛋白三螺旋區的活性肽段，提高酶解效率，通常在膠原類物質酶解前對原料進行預處理以初步破壞三螺旋結構，暴露內部位點。熱處理[5]、堿液處理[6]、酸液處理[7]等方法經常被采用，但這些處理過程繁瑣，耗時長，因此亟需探索一些簡單高效的預處理方式。

超聲是一種綠色高效的加工方式，廣泛應用于食品工業，它是通過在液體中產生空化作用，引起介質特性變化，具有高效、操作簡單、技術易推廣等優點。STEFANOVIC等[8]文章中指出超聲預處理應用于不同蛋白，通過解旋蛋白肽鏈，可提高蛋白水解度和提高具ACE抑制活性多肽的釋放。本課題組[9]研究了酸、堿、熱、超聲、超高壓5種預處理對豬皮制備ACE抑制肽的影響，結果表明單純的超聲預處理對酶解過程具有一定的促進作用，能夠破壞膠原蛋白結構，暴露三螺旋區酶切位點，提高酶解效率，促進三螺旋區的活性肽段釋放，但提高程度有限。金槍魚皮屬于水產原料，其膠原結構不及哺乳動物膠原穩定，更容易被破壞。因此盡管單純的超聲預處理對于豬皮膠原多肽的酶解促進有限，但有可能高效地促進魚皮膠原三螺旋區活性肽段的釋放。

本實驗通過超聲對金槍魚魚皮進行預處理后再進行酶解，以水解度(DH)、Hyp含量為指標研究金槍魚膠原酶解工藝的超聲預處理條件，通過傅里葉紅外光譜(FTIR)初步分析超聲預處理金槍魚皮蛋白二級結構的變化機理，高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)分析超聲預處理組金槍魚皮酶解液中多肽的分子量分布情況，旨在考察超聲預處理是否可有效促進金槍魚皮膠原的酶解，釋放膠原螺旋區多肽。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金槍魚魚皮，山東中魯遠洋(煙臺)食品有限公司；蛋白酶K(貨號P6556；>30U/mg)、鄰苯二甲醛(OPA)、N-乙酰半胱氨酸、細胞色素C、桿菌肽、L-谷胱甘肽，Sigma公司；牛血清蛋白，如吉生物試劑公司；抑肽酶，Amresco公司；乙腈、三氟乙酸為色譜純，其余試劑均為分析純。

PHS-25型數顯酸度計，杭州雷磁分析儀器廠；SHZ-B水浴恒溫振蕩器，上海將任實驗設備有限公司；5810型臺式高速離心機，德國Eppendorf公司；KQ-100B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；UV-2450紫外分光光度計、LC-20A高效液相色譜，日本島津公司；Spectrum 100 紅外光譜，美國PerkinElmer公司；JY92-IIN型超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 金槍魚皮前處理

將魚皮置于清水中清洗，去除可見脂肪及表面污物，刮去魚鱗后，剪成1 cm×1 cm 的小塊，保存于-20 ℃冰箱中，備用。

1.2.2 金槍魚皮基本成分分析

魚皮中水分的測定參照 GB5009.3—2010；灰分的測定參照 GB5009.4—2010；粗脂肪的測定參照GB/T14772—2008；蛋白質的測定參照GB5009.5—2010；魚皮中羥脯氨酸含量的測定參照 GB/T 9695.23—2008，膠原蛋白的含量通過羥脯氨酸含量乘以轉化系數11.1計算[10]，結果如表1所示。

表1 金槍魚皮基本成分

金槍魚皮膠原蛋白含量為17.17%，占粗蛋白總量的81.45%，含量較高，是提取膠原多肽的良好材料。

1.2.3 酶的選擇

從蛋白數據庫(http://www.uniprot.org/)查得金槍魚皮氨基酸序列，根據蛋白理論酶切資源庫(http://web.expasy.org/peptide_cutter/)推薦能作用于金槍魚皮的化學試劑及酶制劑進行理論水解度計算，結果顯示蛋白酶K的理論水解度最高，為28.77%，其中三螺旋區酶切位點數為253，三螺旋區理論水解度達24.83%。蛋白酶K有很高的蛋白水解活性，適宜溫度、pH范圍廣，酶解條件易于控制，酶切位點主要在脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸。因此，本實驗選擇蛋白酶K作為酶制劑。

1.2.4 金槍魚皮超聲預處理

將保存于冰箱中的樣品取出，室溫下解凍，稱取2 g魚皮，加入0.1 mol/L pH 7.5的磷酸緩沖液，超聲預處理(探頭置于液面下1 cm左右，工作/間歇時間為5 s/10 s)后進行酶解。經測定，超聲前后溶液pH不變，這與ULUKO[11]、JAMBRAK[12]等人研究結果一致，因此超聲結束后不再調節pH。

1.2.5 酶解液的制備

金槍魚皮經預處理后，按酶底比1 mg/g加入蛋白酶K，置于37 ℃水浴恒溫振蕩器中酶解2 h，90 ℃水浴15 min滅酶，冷卻；6 000 r/min離心15 min，用0.45 μm濾膜過濾上清液，即為酶解液，一部分冷凍干燥制成凍干粉備用。未處理組不經超聲預處理，其他條件與正交試驗最優組一致。

1.2.6 水解度的測定

5 mmol/L OPA工作液的制備：由10 mL 50 mmol/L OPA溶液，10 mL 50 mmol/L NAC溶液，5 mL 20%(w/v)SDS溶液和75 mL 0.1 mol/L硼酸鹽緩沖液(pH 9.4)配制而成，現配現用，注意避光。

取40 μL酶解液與4.8 mL 5 mmol/L OPA工作液于試管中，反應10 min后，于λ340 nm下測定吸光值?？瞻讓φ战M除用水代替酶解液外，其他條件不變。水解度的計算公式(1)、(2)如下:

(1)

(2)

式中：n為水解液中斷裂的肽鍵數；N為膠原蛋白理論肽鍵數；A340為樣品在340nm處的吸光值；M為蛋白質的分子量,Da；d為稀釋系數，根據使用的樣品量進行計算；ε為340nm處消光系數(6 000mol·cm)；c為蛋白質濃度,g/L。

1.2.7 羥脯氨酸的測定

樣品羥脯氨酸含量測定參照GB/T 9695.23—2008，稱取50 mg酶解液凍干粉，用5 mL硫酸于105 ℃水解樣品，再進行過濾、稀釋測得羥脯氨酸含量W。樣品中羥脯氨酸的計算見公式(3)：

(3)

式中：X為酶解液中羥脯氨酸質量，g;W為水解樣中的羥脯氨酸含量，%；m為水解凍干粉的質量，g；V1為冷凍干燥酶解液體積，mL；V為酶解液總體積，mL。

1.2.8 金槍魚皮超聲預處理最佳水解條件的確定

以超聲時間20、40、60、80 min，超聲功率10%、20%、30%、40%(總功率為650 W)，超聲料液比(g∶mL)1∶5、1∶10、1∶15、1∶20進行單因素試驗，研究不同超聲預處理條件對金槍魚皮水解度的影響。基于上述3個條件選取3個水平，依據L9(34)正交試驗表設計正交試驗，根據極差與方差分析結果確定最佳預處理條件。

1.2.9 金槍魚皮膠原結構分析

將最佳預處理條件及未處理的金槍魚皮凍干，再各取2 mg剪碎與溴化鉀混合，研磨均勻，于60 ℃下烘干，取適量壓片，使用Spectrum 100紅外光譜儀進行掃描，掃描范圍400～4 000 cm-1.，分辨率4 cm-1，掃描次數64次。

1.2.10 酶解物分子量分布測定

各取5 mg最佳水解條件及未處理組的酶解液凍干粉溶于2 mL流動相中，采用HPLC法分析水解液中多肽分子量分布情況。色譜柱：TSK gel G2000 SWXL凝膠色譜柱(7.8 mm×300 mm)；流動相：30%乙腈(含0.1%(v/v)三氟乙酸)；流速：0.5 mL/min等度洗脫；檢測波長：220 nm；柱溫：30 ℃；上樣量：10 μL。

選用4種分子量標準多肽樣品細胞色素C(Mw=12 384 Da)、抑肽酶(Mw=6 511.44 Da)、桿菌肽(Mw=1 422.69 Da)、谷胱甘肽(Mw=612.63 Da)，其分子量的HPLC圖譜如圖1所示。

圖1 標準樣品的HPLC圖譜Fig.1 HPLC spectrogram of standard sample

2 結果與分析

2.1 不同超聲預處理條件對金槍魚皮水解度的影響

2.1.1 超聲時間對金槍魚皮水解度的影響

超聲功率為40%，料液比為1∶10，不同超聲時間對金槍魚皮水解度的影響如圖2所示，與金槍魚皮未處理組相比，不同超聲時間(20、40、60和80 min)處理后酶解液DH、Hyp含量均顯著升高(P<0.05)，Hyp作為膠原蛋白三螺旋區的特征氨基酸，其在酶解液中的含量與DH變化趨勢一致，說明超聲預處理可促進蛋白酶K對膠原三螺旋區域的酶解。超聲處理時間為40 min時，酶解液DH為14.25%，Hyp含量為0.039 g，二者均達到最大值。超聲可以通過在溶液中產生的空化作用破壞魚皮結構和化學鍵，疏松蛋白結構[13]，促進酶解過程中魚皮膠原酶切位點與蛋白酶K的結合；不同時間超聲處理對酶解影響的差異可能主要與蛋白結構被破壞的程度以及酶切位點的暴露程度有關[14]。

圖2 超聲預處理時間對酶解金槍魚皮水解度的影響Fig.2 Effects of ultrosound pretreament time on degree hydrolysate of tuna skin注：小寫字母(abc)為DH的顯著性分析結果(P<0.05)；大寫字母(ABC)為Hyp含量的顯著性分析結果(P<0.05)(下同)

2.1.2 超聲功率對金槍魚皮水解度的影響

超聲時間為40min，料液比(g∶mL)為1∶10，不同超聲功率對金槍魚皮水解度的影響如圖3所示，結果表明隨著超聲功率的增大，金槍魚皮酶解液DH和Hyp含量呈先上升后下降的趨勢，當功率為30%(195 W)時，DH和Hyp含量最大，分別為14.80%和0.027 g。較低或較高的超聲功率均會降低膠原蛋白三螺旋區的酶切位點的暴露程度。也就是說適當的超聲功率可以更好的暴露膠原三螺旋區的位點，超聲功率過大時，超聲的空化效應和熱效應強烈，反而不利于酶解反應效率的提高。這一變化趨勢與HUANG[13]、呂鵬[15]、馬海樂[16]等的報道一致。

圖3 超聲預處理功率對酶解金槍魚皮水解度的影響Fig.3 Effects of ultrosound pretreament power on degree hydrolysate of tuna skin

2.1.3 超聲料液比對水解度的影響

超聲功率為30%，超聲時間為40 min，不同料液比對金槍魚皮水解度的影響如圖4所示，隨著超聲液料比逐漸增大，金槍魚皮酶解液DH和Hyp含量呈先上升后下降的趨勢，當料液比(g∶mL)為1∶15時，DH為14.13%，Hyp含量為0.027 g。研究[17]指出超聲波產生的空化作用與黏度系數有很大關系，黏滯系數大的液體難以產生空化泡，而且傳播過程中損失也大，因此較低的液料比不利于空化泡的傳遞；但料液比過高，因為總體積的增加，可能會降低空化作用的效果，導致酶解效率的降低[18]。因此，選擇合適料液比才有利于超聲破壞金槍魚皮膠原、松散三螺旋結構，使蛋白酶K更易接觸膠原結構內部酶切位點。

圖4 超聲預處理料液比對酶解金槍魚皮水解度的影響Fig.4 Effects of ultrosound pretreamentsolid-liquid ratio on degree hydrolysate of tuna skin

2.2 金槍魚皮超聲預處理的最佳水解條件

為確定超聲波預處理對制備金槍魚皮酶解液的最佳工藝條件，在單因素試驗的基礎上，選擇超聲預處理時間、功率和料液比進行3因素3水平L9(33)正交試驗。結果如表2所示。

表2 超聲預處理優化酶解金槍魚工藝的L9(33)正交試驗結果

由表2可知，超聲料液比對酶解液DH值和Hyp含量影響最大，其次是超聲功率，超聲時間對酶解液DH和Hyp含量影響最小(C>B>A)，正交試驗最優組合為A1B3C3，即超聲處理時間30min，超聲功率為30%，料液比(g∶mL)為1∶15。在這種超聲預處理條件下，酶解液DH值和Hyp含量均為最大值，說明超聲預處理能有效地破壞金槍魚皮膠原蛋白構象，暴露三螺旋區酶切位點，提高酶解過程金槍魚皮水解度和三螺旋區活性肽段的釋放效率。

2.3 FTIR分析超聲預處理金槍魚皮膠原結構的變化

采用傅里葉紅外光譜分析預處理后魚皮膠原蛋白的結構變化，結果如圖5所示。

圖5 超聲預處理魚皮與未處理魚皮結構分析Fig.5 The infrared spectrogram of tuna skin collagen that treated with and without ultrasonic

酰胺A帶(3 400～3 440 cm-1)是N—H或O—H伸縮振動的吸收峰，由圖5可知，超聲處理組酰胺A帶藍移，這是由于超聲破壞膠原蛋白分子間的氫鍵，N—H基團的分子肽段參與了氫鍵形成；酰胺I帶(1 600～1 700cm-1)是氨基酸殘基CO伸縮振動吸收峰，主要表征了膠原三螺旋結構的二級結構，對其進行高斯擬合分析(圖6)，結果(表3)表明超聲預處理后魚皮結構α螺旋含量降低，降幅為49.36%，無規則卷曲含量上升了45.63%，β折疊含量無明顯變化，β轉角含量略有上升，這與劉斌等人[19]研究的超聲處理使牛血清蛋白α螺旋降低及胡愛軍等人[20]研究的超聲使魚肉蛋白結構由α螺旋向無規則卷曲變化趨勢一致。這是因為超聲破壞了蛋白的網絡結構，使氫鍵斷裂，緊密的α螺旋結構變為較為伸展的無規則卷曲結構，在這一過程中，膠原三螺旋區的位點被更多的暴露，提高酶解過程中DH和膠原三螺旋區活性肽段釋放效率。

圖6 酰胺I帶的曲線擬合Fig.6 Curvefitted results of amideⅠbands

β折疊/%無規則卷曲/%α螺旋/%β轉角/%未處理29009111611816141669超聲預處理3070816254922243816

2.4 HPLC法分析多肽分子量分布

如圖7所示，超聲預處理組主要為小分子物質，經計算10 kDa以下分子量超聲處理組含量為88.67%，未處理組為46.39%，近代研究表明[21]，分子量分布與肽的活性密切相關，與蛋白質相比，小分子肽更易消化吸收，具有抗腫瘤、抗氧化、降血壓等多重生物活性功能。金槍魚皮經超聲預處理后，酶解過程可釋放更多來源于三螺旋區的小分子多肽，這些多肽富含Hyp和Pro，可能具有多種功能活性。因此，超聲預處理可以作為金槍魚皮膠原肽制備的有效前處理手段。

圖7 超聲預處理與未預處理金槍魚皮酶解液多肽分子量分布Fig.7 Peptide molecular weight distribution of hydrolysate tuna skin with and without ultrasonic

3 結論

單因素和正交試驗對金槍魚皮酶解液制備的研究表明，當超聲時間為20 min、超聲功率30%(195 W)、料液比(g∶mL)為1∶15時，酶解液DH為14.89%，Hyp含量為0.046 g；而未處理魚皮酶解液DH和Hyp含量分別為4.90%和0.015 g，說明超聲預處理對蛋白酶K酶解金槍魚皮有明顯的促進作用，可顯著提高酶解液DH和三螺旋區Hyp的釋放。

FTIR分析蛋白二級結構表明超聲預處理破壞了金槍魚皮膠原蛋白構象，松散了三螺旋結構，利于蛋白酶K作用酶切位點，使酶解過程更有效進行；超聲預處理后酶解液主要為小分子多肽，與未處理組相比小分子含量提高了94.36%，因此酶解液中潛藏多種生物活性功能多肽。超聲預處理可顯著提高酶解效果，釋放大量源于三螺旋區的小分子多肽，為金槍魚皮膠原多肽的高效制備以及進一步提取制備生物活性肽奠定了理論基礎。

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The effect of ultrasonic pretreatment on hydrolysate of Tuna skin and study on its mechanism

HUANG Dan-dan1, MA Liang1,2, HAN Shuang1, YANG Hui1, ZHANG Yu-hao1,2*

1(College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China) 2(National Food Science and Engineering Experimental Teaching Center, Southwest University, Chongqing 400715, China)

Using tuna skin as raw materials, the effects of ultrasonic time, ultrasonic power, and ultrasonic solid-liquid ratio on hydrolysate were studied. The collagen structure of tuna skin and the molecular weight of hydrolysate were determined to explain the reason why ultrasonic could improve hydrolysis. The results showed that when the ultrasonic time was 20 min, ultrasonic power was 30%(195 W), ultrasonic solid-liquid ratio was 1∶15, the hydrolysis degree was up to 14.89%, hydroxyproline content was 0.046 g, which were significantly higher than those in the group without pretreatment .The results of FTIR showed that ultrasonic could break the structure of collagen efficiently. The peptides less than 10 kDa in ultrasonic pretreatment group accounted for 88.67%, while those in group without pretreatment accounted for 45.62%. Ultrasonic Pretreatment promote release of active peptide from triple helical of collagen, which has important implication for the further preparation and application of active peptides.

ultrasonic; pretreatment; tuna skin; hydrolysate

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201704022

在讀碩士研究生(張宇昊教授為通訊作者，E-mail:zhy1203@163.com)。

重慶市研究生科研創新項目(CYS2015075)；國家自然科學基金項目(31301425)；中央高校基本科研業務費重大項目(XDJK2015A015)；中國博士后科學基金面上項目(2014M562267)；中國博士后科學基金特別資助項目(2015T80951)；重慶市基礎科學與前沿技術研究重點項目(cstc2015jcyjBX0116)；第四批重慶市高等學校優秀人才支持計劃

2016-10-21，改回日期：2016-11-10