遵義市冰核細菌分離鑒定及拮抗細菌篩選

2017-06-21 15:12:45趙晨心丁海霞彭麗娟

浙江農業科學 2017年5期

趙晨心，丁海霞，彭麗娟

(貴州大學 a.農學院， b.煙草學院， c.煙草工程重點實驗室，貴州貴陽 550025)

遵義市冰核細菌分離鑒定及拮抗細菌篩選

趙晨心a，丁海霞a，彭麗娟bc*

(貴州大學 a.農學院， b.煙草學院， c.煙草工程重點實驗室，貴州貴陽 550025)

為了解遵義市霜凍植物上冰核細菌的種類以及篩選對冰核細菌有拮抗作用的細菌，采用小液滴凍結法鑒定冰核細菌的冰核活性，并用雙層平板法篩選冰核細菌的拮抗細菌；采用形態學特征、生理生化鑒定以及16S rDNA序列對比分析等方法確定冰核細菌和拮抗細菌種類。結果顯示，從遵義市采集到35種植物凍害標本，共分離到4株冰核細菌Z-A、Z-B、Z-C、Z-QCH；從遵義市采集到23種土樣，共分離出3株拮抗細菌XH、XM、XL。經鑒定，Z-A、Z-B是菠蘿泛菌(Pantoeaananatis)，Z-C是成團泛菌(Pantoeaagglomerans)，Z-QCH是綠黃假單胞(Pseudomonasviridiflava)。拮抗細菌XH、XM是解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，XL是甲基營養型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)。初步了解了遵義市冰核細菌的種類，為遵義市霜凍植物生物防治奠定了一定基礎。

冰核細菌；拮抗細菌；鑒定；生物防治

遵義市屬亞熱帶濕潤季風氣候，冬季無嚴寒，常伴綿雨，時有凝凍。1月下旬常出現極端寒冷的天氣，氣溫僅有-7.1 ℃。最冷時段常常出現在隆冬1月，并常伴有凝凍發生[1]。遵義市除赤水河谷低熱地帶無凝凍災害以外，其余各地都會發生不同程度的凝凍災害。其中，習水、遵義縣為遵義市的重級凝凍區；中部地區的桐梓、兩城區(匯川區、紅花崗區)、綏陽、湄潭、務川、鳳岡為中級凝凍區；正安、道真、仁懷、余慶為輕級凝凍區[2]。

霜凍是一種嚴重的自然災害，它能在幾小時內毀掉大片農作物[3]和植物，給農業生產造成嚴重的影響。Maki等[4]首次從赤楊(Alnusjaponica(Thunb.) Steud.)樹葉中分離到冰核細菌(ice nucleation active bacteria，INA)，冰核細菌廣泛腐生于植物表面，可在-2～-5 ℃誘發植物細胞水結冰而發生霜凍[4]。國內外大量研究證明，在自然界廣泛存在著冰核細菌，它是破壞植物的過冷卻狀態，誘發和加重植物霜凍危害的重要因素[5-10]。因此，防除INA細菌可以減輕和控制霜凍災害。

本試驗從遵義市5個不同縣、區，采集植物凍害標本，分離鑒定冰核細菌。并從發生凍害植物的根部采集土壤，從中分離篩選冰核細菌的拮抗細菌。并鑒定冰核細菌及其拮抗細菌的種類，從而確定遵義市冰核細菌的種類及分布情況，初步研究冰核細菌的防治方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本采集

2014年12月至2015年3月，從遵義市匯川區、紅花崗區、習水縣、綏陽縣、正安縣等5個縣、區，6個地點采集或征集到35種植物霜凍標本(表1)。

1.1.2 土樣采集

從遵義市匯川區植物園和鳳凰山2個景點采集發生霜凍的蔬菜、花卉和灌木的根部土壤，用以分離拮抗細菌。

1.1.3 實驗用培養基

冰核細菌實驗培養基：金氏(KB)培養基[11]。

拮抗細菌實驗培養基：牛肉膏蛋白胨(NA)培養基[12]；芽孢桿菌實驗培養基：肉湯(LB)培養基[13]。

1.2 分離

1.2.1 冰核細菌的分離

表1 35種植物霜凍標本的采集地點

采集市縣區地點寄主植物遵義市匯川區植物園百里香(Thymusmongolicus)、麻葉蕁麻(Urticacannabina)、瞿麥(Dianthussuperbus)、小葉黃楊(Buxusmicrophylla)鳳凰山假黃楊(Syzygiumbuxifolium)、灑金桃葉珊瑚(AucubajaponicaVariegata)、大黃(Rheumpalmatum)、芹菜(Apiumgraveolens)遵義市紅花崗區南宮山濕地公園空心菜(Ipomoeaaquatica)、南瓜(Cucurbitamoschata)、番茄(Lycopersiconesculentum)、花椰菜(Brassicaoleracea)、菊花(Chrysanthemummorifolium)、芭蕉(Musabasjoo)毛冬青(Ilexpubescens)、金銀花(Lonicerajaponica)習水縣丹霞谷茶樹(Camelliasinensis)枇杷(Eriobotryajaponica)、小葉女貞(Ligustrumquihoui)、蟹爪蓮(Zygocactustruncatus)、菠菜(Spi?naciaoleracea)、青菜(Brassicachinensis)、生菜(Lactucasativa)綏陽縣清溪湖景區滿天星(Gypsophilapaniculata)、鳶尾(Iristectorum)、馬蹄蓮(Zantedeschiaaethiopica)、常春藤(Hederanepalensis?var．sinen?sis)、豌豆(Pisumsativum)蠶豆(Viciafaba)杜英(Elaeocarpussylvestris)正安縣九道水森林公園虎眼萬年青(OrnithogalumcaudatumAit)、小藜(Chenopodiumserotinum)、老鸛草(GeraniumwilfordiiMaxim)、萵苣(Lactucasativa)

分離冰核細菌采用平板稀釋法[14]，按照10倍系列梯度將葉片懸浮液稀釋到4個濃度梯度：10-3、10-4、10-5、10-6。取10-5、10-62個稀釋度分離細菌，根據不同的菌落形態特征，采用分離培養劃線法，挑取不同的單菌落進行劃線，分離純化。

1.2.2 拮抗菌的分離

采用平板稀釋法分離拮抗細菌[15]：將土壤懸浮液靜置，取上清液稀釋到10-3、10-4、10-5、10-64個濃度梯度，取10-5、10-62個稀釋度分離細菌。

1.3 冰核活性的測定

采用Vali[16]發明，后又由Lindow[9]改進的小液滴凍結法，進行冰核活性的測定。每個菌株重復3次。將篩選出來的冰核細菌接種到KB斜面上，用冰箱保存菌種。

1.4 冰核細菌拮抗菌的篩選

采用雙層平板打孔法[17]篩選冰核細菌的拮抗細菌。并經初篩和復篩篩選出效果明顯的拮抗細菌。采用十字交叉法測量抑菌圈的直徑。

1.5 鑒定

1.5.1 形態學鑒定與生理生化鑒定

冰核細菌和拮抗細菌的鑒定主要根據《常見細菌系統鑒定手冊》[18]《伯杰細菌鑒定手冊》第八版[19]的形態特征進行鑒定和分類。

1.5.2 分子鑒定

刮取培養物，使用Biomiga的Bacterial gDNAkit試劑盒(GD2411-01)。按照試劑盒步驟提取DNA，采用通用引物27F和1492R、gyrA-F和gyrA-R(表2)[20]，擴增后采用瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行驗證，確定條帶正確后，將目的片段純化回收，并與pMD19-T 載體連接，轉化至大腸埃希菌DH5α 感受態細胞，在氨芐抗性平板上進行陽性克隆的篩選，送樣測序。

將所測定的序列在GenBank數據庫中進行BLAST分析[21]。

采用最大簡約法(MP)分析方法對數據進行系統學分析，運用PAUP 4.0 BETA建立系統進化樹[22]。拮抗細菌分子鑒定的方法跟冰核細菌的鑒定方法相同，但需加測gyrA基因序列。通過MEGA結合16S與gyrA基因，通過PAUP作MP分析，建立系統發育樹。

表2 用于鑒定冰核細菌和拮抗細菌的引物

細菌引物序列冰核細菌、芽孢桿菌27F5′?AGAGTTTGATCCTGGCTCAG?3′16SrDNA1492R5′?GGTACCTTGTTACGACTT?3′芽孢桿菌gyrA?F5′?CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT?3′gyrAgyrA?R5′?CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT?3′

2 結果與分析

2.1 冰核細菌的分離

從貴州省遵義市5個縣、區采集了35種植物凍害標本，并采用平板稀釋法分離出387株細菌，采用由Lindow改進的Vali小液滴凍結法鑒定，鑒定出4株冰核細菌，編號為Z-A、Z-B、Z-C和Z-QCH。Z-A的寄主植物是瞿麥(D.superbus)、Z-B的寄主植物是鳶尾(I.tectorum)、Z-C的寄主植物是茶樹(C.sinensis)、Z-QCH的寄主植物是芭蕉(M.basjoo)。經小液滴法鑒定：Z-QCH在-5 ℃溫度下30 s內有2滴結冰，Z-A在-5 ℃下40 s內有3滴結冰，Z-B和Z-C在-5 ℃下45 s內有2滴結冰。經過鑒定可知，Z-QCH的冰核活性最強，Z-A的冰核活性次之，Z-B和Z-C的冰核活性較弱。

2.2 冰核細菌拮抗菌的篩選

從遵義市匯川區和紅花崗區2個地點采集了23份根際土壤，共分離出87株細菌。經過雙層平板打孔法，初次篩選出8株對冰核細菌有拮抗作用的菌株。根據8株拮抗細菌的抑菌圈平均直徑、增殖速度，復篩出3株強拮抗細菌XH、XM、XL。XH對冰核細菌Z-B的拮抗效果最好，抑菌圈平均直徑達19.731 mm；對冰核細菌Z-A的拮抗效果次之，抑菌圈平均直徑達11.671 mm；對Z-QCH的拮抗效果最弱，抑菌圈平均直徑僅有9.521 mm。XM對冰核細菌Z-QCH的拮抗效果最好，抑菌圈平均直徑達20.973 mm；對冰核細菌Z-B的拮抗效果較弱，抑菌圈平均直徑達15.093 mm；對Z-C的拮抗效果最弱，抑菌圈平均直徑為10.853 mm。XL對冰核細菌Z-A的拮抗效果最好，抑菌圈平均直徑達17.563 mm；對冰核細菌Z-C的拮抗效果次之，抑菌圈平均直徑達12.873 mm；對Z-B的拮抗效果最弱，抑菌圈平均直徑僅有11.151 mm。抑菌效果見圖1、圖2。

2.3 冰核細菌的鑒定

2.3.1 冰核細菌的形態學鑒定與生理生化鑒定

對4株冰核細菌進行革蘭氏染色和鏡檢，并且做了氧化酶、接觸酶和需氧性實驗，結果見表3。由以下結果，初步判定這4株冰核細菌為假單胞屬(Pseudomonas)和泛菌屬(Pantoea)。

2.3.2 16S rDNA序列分析

對4株冰核細菌的16S rDNA片段進行測序，在NCBI上用BLAST 程序與GenBank 中已登錄的基因序列進行比對[18]，BLAST結果為：Z-QCH的16S rDNA序列與綠黃假單胞菌(P.viridiflava)有99%的同源性；Z-A、Z-B的16S rDNA序列與菠蘿泛菌(P.ananatis)有99%的同源性；Z-C的16S rDNA序列與成團泛菌(P.agglomerans)有99%的同源性。

圖1 拮抗細菌XH、XM、XL對冰核細菌Z-B的抑菌效果

圖2 拮抗細菌XM對冰核細菌Z-QCH的抑菌效果

表3 4株冰核細菌的形態特征及生理生化反應

項目Z?AZ?BZ?CZ?QCH菌落特征圓形、黃色、直桿狀、菌落邊緣整齊、光滑圓形、淺黃色、直桿狀、菌落邊緣整齊、光滑圓形、乳黃色、直桿狀、菌落邊緣整齊、光滑圓形、乳黃色、直桿狀、菌落邊緣整齊、光滑革蘭氏染色G-G-G-G-氧化酶----接觸酶++++需氧性實驗兼性厭氧兼性厭氧兼性厭氧嚴格好氧

將4條序列的相關信息提交到GenBank，獲得登錄號：Z-A：KY604956、Z-B：KY604955、Z-C：KY604954、Z-QBH：KY604957。

使用PAUP(phylogenetic analysis using parsimony)進行最大簡約分析，并建立系統發育樹(圖3、圖4)。從系統發育樹中看出，Z-A、Z-B與泛菌屬的菠蘿泛菌(P.ananatis)在一個類群，Z-C與泛菌屬的成團泛菌(P.agglomerans)在一個類群。Z-QCH與綠黃假單胞菌(P.viridiflava)在一個類群。根據冰核細菌Z-A、Z-B、Z-C、Z-QCH的菌株形態特征及生理生化反應，并結合16S rDNA的系統發育分析，將Z-A、Z-B鑒定為菠蘿泛菌(P.ananatis)，Z-C是成團泛菌(P.agglomerans)，Z-QCH是綠黃假單胞菌(P.viridiflava)。

圖3 依據16S rDNA序列構建3株冰核細菌的系統發育樹

圖4 依據16S rDNA序列構建冰核細菌Z-QCH的系統發育樹

2.4 冰核細菌拮抗菌的鑒定

2.4.1 拮抗細菌形態特征和生理生化反應

在油鏡下觀察，3株拮抗細菌均呈直桿狀，兩端鈍圓，革蘭氏染色菌體呈藍紫色，為革蘭氏陽性菌，芽孢染色為藍綠色，都能產芽孢，芽孢呈卵圓形或橢圓形。菌株XH、XM、XL的生理生化反應見表4。

2.4.2 16S rDNA序列比對

通過16S rDNA序列BLAST比對結果發現，3株細菌與芽孢桿菌16S rDNA的序列同源性都為99%。通過16S rDNA并不能把3株細菌鑒定到種的水平。通過加測gyrA基因，將所得序列BLAST比對結果發現，XH、XM的gyrA基因與解淀粉芽孢桿菌的gyrA基因同源性達99%。

表4 菌株XH、XM、XL的生理生化反應

實驗項目XHXLXMVP反應+++MR--+硝酸鹽還原+++脂酸---氧化酶---淀粉水解+++接觸酶+++

通過測序，分別得到XH、XM的gyrA序列和XL、XM的16S rDNA序列。將序列的相關信息提交到GenBank，獲得gyrA序列登錄號XH(KY604960)、XM(KY604961)，16S rDNA序列登錄號XL(KY604958)、XM(KY604959)，建立系統化發育樹(圖5)。

圖5 依據16S rDNA與gyrA基因序列構建3株拮抗菌的系統發育樹

從圖5系統發育樹中看出，XH、XM離解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)最近，在一個類群，XL與甲基營養型芽孢桿菌(B.methylotrophicus)在一個類群。

根據拮抗菌XH、XM、XL的菌株形態特征及生理生化反應，結合16S rDNA基因分析，將XH、XM鑒定為解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens),XL是甲基營養型芽孢桿菌(B.methylotrophicus)。

3 討論

本試驗從霜凍植物上分離到的4株冰核細菌Z-A、Z-B、Z-C、Z-QCH，分屬于3個種，其中Z-QCH是綠黃假單胞菌(P.viridiflava)，Z-A、Z-B是菠蘿泛菌(P.ananatis)，Z-C是成團泛菌(P.agglomerans)；可歸為假單胞屬(Pseudomonas)和泛菌屬(Pantoea)2個屬，這2個屬的冰核細菌都具有很強的冰核活性。本試驗從遵義市匯川區鳳凰山采集到瞿麥，從遵義市紅花崗區南宮濕地公園采集到芭蕉，從習水縣丹霞谷采集到茶樹，從綏陽縣清溪湖景區采集到鳶尾。Z-A的寄主植物是瞿麥，Z-B的寄主植物是鳶尾，Z-C的寄主植物是茶樹，Z-QCH的寄主植物是芭蕉。韋建福等[23]在1992—1994年從云南植物上分離到歐文氏菌屬(Erwinia)和假單胞菌屬(Pseudomonas)2個屬的冰核細菌。黃曉琴等[24]在山東茶樹上分離到泛菌屬(Pantoea)的冰核細菌。本試驗在貴州省遵義市分離到假單胞屬(Pseudomonas)和泛菌屬(Pantoea)的冰核細菌，未分離到歐文氏菌屬(Erwinia)的冰核細菌。

從土壤中分離到的3株拮抗菌均為芽孢桿菌屬(Bacillus)，將測序結果與GenBank數據庫中已知序列進行BLAST分析，發現XH、XM、XL的16S rDNA序列與芽孢桿菌屬的基因同源性一致，由于16S rDNA跟生理生化反應并不能將細菌的鑒定準確到種，目前報道的gyrA能區別到種，因此，基于16S rDNA、gyrA基因，以及其生理生化指標，對3個菌株進行鑒定。將XH、XM鑒定為解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)，XL是甲基營養型芽孢桿菌(B.methylotrophicus)。解淀粉芽孢桿菌在其生長過程中可以產生一系列脂肽類物質、聚酮類物質還有具有蛋白活性的抑菌物質，包括表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(iturin)和芬薺素(fengycin)等幾大類物質，這些物質對細菌、真菌、病毒和支原體有良好抑制作用[23-24]。本試驗從土壤中分離的2株解淀粉芽孢桿菌對冰核細菌有很好的抑制作用。但是，由于微生物的生長繁殖容易受到外界溫度的影響，并且，環境中有很多不確定的干擾因素，如雨水會稀釋菌液的濃度、大風會加速菌液的蒸發。因此，今后有必要就拮抗菌的抗菌機理以及如何在稀釋濃度的情況下保證甚至是提高其拮抗作用進行更深入的研究。

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(責任編輯：張韻)

2017-02-22

冰核細菌的分離鑒定及其拮抗菌的篩選(貴大人基合字[2013]26號)

趙晨心(1992—)，女，山西高平人，在讀碩士研究生，研究方向為植物病害防治，E-mail:1099252966@qq.com。