牛乳頭狀瘤病診斷及其病毒基因型分析

盧 柳 ， 張 軍 ， 周碧君 ， 張 旭 ， 趙夢婕 ， 何 娜 ， 王開功 ， 文 明 ， 張 海

(1.貴州大學動物科學學院 ， 貴州貴陽550025； 2.貴州省六盤水市動物衛(wèi)生監(jiān)督所 ， 貴州六盤水553001)

牛乳頭狀瘤病診斷及其病毒基因型分析

盧 柳1， 張 軍2， 周碧君1， 張 旭1， 趙夢婕1， 何 娜1， 王開功1， 文 明1， 張 海1

(1.貴州大學動物科學學院 ， 貴州貴陽550025； 2.貴州省六盤水市動物衛(wèi)生監(jiān)督所 ， 貴州六盤水553001)

對貴州省晴隆縣某種牛場暴發(fā)的疑似牛乳頭狀腫瘤病進行診斷，采用流行病學調(diào)查、臨床癥狀觀察、病理切片觀察、PCR檢測和分子分型。結(jié)果顯示，該種牛場牛乳頭狀瘤病發(fā)病率為35%(7/20)。瘤體多呈結(jié)節(jié)狀及菜花狀，顏色多呈灰白色。病理切片顯示，瘤體呈現(xiàn)角質(zhì)化過度和細胞空泡化現(xiàn)象。遺傳進化樹分析顯示，貴州省晴隆縣暴發(fā)的牛乳頭狀腫瘤病是由BPV2型牛乳頭瘤病毒所引起。本研究為貴州地區(qū)牛乳頭狀瘤病的科學防控提供了一定的理論依據(jù)。

牛乳頭狀瘤 ； 診斷 ； 基因型分析

牛乳頭狀瘤病是由牛乳頭瘤病毒(Bovinepapillamavirus,BPV)引起的一種皮膚或部分黏膜發(fā)生的慢性增生性傳染性疾病，也稱為“牛疣”[1]。牛乳頭狀瘤病于1929年被首次報道之后，現(xiàn)在在世界各地都廣泛流行并傳播，加拿大、澳大利亞、英國、美國和德國等均有該病的報道[2]。近兩年在我國新疆、東北和海南地區(qū)也有該病的報道[3-4]。牛乳頭狀瘤病是牛常見的良性腫瘤疾病，但嚴重時瘤體會由良性變成惡性腫瘤而引起家畜的死亡，因此會給養(yǎng)牛場帶來巨大的經(jīng)濟損失。根據(jù)最新報道，BPV可分為14個基因型[5]，不同基因型的病毒可以引起不同部位的病理變化，且BPV具有很強的種屬特異性，很難感染除宿主以外的其他動物[6-7].

近年來，貴州省不斷從其他地方引進優(yōu)良品種牛，牛養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，在發(fā)展養(yǎng)牛業(yè)的同時也帶來了本地區(qū)未發(fā)生過的疾病。2016年1月晴隆縣某種牛場暴發(fā)疑似牛乳頭狀瘤病，通過對該種牛場進行流行病學調(diào)查，臨床觀察、對疑似病料進行了病理觀察、PCR檢測和分子分型，為該病在貴州省的科學防控提供了一定指導。

1 材料

1.1 病料 貴州省晴隆縣某種牛場患病種牛經(jīng)臨床診斷，外科手術(shù)摘除病牛體表的乳頭樣腫瘤物，送至貴州大學動物科學學院動物疫病研究所保存。

1.2 主要試劑 2×TaqPCR Master Mix、DNA提取試劑盒，購自天根生化科技有限公司；膠回收試劑盒，購自O(shè)MEGA公司；載體pMD19-T，購自TaKaRa公司；DL-2 000 DNA Marker，購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；DH5α感受態(tài)細胞由貴州大學動物疫病研究所保存。

2 方法

2.1 流行病學及臨床癥狀調(diào)查 調(diào)查種牛場的養(yǎng)殖規(guī)模，種牛品種，牛乳頭狀瘤發(fā)病率、死亡率；牛乳頭狀瘤形狀、大小以及發(fā)病部位等。2.2 病理組織學檢查 觀察發(fā)病種牛的乳頭樣腫瘤物形態(tài)特征，取皮膚腫瘤樣物經(jīng)4%多聚甲醛溶液中固定，制作病理切片，光鏡觀察組織病理學變化。

2.3 引物設(shè)計 參考GenBank公布的各型BPV L1基因序列，設(shè)計1對引物P1：5′-ATGGCGTTGTGGCAACAAG-3′，P2：5′-TTAAGCTTTGATTTTTTTTC-3′，引物由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成。

2.4 PCR擴增產(chǎn)物檢測 通過引物P1/P2對奶牛病變皮膚進行PCR檢測，反應(yīng)采用25 μL體系，反應(yīng)體系為：2xTaqPCR Maeter Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板2.0 μL，用滅菌雙蒸水補足體積至25 μL。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2.5 基因序列測定與分子分型 將克隆的陽性質(zhì)粒，送上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司進行序列測定。利用DNAStar等軟件對BPV晴隆株和GenBank登錄的BPV不同型的流行基因序列進行比對分析，用MEGA5.0軟件進行同源性分析，并采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

3 結(jié)果與分析

3.1 流行病學調(diào)查和臨床癥狀觀察 該種牛場2015年12月向澳大利亞引進的安格斯種牛，牛乳頭狀腫瘤病發(fā)病率為35%(7/20)，無病牛死亡。臨床觀察發(fā)現(xiàn)牛乳頭狀腫瘤多發(fā)生在面部、眼睛周圍、頸部等位置。嚴重病例在面部、頸部均能見到大面積乳頭狀瘤狀物，瘤體間單獨或者連成一片生長。瘤體多呈菜花狀，顏色呈灰白色，表面光滑或粗糙、質(zhì)地堅硬。

3.2 病理組織學切片結(jié)果 對皮膚腫瘤樣物病理組織切片，經(jīng)H.E.染色鏡檢顯示，表皮與真皮增生；腫瘤細胞呈梭形或星型，核呈卵圓形；表皮細胞呈現(xiàn)過度角質(zhì)化和部分顆粒細胞空泡化的現(xiàn)象，結(jié)果見中插彩版圖1A和1B。3.3 PCR檢測結(jié)果 牛乳頭狀瘤疑似病料中，PCR檢測陽性樣品，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，所擴增的目的PCR產(chǎn)物的大小約1 494 bp，結(jié)果見圖2。

圖2 牛乳頭狀瘤疑似病料PCR產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果

M：DL-2 000 DNA Marker； 1～3：擴增結(jié)果； —：陰性對照

3.4 BPV L1基因核苷酸序列同源性分析 將本實驗克隆的L1基因(命名為BPV-QL1)與GenBank上公布的16株BPV各型的L1基因的對應(yīng)序列進行比對分析，結(jié)果顯示,貴州省晴隆流行株與BPV2、BPV2-SW01和BPV2-AKS01參考株的核苷酸同源性分別為99.1%、99.9%、99.4%，同時與BPV13參考株、BPV1參考株的核苷酸同源性也達88.8%、84.4%，結(jié)果見圖3。

3.5 BPV L1 基因遺傳進化樹分析 L1基因是BPV基因組中比較保守的衣殼蛋白，通常用于各型病毒之間的基因分型。將各型BPV的L1基因序列進行對比分析，并采用NJ法(Neighbor-JingMethod)構(gòu)建BPV系統(tǒng)進化樹(圖4)。經(jīng)DNAStar分析表明，BPV-GZ01與BPV2處于同一遺傳進化分支，所以BPV-QL1屬于2型牛乳頭瘤病毒，且與BPV-1、BPV-13親緣關(guān)系比較接近。

4 討論

牛乳頭狀瘤病毒(BPV)屬于乳多空病毒(papovavirus)科乳頭狀病毒屬[10]的一種雙鏈DNA病毒，已報道有14個基因型，還有很多假定基因型。在本研究中，根據(jù)牛的臨床癥狀[8-9]查閱相關(guān)資料，針對BPV L1保守序列設(shè)計特異性引物進行PCR擴增，克隆測序后與報道的牛乳頭狀瘤病毒14個基因型進行同源性和遺傳進化樹分析，證實該牛場發(fā)生的牛乳頭狀瘤病為2型牛乳頭瘤病毒感染。臨床觀察牛乳頭狀瘤為灰白色，菜花狀，質(zhì)地堅硬，表面略有粗糙。病理組織學觀察發(fā)現(xiàn)牛乳頭狀瘤有過度角質(zhì)化和部分顆粒細胞的空泡化現(xiàn)象。

圖3 BPV-QL1株與BPV不同基因型的L1基因核苷酸序列比較BPV1(X02346)、BPV2(M20219)、BPV2-SW01(KC878306)、BPV2-AKS01(KM455051)、BPV3(AF486184)、BPV4(X05817)、BPV5(AF457465)、BPV6(AJ620208)、BPV7(DQ217793)、BPV8(DQ098913)、BPV9(AB331650)、BPV10(AB331651)、BPV11(AB543507)、BPV12(JF834523)、BPV13(JQ798171)、BPV14(KP276343)

圖4 L1基因序列構(gòu)建的不同基因型BPV系統(tǒng)進化樹

發(fā)病牛和健康牛群居是導致牛之間互相感染牛乳頭狀瘤病毒的主要原因。該病一般呈良性經(jīng)過，死亡率不高，但康復(fù)時間比較長，可用手術(shù)方法摘除瘤體，術(shù)后及時護理，并加強飼養(yǎng)管理，及時隔離病牛等措施進行預(yù)防和治療。

近兩年貴州省大力發(fā)展養(yǎng)牛業(yè)，從國外和省外引進了優(yōu)質(zhì)的種牛，同時許多外來疾病也隨之帶入，從而威脅著貴州省養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展，給養(yǎng)牛業(yè)帶來巨大的挑戰(zhàn)。此次診斷為貴州地區(qū)外來疾病的科學防控提供了一定的理論依據(jù)。

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Diagnosis of Bovine Papilloma and the Virus Genetyppe Analysis

LU Liu1， ZHANG Jun1， ZHOU Bi-jun1， ZHANG Xu1， ZHAO Meng-jie1， HE Na1，WANG Kai-gong1， WEN Ming1， ZHANG Hai1

(1.College of Animal Science, Guizhou University, Guiyang 550025, China; 2.Animal Health Supervision Institute of Liupanshui City， Liupanshui 553001， China)

The purpose of this study was to diagnose the outbreak of suspected cattle papillary tumor in a cattle farm in Qinglong County in Guizhou province by the epidemiological investigation, clinical symptoms, pathological observation, PCR molecular detection and molecular typing. The results showed that the cattle farm bovine papilloma incidence rate was 35% (7/20). The tumor was nodular and cauliflower, and the color was gray. Pathological section showed that the tumor body had the phenomenon of stratum corneum and vacuole. Genetic evolutionary tree analysis showed that the outbreak of bovine papillary tumor in Qinglong County, Guizhou province was caused by the BPV2 type of bovine papilloma virus. This study provides a theoretical basis for the scientific prevention and control of bovine papilloma in Guizhou area.

Bovine papilloma ; diagnosis ; genotype analysis

ZHOU Bi-jun

2016-11-15

貴州省黔南州社會發(fā)展科技重大計劃項目《喀斯特石漠化林草牧綜合治理技術(shù)研究與示范》[黔南社發(fā)科(20140325)]；貴州現(xiàn)代肉牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(GZCYTX2015-0302-02)；貴州省農(nóng)業(yè)委員會科技專項《動物疫病防控能力提升專項》(黔農(nóng)財[2015]149號)；“貴州省動物疫病防控與獸醫(yī)公共衛(wèi)生保障科技創(chuàng)新人才團隊”(黔科合人才團隊[2015]4016號);貴州省農(nóng)業(yè)委員會科技計劃項目 [2016-01號]；貴州大學大學生“SRT”計劃項目(貴大SRT字(2015)094號)

盧柳(1994-)，女，本科生，就讀于動物醫(yī)學專業(yè)，E-mail:15761632703@163.com

周碧君，E-mail:zhoubijungzu@eyou.com

S852.65+3

A

0529-6005(2017)05-0009-03