轉基因食品定量檢測方法的驗證

饒紅，韓玥，郭錚蕾，徐姍，李偉，谷強，林遠輝

(北京出入境檢驗檢疫局，北京，100026)

轉基因食品定量檢測方法的驗證

饒紅，韓玥*，郭錚蕾，徐姍，李偉，谷強，林遠輝

(北京出入境檢驗檢疫局，北京，100026)

按歐盟聯合研究中心(Joint Reaserch Center，JRC)的歐盟網絡轉基因實驗室(European Network of GMO laboratories，ENGL)方法驗證工作組編制的指南文件的要求，對《GB/T 19495.5—2004 轉基因產品檢測核酸定量PCR檢測方法》進行方法驗證。分別驗證了脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)提取質量，方法的準確度、重復性和相對定量限4個指標。經過驗證，選用的DNA提取試劑盒提取質量合格；檢測值在可接受參考值的±25%內，準確度良好；相對可重復性標準偏差均小于25%，重復性良好；相對定量限為0.1%轉基因含量。依照指南對國標進行了驗證，結果證明該指南在實驗室進行方法驗證中具有指導性作用。

轉基因食品檢測；定量檢測；方法驗證

在開始檢測之前，實驗室應能夠正確地應用標準方法，如果標準方法發生了變化，應重新進行驗證[1]。目前，國際上通用的檢測實驗室認可標準是《ISO/IEC 17025:2005 檢測和校準實驗室能力的通用要求》，在國內被轉化為《CNAS-CL01:2006 檢測和校準實驗室能力認可準則》，作為檢測實驗室認可和管理所依據的標準。實際工作中，一個檢測實驗室開展檢測前最關鍵的是能夠證明具備正確進行檢測的能力，如果是依照標準方法進行檢測，那么實驗室應能夠準確理解標準并正確使用。17025和CL01只給出了方法驗證的定義。但是對于具體如何進行方法驗證沒有給出具體指南。在國際和國內，各領域實驗室都在開展本領域內檢測方法驗證的相關研究，但是關于轉基因檢測方法的驗證，一直以來少有科學性、有效性的依據。本文修改采用了歐盟聯合研究中心(Joint Reaserch Center，JRC)的權威指南文件：《Verification of analytical methods for GMO testing when implementing interlaboratory validated methods》(EUR 24790 EN，JRC)進行轉基因檢測方法驗證的研究。歐盟聯合研究中心是歐盟委員會的內部科研機構，其發布的文件在轉基因檢測領域公認為權威的指導性文件。實驗室在進行方法驗證時需要識別相應的人員能力、設施和環境、設備、檢測所需試劑耗材和標物是否滿足檢測方法標準的要求等[2-4]。如果標準方法發生了變化，應重新驗證。驗證應有記錄。總之，實驗室在將方法引入檢測之前，應從“人”、“機”、“料”、“法”、“環”等方面驗證其有能力按照標準方法開展檢測活動。

在滿足了“人”、“機”、“料”、“環”的硬件要求后，還應通過試驗證明結果的準確性和可靠性，如標準給出的精密度、線性范圍、定性檢測限和定量檢測限等方法特性指標[5]，必要時應進行實驗室間比對或參加能力驗證。“法”，即標準方法規定的各項特性指標在實驗室能否實現，就成為了方法驗證中最重要的技術內容，也是實驗室最應著力驗證的目標。

由歐盟聯合研究中心(JRC)的歐盟網絡轉基因實驗室(European Network of GMO laboratories，ENGL)方法驗證工作組編制的《JRC科學技術報告-經確認的轉基因檢測分析方法的驗證》(Verification of analytical methods for GMO testing when implementing interlaboratory validated methods)[6]，由JRC作為指南性文件發布。本文按照該指南要求，以《GB/T 19495.5—2004 轉基因產品檢測核酸定量PCR檢測方法》[7]為實例，對該標準中轉基因玉米實時熒光PCR檢測方法進行了方法驗證。經試驗研究，驗證了該方法的脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)提取效率、準確度、重復性、相對定量限4個特性指標[8]，這些指標均達到了該指南文件的技術要求，說明今后檢測實驗室可以此指南文件為依據開展相關領域的方法驗證活動。

1 材料與設備

1.1 主要材料

DNA提取試劑盒(QIAGENDNeasy? Plant Mini Kit)，DEPC水(生工Sangon Biotech)，PCR反應預混液(AB TaqMan? Gene Expression Master Mix)，引物，探針，濃度分別為5、1、0.5、0.1%的GA21品系陽性標準物質(AOCS0407-B)，玉米渣(超市購買)。

1.2 主要儀器

紫外分光光度儀(BECKMAN COULTER DU 800)，實時熒光定量PCR儀(ABI 7900)，高速冷凍離心機(eppendorf Centrifuge 5810R)，臺式小型離心機(eppendorf Centrifuge 5424)，漩渦振蕩器(IKA MS2)，PCR反應管(Axygen)，10、20、100、200、1000 uL微量進樣器(eppendorf)。

1.3 引物和探針

引物探針序列按照《GB/T 19495.5—2004轉基因產品檢測核酸定量PCR檢測方法》附錄E中轉基因玉米GA21的zSSIIb基因(玉米內源基因)和結構特異基因(GA21品系結構特異性基因)的序列合成，見表1。

表1 引物和探針序列

2 方法與結果

2.1 提取DNA

使用QIAGENDNeasy? Plant Mini Kit，分別對濃度5%、1%、0.5%、0.1%的GA21品系陽性標準物質和超市購買的純玉米渣進行DNA提取。

2.2 DNA 提取質量驗收

對純玉米渣每次同時進行2份平行提取，連續3次[9]。2個平行提取的DNA連續4倍稀釋(1∶1，1∶4,1∶16,1∶64和1∶256)的5個點的ZEIN基因(玉米內源基因)進行檢測[10]，3次檢測結果見表2～表4、圖1～圖3。為了評估抑制劑的存在，4個稀釋度的樣品的Ct值用線性回歸計算得到一個等式。從線性回歸推算出的“未稀釋”樣品的Ct值與同一個樣品的測量Ct值進行對比。JRC指南中規定，當同時滿足回歸線的斜率在-3.6～-3.1；判定系數(R2)≥0.98；測量Ct和推算Ct的差(ΔCt)低于0.5這3個條件時，則證明該提取方法是適宜的，提取產物中不含抑制劑。其中，未稀釋濃度的推導Ct值用excel中函數中INTERCEPT求得。

表2 第1次試驗ΔCt

表3 第2次試驗ΔCt

續表3

稀釋因子實際測量CtCt平均值ΔCt期望ΔCt稀釋因子的對數1∶163152034431593453155691996782-120411∶6433557655336374833597572040672-180621∶256360848835903545實際測量Ct35994212396642-24082Ct平均值Excel推導Ct推導Ct?Ct平均值結果工作液27538067274242627481162734129-013987OK

表4 第3次試驗ΔCt

圖1 第1次試驗斜率R2Fig.1 The slope R2 of the first test

圖2 第2次試驗斜率R2Fig.2 The slope R2 of the second test

圖3 第3次試驗斜率R2Fig.3 The slope R2 of the third test

從圖表的結果可見，3次試驗的ΔCt分別為-0.121 31、-0.139 87、0.071 57；線性回歸方程的斜率分別為-3.54 4、-3.545、-3.540；R2系數分別為0.996、0.997、0.999。3次試驗均滿足JRC指南中規定的3項要求[11]，可見使用QIAGEN DNeasy?Plant Mini Kit試劑盒提取的產物中不含抑制劑，提取質量合格，可以用于后續試驗。

2.3 提取物濃度的測定

用BECKMAN COULTER DU 800紫外分光光度計分別GA21品系陽性標準物質(+)和超市購買的純玉米渣(-)的提取產物進行檢測，得到如下結果(見表5)。

表5 提取物DNA相對濃度

利用公式(1)計算提取物的絕對濃度(copies/μL)，結果見表6。

提取物絕對濃度/(copies·μL-1)=(6.02×1023)×(DNA濃度ng/μL×10-9)/(玉米基因組堿基數2.4×109×345)

(1)

表6 提取物DNA絕對濃度

2.4 準確度、重復性、定量限試驗設計

JRC指南中規定，需要16個PCR平行結果，才可以比較準確地計算出所驗證方法的準確度、重復性、定量限，試驗設計的實例見圖4。

圖4 準確度、重復性、定量限試驗設計實例Fig.4 Example of accuracy, repetitive and LOQ experiment design

按照圖4的設計進行PCR試驗，得到的試驗結果見表7和表8。

2.5 準確度驗證

JRC指南中規定，準確度應在可接受參考值的±25%內。對方法的準確度進行驗證時，檢測條件(反應量、 PCR儀等)應該和日常檢測一致。至少選擇包括接近定量限在內的3個不同濃度水平進行驗證[12-13]。每個濃度水平要得到16個PCR平行的結果(見2.4)。平均值的計算使用公式(2)。

表7 PCR Plate 1 不同轉基因水平提取物檢測Ct值

表8 PCR Plate 2 不同轉基因水平提取物檢測Ct值

(2)

根據表7、表8的結果進行計算得到以下結果。

2.5.1 5%轉基因水平

2.5.2 1%轉基因水平

2.5.3 0.5%轉基因水平

2.5.4 0.1%轉基因水平

2.6 重復性驗證

按照JRC指南要求，接著應對重復性進行驗證。重復性(Repeatability)是在使用相同方法和正確操作情況下，由同一操作人員，在同一實驗室，使用同一儀器，并在短期內，作多個單次測試結果，在一定概率水平(一般指95%)兩個獨立測試結果的最大差值。使用可重復性標準偏差(Repeatability standard deviation，RSDr)來衡量重復性的優劣。JRC指南規定RSDr應≤25%。

對方法重復性的驗證需要在重復條件下通過PCR平行試驗進行評估[14]。重復性應適用于所有轉基因水平的測試。檢測條件(反應量、 PCR儀等)應該和日常檢測一致。至少要得到16個獨立測量結果(見2.4)。選取5%、1%、0.5%、0.1%這4個不同轉基因含量的樣品進行檢測。方差、標準偏差、總體的標準差平均數、相對可重復性標準差分別通過公式(3、4、5、6)計算得到。

(3)

(4)

(5)

式中：n表示每個提取的復制數，n=4；k表示每個反應管分別的標準差數量，k=4；分母的區間是16-8=8。

(6)

根據表7、8的結果進行計算得到以下結果。

2.6.1 5%轉基因水平

使用公式(3)得出4個方差Var15= 1.997 92×10-6、Var25= 3.912 42×10-6、Var35=1.268 47×10-6、Var45= 3.909 1×10-6。使用公式(4)得出4個標準偏差sd15= 0.001 413 5、sd25= 0.001 978、sd35= 0.001 126 3、sd45= 0.001 977 1。使用公式(5)和之前計算的結果得到sdGM5= 0.002 039。使用公式(6)計算出5%轉基因水品的相對可重復性標準偏差RSDr=3.76<25，可見在5%轉基因水平下，依據JRC指南的規定所驗證方法的重復性滿足指南要求。

2.6.2 1%轉基因水平

使用公式(3)得出4個方差Var11=9.382 69×10-9、Var21=8.315 36×10-9、Var31= 1.274 07×10-8、Var41=1.644 86×10-8。使用公式(4)得出4個標準偏差sd11=9.686×10-5、sd21=9.119×10-5、sd31=0.000 112 9、sd41=0.000 1283。使用公式(5)和之前計算的結果得到sdGM1=0.000 132 6。使用公式(6)計算出1%轉基因水品的相對可重復性標準偏差RSDr=1.12<25，可見在1%轉基因水平下，依據JRC指南的規定所驗證方法的重復性滿足指南要求。

2.6.3 0.5%轉基因水平

使用公式(3)得出4個方差Var10.5=2.780 19×10-9、Var20.5= 2.248 61×10-9、Var30.5=1.936 46×10-9、Var40.5=1.760 45×10-9。使用公式(4)得出4個標準偏差sd10.5=5.273×10-5、sd20.5=4.742×10-5、sd30.5=4.401×10-5、sd40.5=4.196×10-5。使用公式(5)和之前計算的結果得到sdGM0.5=5.720 26×10-5。使用公式(6)計算出0.5%轉基因水平的相對可重復性標準偏差RSDr=1.31<25，可見在0.5%轉基因水平下，依據JRC指南的規定所驗證方法的重復性滿足指南要求。

2.6.4 0.1%轉基因水平

使用公式(3)得出4個方差Var10.1=8.128 1×10-11、Var20.1=9.508 5×10-11、Var30.1=6.876 41×10-11、Var40.1=4.712 58×10-11。使用公式(4)得出4個標準偏差sd10.1=9.016×10-6、sd20.1=9.751×10-6、sd30.1=8.292×10-6、sd40.1=6.865×10-6。使用公式(5)和之前計算的結果得到sdGM0.1=1.046 88×10-5使用公式(6)計算出0.1%轉基因水平的相對可重復性標準偏差RSDr=0.85<25，可見在0.1%轉基因水平下，依據JRC指南的規定所驗證方法的重復性滿足指南要求。

四個轉基因含量水平樣品的相對可重復性標準差分別為3.76、1.12、1.31、0.85%，均小于25%，證明本方法的重復性滿足指南要求。

2.7 相對定量限(LOQrel)

JRC指南規定驗證一個方法的相對定量限(LOQrel)可用一個低轉基因濃度的陽性對照樣品的至少10次PCR平行來測量，如果所有平行的結果都是陽性，這表示LOQrel低于或等于該陽性對照水平。在做重復性驗證的同時，我們得到了4個不同轉基因含量水平的分別16個檢測結果，見表9。

表9 相對定量限(LOQrel)結果

從表9可見， 0.1%這一轉基因水平全部檢出。所以該標準方法的相對定量限(LOQrel)為0.1%。

3 討論

本文依據JRC指南性文件對《GB/T19495.5—2004轉基因產品檢測核酸定量PCR檢測方法》進行了方法驗證。驗證了使用DNA提取試劑盒提取產物不含抑制劑，該方法重復性良好，且該方法的相對定量限為0.1%轉基因濃度水平。證明我實驗室的檢測過程和結果能夠滿足GB/T19495.5-2004國標的檢測需求，本文可作為實驗室方法驗證的實例參考使用，具有良好的可行性和適用性。

該JRC指南性文件適用于包括食品轉基因檢測在內的所有分子生物學檢測，充分考慮到了分子生物學檢測中的關鍵控制點，并科學細化了驗證步驟。盡管關注的是PCR方法的驗證，但是DNA提取方法的評估是轉基因檢測和分子生物學檢測的關鍵步驟，因為在食品轉基因檢測中DNA提取的質量對最終結果有重要影響，該指南性文件在此指標上給出了詳細規定，通過我們的試驗研究，證明具有良好的可操作性，便于實驗室在日常引入新方法及方法發生變更時進行方法驗證時參考使用。

通過本文的試驗研究，可以看出，《JRC科學技術報告-經確認的轉基因檢測分析方法的驗證》這一指南性文件，可用于指導檢測實驗室開展轉基因檢測方法驗證工作，特別對分子生物學定量檢測的方法驗證具有指導意義。

[1] CNAS-CL01:2005 檢測和校準實驗室能力認可準則[S].

[2] ISO 13843:2000 Water quality-guidance on validation of microbiological methods[S].

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[7] GB/T 19495.5:2004 轉基因產品檢測核酸定量PCR檢測方法[S].

[8] AOAC? Official methods validation program[S].

[9] EN/TS 21568:2006 Foodstuffs. Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products. Sampling strategies.European Committee for Standardisation,Brussels, Belgium[S].

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[11] CIABATTI I, FROIIO A, GATTO F, et al. In-house validation and quality control of real-time PCR methods for GMO detection: a practical approach[J].Dev Biol,2006，126: 79-86.

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[13] International standard (ISO) 21569, Foodstuffs. Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products-Qualitative nucleic acid based methods. International Organisation for Standardisation, Geneve, Switzerland,2006[S].

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Verification of the quantitative method for GMO foods

RAO Hong， HAN Yue*， GUO Zheng-lei， XU Shan， LI Wei， GU Qiang， LIN Yuan-hui

(Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Beijing 100026，China)

According to the requirements of Guidance document from the European Network of GMO laboratories(ENGL) of JRC, “GB/T 19495.5—2004 Detection of genetically modified organisms and derived products—Quantitative PCR methods based on nucleic acid” including four typical indexes, DNA extraction, accuracy, repeatability and LOQrel, was verified. After verification, DNA extraction kit was qualified. The trueness was within ± 25% of the accepted reference value. RSDr<25.LOQrel was 0.1% GMO content. The verification on the national standard confirms that the guidance is applicable for method verification in laboratory.

GMO testing in foods; quantitative testing; method verification

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201704033

碩士，主任技師(韓玥為通訊作者，E-mail：hanyuedella2@163.com)。

2016-11-18，改回日期：2017-01-04