5個燕麥品種基因組DNA的提取

閆艷華，杜京旗，李嬌嬌

(呂梁學(xué)院 生命科學(xué)系，山西 呂梁 033000)

5個燕麥品種基因組DNA的提取

閆艷華，杜京旗，李嬌嬌

(呂梁學(xué)院 生命科學(xué)系，山西 呂梁 033000)

以5個不同品種的燕麥種子和葉片為原料，用CTAB法提取燕麥基因組DNA，最后通過吸光度來檢測所提取DNA的純度和質(zhì)量，確保提取出純度較高的燕麥基因組DNA樣品。結(jié)果表明，燕麥葉子基因組DNA比燕麥種子基因組DNA要容易提取得多，得到的DNA溶液質(zhì)量比較高，而這5種燕麥的基因組DNA的提取難易程度不同，只有符合要求純度的燕麥基因組DNA才可以用于進(jìn)一步研究。

燕麥； 基因組DNA； CTAB法； 吸光度

燕麥屬于禾本科燕麥屬一年生草本植物，分為有殼和無殼兩大類，即皮燕麥和裸燕麥。燕麥抗旱、抗寒，是我國主要高寒作物之一，在貧苦地區(qū)是不可缺少的干糧，市場開發(fā)前景廣闊[1-5]。但是燕麥DNA提取過程中易受纖維、蛋白質(zhì)、酚類，脂類、糖類及其他干擾物質(zhì)含量的影響，DNA提取的質(zhì)量較差，嚴(yán)重影響燕麥分子生物學(xué)方面的研究與進(jìn)展[6-8]。

本研究旨在用燕麥葉片和種子兩種不同材料通過改良的CTAB法得到優(yōu)質(zhì)的基因組DNA，為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試燕麥種子由呂梁學(xué)院生物實驗室提供，保存于4 ℃冰箱內(nèi)。5個品種分別是定燕1號、白燕2號、寧莜1號、晉燕17號和晉燕8號。

主要試劑有無水乙醇、氯仿、異戊醇、CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)、Tris(三羥甲基氨基甲烷)、EDTA(乙二胺四乙酸)、氯化鈉、2-巰基乙醇、濃鹽酸、氫氧化鈉、蒸餾水等。

主要儀器有HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋、Neofuge13R型臺式高速冷凍離心機(jī)、UV-1601雙光束紫外/可見分光光度計、超低溫冰箱、pH值試紙、玻璃棒、移液器、研缽、1.5 mL的離心管、電子天平、微波爐。

1.2 方法

1.2.1 提取DNA的方法與步驟

采取CTAB法對燕麥基因組DNA進(jìn)行提取。植物材料經(jīng)過粉碎，提取液中的陽離子去垢劑十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)能夠溶解細(xì)胞膜和核膜，解聚核蛋白，且與DNA形成復(fù)合物。在高鹽條件下，該復(fù)合物是可溶的[9]。用氯仿等有機(jī)溶劑抽提可使蛋白質(zhì)變性，使多糖沉淀，經(jīng)過離心，CTAB-DNA復(fù)合物仍留在上清液中；降低鹽濃度，則CTAB-DNA復(fù)合物發(fā)生沉淀，沉淀用高鹽TE緩沖液溶解后，加入無水乙醇，CTAB仍留在溶液中，但DNA發(fā)生沉淀，沉淀溶于TE緩沖液中，即可得到植物基因組DNA[9]。

1.2.2 備用試劑的配制

氯仿/異戊醇。按照體積比24∶1的比例配制即可，在4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

CTAB/NaCl溶液。4.1 g NaCl溶解于80 mL蒸餾水中，緩緩加入10 g CTAB，邊加熱邊攪拌至溶解，用蒸餾水定容至100 mL。

TE緩沖液。10 mL 0.01 mol·L-1pH值8.0的Tris-HCl和40 mL 0.001 mol·L-1pH值8.0的EDTA混合，加入蒸餾水定容至100 mL，配制成TE緩沖液。

pH值8.0 Tris-HCl。50 mL 0.2 mol·L-1的Tris加26.8 mL的0.2 mol·L-1的HCl，定容至200 mL。

pH值8.0 CTAB提取液。2 g CTAB加蒸餾水40 mL，加0.1 mol·L-1Tris-HCl(pH值8.0)10 mL、0.5 mol·L-1EDTA(pH值8.0)4 mL和5 mol·L-1NaCl 28 mL，待CTAB溶解后用蒸餾水定容到100 mL。

1.2.3 DNA的提取

燕麥種子在清水中浸泡后除去外殼，放在預(yù)冷的研缽內(nèi)迅速磨碎，用電子天平稱取0.1 g燕麥種子粉末，轉(zhuǎn)入1.5 mL無菌離心管。

將一定量CTAB提取液中加入2-硫基乙醇至終體積分?jǐn)?shù)的2%，在水浴鍋中加溫至65 ℃。然后向上述裝有燕麥種子粉末的離心管中加入600 μL的預(yù)熱CTAB提取液，在65 ℃的水浴鍋中保溫30 min，期間不斷搖晃離心管。

向上述離心管中加入500 μL的氯仿/異戊醇，顛倒離心管數(shù)次，然后在4 ℃，11 000 r·min-1下離心10 min，取上清液轉(zhuǎn)移到另一個離心管中。

向上清液中加入1/10體積的CTAB/NaCl溶液并預(yù)熱到65 ℃，顛倒離心管數(shù)次。再向離心管中加入相同體積的氯仿/異戊醇，晃動離心管幾次。室溫，11 000 r·min-1下離心10 min，用移液管吸取上清液轉(zhuǎn)移到另一個離心管中。

然后再加入等體積的氯仿/異戊醇，相同條件下重復(fù)離心幾次，直到中間沒有白色物質(zhì)，取上清到一個無菌離心管中。

向上述離心管中加入2倍體積的無水乙醇，-20 ℃下靜置30 min。

在4 ℃條件下，14 000 r·min-1離心15 min，棄上清，留下沉淀物。

沉淀用75%的乙醇潤洗1次，室溫干燥，用TE緩沖液溶解沉淀，得到DNA溶液，在-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

葉片DNA的提取方法和步驟與種子基本一樣。

1.3 紫外分光光度計檢測提取的DNA純度

核酸之所以具有紫外吸收的性質(zhì)，是因為其堿基均具有共軛雙鍵。核酸在260～290 nm處有較強(qiáng)吸收峰，在260 nm處吸收值最大，230 nm吸收值最小；蛋白質(zhì)在280 nm處吸收值最大。因此可以根據(jù)所測定樣品的D260/D280的比值來判斷提取的DNA的純度。

在紫外分光光度計上分別設(shè)置260、280 nm兩個波長，用TE緩沖液進(jìn)行空白對照，對每種燕麥提取的基因組DNA溶液進(jìn)行吸光度測定，并計算D260/D280。

2 結(jié)果與分析

D值檢測燕麥中提取的基因組DNA純度的標(biāo)準(zhǔn)是由D260，D280和D260/D280的比值來判斷的，當(dāng)D260/D280≈1.8時，DNA純度最高；當(dāng)D260/D280<1.8時，說明有蛋白質(zhì)等雜質(zhì)；當(dāng)D260/D280≈2.0時，說明RNA含量較高，DNA降解多[10]。

由表1可知，寧莜1號種子的D260/D280>2.00，而且在260 nm時吸光度最大，說明寧莜1號在DNA提取過程中有RNA的干擾。晉燕17號種子中提取的DNA在280 nm下D值較大，說明在提取過程中沒有很好的抽提掉蛋白質(zhì)，排除蛋白質(zhì)的干擾。由吸光度比值可知，定燕1號提取的DNA純度最高，其次是白燕2號、晉燕17號和晉燕8號，最后是寧莜1號。燕麥葉子中提取的DNA的D值基本與之保持一致。

表1 提取的5種燕麥基因組DNA吸光度

提取部位燕麥品種D260D280D260/D280種子定燕1號124406581892白燕2號117810041773寧莜1號127406322013晉燕17號116210191714晉燕8號126306551926葉片定燕1號129407181802白燕2號119306651793寧莜1號114105991902晉燕17號126207271734晉燕8號136407181893

由圖1可以看出，葉片中DNA純度次序基本與種子中一樣，葉片中提取的DNA的D260/D280趨向于1.80這條標(biāo)準(zhǔn)線。也就是說，葉片中提取的DNA的質(zhì)量和純度比種子中提取的DNA的質(zhì)量和純度要高。總體上葉片中提取的DNA更加適合做燕麥基因組DNA模板，用于下一步的研究。由此可知，葉片比種子中的DNA更易提取，或者說葉子中本身的干擾因素少。

1表示定燕1號，2表示白燕2號，3表示寧莜1號，4表示晉燕17號，5表示晉燕8號圖1 種子和葉片提取的DNA的純度對比

3 小結(jié)與討論

燕麥的種子中含有較多的多糖、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，這些物質(zhì)都對燕麥基因組DNA的提取造成一定程度的干擾，去除這些雜質(zhì)是提取純度較高的DNA的重要一步。葉子中雖含有多酚類物質(zhì)較多，但相對種子來說比較好抽提，所以葉子中提取的DNA質(zhì)量比種子中提取的DNA質(zhì)量高。

本試驗采用的是CTAB法提取燕麥2個部位的DNA。1)由檢測結(jié)果看，CTAB法可得到較高質(zhì)量總DNA，從成本上看，是較理想的方法[11]。2)氯仿/異戊醇抽提雜質(zhì)時，并不是一次就可以成功，必須進(jìn)行多次離心、多次抽提才可以把雜質(zhì)最大程度的去除，但有時會起到負(fù)作用。3)用無水乙醇沉淀DNA時，乙醇的溫度特別重要，只有在低溫下才可以較多的沉淀出DNA，然后再在低溫下進(jìn)行離心才可以得到較多DNA沉淀；如果溫度沒有控制好，DNA沉淀的會很少，甚至已經(jīng)沉淀的DNA裂解了，以至于得不到高質(zhì)量的DNA。4)EDTA在堿性溶液中才能較好的溶解，在溶解EDTA時可以加入氫氧化鈉。而CTAB必須在65 ℃左右才是液體狀，濃度高的CTAB低溫下會變成膠狀，濃度低的CTAB在低溫下會結(jié)晶。5)酚是芳香烴環(huán)上的氫被羥基取代的一類芳香族化合物。最簡單的酚為苯酚。酚類化合物是指芳香烴中苯環(huán)上的氫原子被羥基取代所生成的化合物，根據(jù)其分子所含的羥基數(shù)目可分為一元酚和多元酚。因為燕麥中多酚物質(zhì)的影響，DNA很快會發(fā)生褐變，2-巰基乙醇的存在有效防止了DNA的氧化褐變。6)本試驗采取的CTAB法提取燕麥基因組DNA并沒有適合所有的燕麥種類，有些燕麥可能適合另外一些提取DNA的方法。但要想滿足后續(xù)的分子生物學(xué)實驗，要求所提取的DNA必須純度很高，所以之后要根據(jù)提取的材料去找到一種最適合的方法，確保提取到純度、濃度都很大的DNA模板。

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(責(zé)任編輯：張瑞麟)

2016-01-23

呂梁學(xué)院自然科學(xué)校內(nèi)青年基金(ZRQN201512)

閆艷華(1985—)，女，山西呂梁人，碩士，從事植物遺傳與分子生物學(xué)方面的工作，E-mail: yanhua19852008@163.com。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170541

S512

A

0528-9017(2017)05-0852-03

文獻(xiàn)著錄格式：閆艷華，杜京旗，李嬌嬌. 5個燕麥品種基因組DNA的提取[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58(5)：852-855.