云南中蜂蜂箱寄居節肢動物種類及中蜂囊狀幼蟲病病毒檢測

宋文菲，梁 鋮，苗春輝，張學文，羅衛庭，楊 爽,2*

(1.云南省農業科學院 蠶桑蜜蜂研究所，云南 蒙自 661101； 2.山西農業大學 動物科技學院，山西 太谷 030801)

云南中蜂蜂箱寄居節肢動物種類及中蜂囊狀幼蟲病病毒檢測

宋文菲1，梁 鋮1，苗春輝1，張學文1，羅衛庭1，楊 爽1,2*

(1.云南省農業科學院 蠶桑蜜蜂研究所，云南 蒙自 661101； 2.山西農業大學 動物科技學院，山西 太谷 030801)

為了解中蜂蜂箱內寄居節肢動物種類及其感染中蜂囊狀幼蟲病病毒的情況，采集中蜂箱內的主要寄居節肢動物，并利用RT-PCR技術對這些節肢動物樣品進行CSBV帶毒情況檢測。結果顯示，云南省中蜂蜂箱內主要的寄居節肢動物有7種，都不同程度地感染了CSBV，且平均感染率為68.57%。研究表明，中蜂蜂箱內節肢動物可成為CSBV的攜帶者，可將病毒傳播給其他蜂群。

中蜂； 中蜂囊狀幼蟲病病毒； 蜂箱； 寄居節肢動物； 間接傳播

中蜂囊狀幼蟲病簡稱中囊病，是由中蜂囊狀幼蟲病病毒(Chinese Sacbrood Virus，CSBV)感染引起的腸道傳染性疾病，發病快，傳播迅速，嚴重影響了中蜂的生產。該病是中蜂的主要病害之一，一旦感染，很難治愈，死亡率高達60%～90%。疾病的傳播方式是其擴大感染范圍的有效途徑，一般昆蟲病毒性疾病的傳播方式分為水平傳播和垂直傳播兩種，近些年來，蜜蜂病毒性疾病的傳播方式也被西方學者廣泛研究，這些研究證實了蜜蜂病毒性疾病的傳播方式也分為水平傳播和垂直傳播[1]。水平傳播是指病毒在同一世代的蜜蜂個體中進行傳播，可分為直接與間接兩種，直接傳播包括空氣傳播感染、食物傳播感染、交尾傳播感染；間接傳播是指通過起媒介作用的生物宿主進行傳播。垂直傳播則是發生在親代與子代間的傳播，即可通過親代的卵把病毒傳播給子代。

蜂箱這個大環境里不僅住著蜜蜂，還住著許多其他的節肢動物，而這些節肢動物或多或少都會與蜜蜂及其食物接觸，這一過程也為疾病的傳播提供了途徑和媒介。中囊病作為中蜂的主要病害之一，多年來一直是研究者研究的熱點，但卻沒有找到一種行之有效的治愈方法。國外研究者研究了西蜂蜂箱內傳播該病的生物媒介，針對中蜂蜂箱內的卻鮮有報道。本文以云南中蜂蜂箱內的寄居節肢動物為研究材料，研究在中囊病高發季節蜂箱內節肢動物攜帶CSBV的情況，結果發現采集到的7種主要節肢動物均被檢測到攜帶CSBV，表明中蜂箱內的寄居節肢動物可成為CSBV傳播的生物媒介。本文研究結果為研究CSBV潛在的主要傳播媒介提供前期基礎，也為研究CSBV的流行病學提供了技術支持。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

樣品采集時間為中囊病高發的春繁季節，時間為2015年3—4月。采集地點為云南省楚雄州武定縣、紅河州蒙自市、西雙版納州勐海縣、曲靖市羅平縣。蜂箱包括木制和水泥制2種。采集的樣品保存在-80 ℃。

1.2 總RNA提取

參照許益鵬等[2]的方法，并加以改進。具體步驟如下：每群取5只樣品(蟑螂、蚰蜒、衣魚等個體較大的蟲體，需將蟲體用滅菌手術剪剪成3～4段，每段為1個樣品進行檢測)，取1只置于1.5 mL離心管內，加入1 mL Trizol，用玻璃研棒充分勻漿，靜置5 min；加入200 μL氯仿，充分震蕩，靜置2 min；4 ℃，12 000 r·min-1離心15 min；取上清液400～600 μL，加氯仿200 μL，混勻靜置5 min；4 ℃，12 000 r·min-1離心10 min；取上清液200～300 μL，加入等量的異丙醇，混勻，靜置10 min；4 ℃，12 000 r·min-1離心10 min；沉淀以75%乙醇洗；4 ℃，12 000 r·min-1離心5 min；倒去乙醇，真空抽干，用40 μL DEPC處理水溶解，-80 ℃保存備用。

1.3 RT-PCR擴增

2 結果與分析

2.1 蜂箱內昆蟲種類

經調查發現，蜂箱內有蠟螟、螞蟻1(一種大螞蟻)、螞蟻2(一種小的黃色螞蟻)、蟑螂、衣魚、疑似黑粉甲(Alphitobiusdiaperinus，Panzer，1796)的小甲蟲、蚰蜒(圖1～2)。

圖2 水泥制中蜂蜂箱內3種主要寄居節肢動物

2.2 RT-PCR擴增結果

部分昆蟲的RT-PCR擴增結果如圖3～4所示，目的片段為487 bp。圖3中泳道1～3為蟑螂樣品，4和10為螞蟻1樣品，5～9為蠟螟樣品。圖4中泳道1～5為衣魚樣品，6為蠟螟樣品，泳道7～11為蚰蜒樣品，12為蠟螟樣品。檢測結果顯示，被檢測的蟑螂、蠟螟、衣魚、蚰蜒、螞蟻1樣品都不同程度的感染了CSBV。

2.3 節肢動物感染CSBV情況

中蜂蜂箱內寄居節肢動物感染CSBV的情況見表1，7種節肢動物都不同程度地感染了CSBV，平均感染率為68.57%。

表1 中蜂蜂箱內寄居節肢動物感染CSBV情況

昆蟲名稱感染率/%采集地區衣魚100曲靖市羅平縣蚰蜒40曲靖市羅平縣蠟螟20蒙自市草壩鎮蟑螂40蒙自市草壩鎮螞蟻1100蒙自市草壩鎮螞蟻280曲靖市羅平縣疑似黑粉甲100楚雄州武定縣

1～3為蟑螂樣品，4、10為螞蟻1樣品，5～9為蠟螟樣品；M為DL1 000 Marker; 泳道3～4感染CSBV(487 bp)，泳道1～2和5未感染；泳道7、10感染CSBV(487 bp)，泳道6、8～9未感染圖3 蟑螂、螞蟻1、蠟螟樣品感染CSBV情況

1～5為衣魚樣品，4、6、12為蠟螟樣品，7～11為蚰蜒樣品；M為DL1 000 Marker; 泳道1～5感染CSBV(487 bp)，泳道6未感染；泳道10～11感染CSBV(487 bp)，泳道7～9、12未感染圖4 衣魚、蚰蜒、蠟螟樣品感染CSBV的情況

3 討論

宿主的成功傳毒依賴于獲毒、持毒、病毒穩定性、病毒釋放等幾個環節。病毒性疾病的傳播方式一直是研究者研究防治該種疾病的一個重要方面。德國和希臘的研究者在20世紀80年代對蜜蜂病毒性疾病的水平傳播方式進行了初步研究發現，患有蜜蜂囊狀幼蟲病的西蜂群中也嚴重感染了大蜂螨，推測病毒的流行與大蜂螨的發生緊密相聯，認為蜂螨能夠攜帶蜜蜂囊狀幼蟲病病毒 (Sacbrood bee virus，SBV)，并將病毒傳播給中蜂蜂群。蜂螨作為一種潛在的蜜蜂病毒攜帶者，病毒可在其體內復制[4-5]，被其浸入到蜜蜂血淋巴里，造成蜜蜂免疫抑制，同時也影響著蜜蜂體內的營養狀態[6]。2001—2003年，在瓦螨暴發的新西蘭蜜蜂群中就檢測到包括SBV在內的5種蜜蜂病毒[7]。研究發現，除了蜂螨，蜂巢內的其他寄生蟲，如螞蟻、小蜂巢甲蟲、壁虱等也是蜜蜂病毒的攜帶者[8-10]。本文的研究結果與前人的研究結果相符[11]，發現中蜂箱內的7種主要寄居節肢動物在CSBV高發季節都是CSBV的攜帶者，表明CSBV的傳播不單純是蜂群內部的食物或飼喂接觸傳播，與蜂群共同生活的節肢動物也是該病毒的潛在傳播媒介。

我國是蜜蜂疾病流行與暴發最為嚴重的地區之一，每年因疾病流行損失大量飼養蜂群，疾病的廣泛傳播成為我國蜜蜂生物多樣性快速下降的一個主要因素[12]。目前，對中囊病防控措施的研究報道多局限在發病后，采取藥物、加強飼養管理、換王斷子等綜合防治措施，但效果一般，而從病毒的傳播途徑角度尋找解決方法的研究，卻鮮有報道。雖然國外研究者對包括SBV在內的多種蜜蜂病毒的傳播方式及潛在的生物傳播媒介進行了大量的研究，但CSBV與SBV是2個獨立的病毒株。研究表明，同一病毒種的不同病毒株的傳播方式特性也是不盡相同的[13]，且中蜂和意蜂又是兩種完全不同的蜂種。因此，有必要對中蜂蜂箱內CSBV的傳播媒介進行研究，為培育抗病中蜂良種提供前期基礎。

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(責任編輯：張瑞麟)

2017-03-20

國家現代農業產業技術體系(蜜蜂)(CARS-45-SYZ 17)；云南省農業科學院基礎性超前預研項目(2014CZJC014)；國家自然科學基金應急管理項目(31640080)

宋文菲(1983—)，女，吉林蛟河人，助理研究員，碩士，從事蜜蜂病害防治及良種選育研究工作，E-mail: wenfeisong@126.com。

楊 爽，從事中蜂病蟲害研究工作，E-mail: yangshuang19860724@163.com。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170544

S896.1

A

0528-9017(2017)05-0861-03

文獻[3]中SBV片段SB1-2引物SBV-F(5′-ACCAACCGATTCCTCAGTAG-3′)，SBV-R (5′-CCTTGGAACTCTGCTGTGTA-3′)。RT-PCR反應體系為：20 μL體系中含有RNase Free dH2O 8.7 μL，MgCl2(25 mmol·L-1) 4 μL，10×One Step RNA PCR Buffer 2 μL，dNTP Mixture(10 mmol·L-1) 2 μL，RNase Inhibitor(40 U·μL-1) 0.3 μL, AMV Reverse Transcriptase XL(5 U·μL-1) 0.3 μL，AMV-Optimized Tap (5 U·μL-1) 0.3 μL，上下游引物各0.8 μL，總RNA 0.8 μL。反應條件：50 ℃反轉錄30 min，94 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環，4 ℃保存。取PCR產物5 μL用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

文獻著錄格式：宋文菲，梁鋮，苗春輝，等. 云南中蜂蜂箱寄居節肢動物種類及中蜂囊狀幼蟲病病毒檢測[J].浙江農業科學，2017，58(5)：861-864.