氣相色譜質譜聯用測定奶牛血清中的β-羥丁酸

董春光， 武守艷， 楊麗華， 韓文儒， 趙晶晶， 陳劍波， 韓一超， 王俊東

(1.山西省農業科學院畜牧獸醫研究所 ， 山西太原030032 ； 2.山西省飼料獸藥監察所 ， 山西太原030027 ；3.山西農業大學動物科技學院 ， 山西太谷030801)

(1.山西省農業科學院畜牧獸醫研究所 ， 山西太原030032 ； 2.山西省飼料獸藥監察所 ， 山西太原030027 ；3.山西農業大學動物科技學院 ， 山西太谷030801)

為了建立測定奶牛血清中代謝產物β-羥丁酸含量的氣相色譜-質譜聯用方法，為奶牛酮病的早期診斷提供新途徑。將奶牛血清樣品用甲醇除蛋白，上清液經氮氣吹干，殘渣進行硅烷化衍生后，用GC-MS儀全掃描方式進行檢測。結果測定血清中β-羥丁酸的線性范圍為0.05 mmol/L～8 mmol/L，相關系數R=0.9995，檢測限為0.03 mmol/L，定量限為0.05 mmol/L,相對標準偏差RSD=5.79%，樣品加標回收率為95.10%～99.91%。表明該方法能簡便、快速、有效地分離并定量檢測血清中的β-羥丁酸，可以作為奶牛酮病的早期診斷依據。

氣相色譜-質譜法 ； β-羥丁酸 ； 奶牛酮病

奶牛酮病是泌乳牛常見的營養代謝性疾病。當奶牛的采食量不能滿足泌乳所消耗的能量需要時出現能量負平衡，從而產生過多的酮體，超過了機體自身組織能夠利用的限度時，就會在機體內蓄積，引起酮病。血液生化表現為血、尿、乳中的酮體(β-羥丁酸、丙酮、乙酰乙酸)含量增加。

在我國高產牛群中，臨床型酮病的發病率一般占產后母牛的2%～20%，而亞臨床型酮病的發病率則更高，占產后母牛的10%～30%[1]。酮病的發生直接導致治療費用增加、奶牛產奶量大幅度降低、乳成分改變、繁殖率降低以及淘汰率升高[2]，同時也能繼發母牛的營養不良和不孕癥，不僅給牧場造成很大的經濟損失，而且病牛的奶被人食用后還可能會影響人的健康[3]。在生產中，臨床型酮病有比較明顯的癥狀，容易診斷，而對于亞臨床型酮病，由于沒有明顯的臨床癥狀，給診斷帶來很大的困難，對奶牛養殖業造成的損失更大[4]。目前常用的診斷酮病的方法大多還是通過顯色反應定性鑒別的方法，不能準確、定量地判斷疾病的程度和發展過程，因此建立一種能夠盡早地、簡單快速地進行酮體定量檢測的新方法具有非常重要的現實意義。

氣相色譜-質譜聯用作為一種高效的分離分析方法，具有靈敏度高、應用范圍廣等優點[5]，近年來在疾病診斷，尤其是在疾病的早期診斷及進一步闡明發病機制方面，發揮出越來越重要的作用，而目前尚未見到用于檢測奶牛血清酮體β-羥丁酸含量從而診斷奶牛酮病及其患病程度的報道。本試驗旨在建立氣相色譜-質譜分析技術運用于酮病早期診斷的新方法，以期盡早診斷酮病，減少損失。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 6890N-5973I氣相色譜質譜聯用儀(美國Agilent公司)；氮吹儀(美國Organomation公司)；高速冷凍離心機(德國郝黎氏公司)；甲醇(色譜純，美國Dikma公司)；β-羥丁酸(純度98%，美國Alfa Aesar)，甲氧胺鹽酸鹽(純度98%，美國Sigma-Aldrich公司)；N, O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)+三甲基氯硅烷(TMCS)(99∶1，美國Sigma-Aldrich Fluka公司)；吡啶(分析純，北京索萊寶科技有限公司)。

1.2 對照溶液的配制 精確稱取β-羥丁酸標準品0.104 g于50 mL的容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到濃度為20 mmol/L的β-羥丁酸標準儲備液(-20 ℃儲存備用)。準確移取一定量的儲備液于容量瓶中，用甲醇定容至刻度，使其逐級稀釋成8 mmol/L，4 mmol/L，2 mmol/L，0.8 mmol/L，0.2 mmol/L，0.05 mmol/L，0.03 mmol/L的標準溶液，4 ℃保存備用。

1.3 樣本處理 取奶牛血清樣品200 μL，加入甲醇200 μL，旋渦振蕩30 s，10 000 r/min (4 ℃)離心10 min后取上清液于小玻璃瓶中，溫和氮氣吹干，向殘渣中加入20 mg/mL的甲氧胺鹽酸鹽吡啶溶液80 μL，旋渦振蕩30s，37 ℃孵化90 min，再加入120 μL BSTFA+TMCS硅烷化試劑，70 ℃衍生1 h，4 ℃離心后取上清液供氣相色譜-質譜測定。

1.4 氣相色譜-質譜條件 色譜柱：HP-5MS玻璃毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣量為1 μL，進樣口溫度：280 ℃；柱溫：80 ℃，保持2 min，以10 ℃/min的速率升溫至300 ℃，保持6 min；傳輸線溫度：250 ℃；離子源(EI)溫度：230 ℃；四級桿溫度：150 ℃；載氣：氦氣(99.99%)，流速：1 mL/min，質量掃描范圍：50～600 AMU；溶劑延遲時間：3.2 min。

2 結果

2.1 樣品前處理及檢測條件的優化 血清中加入甲醇后產生大量的白色沉淀，經過10 000r/min離心后，可以除去樣品中的沉淀物，上清液經氮氣吹干后即可完全除去甲醇，得到少量固體物質。再經過衍生化反應后得到清亮的液體，進行氣相色譜-質譜分析，可得到總離子流圖和質譜圖(圖1)。結果表明，此樣品處理方法既可有效去除雜質，又可充分提取目標物質，適合于氣相色譜-質譜分析。對不同濃度的β-羥丁酸在分流進樣和不分流進樣模式下的信噪比進行比較，當濃度低于0.2 mmol/L時，不分流模式的信噪比比分流模式高，仍可保持較高的敏感性，因此選用不分流進樣模式。

2.2 方法的線性關系、檢測限及定量限 將1.2項中逐級稀釋的7個濃度的β-羥丁酸標準工作溶液，分別經1.3項的方法進行處理后，在1.4項的氣相色譜和質譜條件下進行測定，結果見表1。

表1 方法的線性方程、相關系數及線性范圍

在β-羥丁酸濃度為0.03 mmol/L時，信噪比S/N=3.7，β-羥丁酸濃度為0.05 mmol/L時，信噪比S/N=12.7，確定該方法的檢測限為0.03 mmol/L，定量限為0.05 mmol/L。β-羥丁酸標準工作溶液的總離子流圖和質譜圖見圖1a，1b。

2.3 精密度試驗 取同一標準工作溶液(0.8 mmol/L)200 μL按上述相同的樣品處理方法和氣相色譜-質譜條件重復測定6次(表2)，計算該方法的精密度。測得該方法的精密度RSD為5.79%。

表2 精密度試驗

2.4 加標回收試驗 取某一奶牛血清樣品4份，每份200 μL，分別加入0 μL，80 μL，100 μL，120 μL的β-羥丁酸(2 mmol/L)標準溶液，按上述相同的前處理和氣相色譜-質譜條件，每個添加量重復進樣5次，檢驗方法的加標回收率(結果見表3)。測得β-羥丁酸的加標回收率為95.10%～99.91%。

表3 不同添加量的加標回收率

a

b

3 討論

酮體是β-羥丁酸、乙酰乙酸和丙酮的總稱。通常情況下，β-羥丁酸的含量占78%、乙酰乙酸和丙酮分別占20%和2%[6]。目前在酮病診斷方法中，多利用特定試劑與乙酰乙酸的顯色反應來達到檢測酮體的目的，但是，由于乙酰乙酸在酮體中所占比例較小，且性質不穩定，容易分解成丙酮和二氧化碳，對檢測結果的影響較大，因此，本試驗以β-羥丁酸作為檢測對象，提高了檢測的準確性。

氣相色譜-質譜法以其自身的優勢，近年來已在疾病診斷、藥物分析、代謝產物的分離分析等微量成分分析各領域得到廣泛應用[5, 7]。由于動物血清中含有大量蛋白質、脂肪酸及膽固醇等有機物，而這些物質具有一定的粘附性，很容易在色譜柱上吸附，從而影響色譜柱的使用壽命，因此，在運用GC-MS進行分析之前，為了保護色譜柱以及減少對測定的干擾，需要進行除蛋白質等前處理步驟。除蛋白質是應用有機溶劑沉淀去除血清中所含的大量蛋白質成分[8]，目前常用的除蛋白試劑有甲醇、乙腈、甲醇/乙醇等[9]，用甲醇除蛋白操作簡單且效果顯著[10]，因此，本試驗采用了甲醇作為除蛋白試劑。

氣相色譜檢測的衍生化方法有硅烷化衍生化、酯化衍生化、?；苌?，目的是將難揮發或熱不穩定化合物通過化學反應轉變成易揮發和穩定的化合物，更利于進行CC-MS分析。本試驗中利用硅烷化試劑將硅烷基引入到分子中，取代了羧基中的活性氫，從而降低了化合物的極性，形成的衍生物更容易揮發，同時穩定性也得到了加強。從試驗的線性關系，加標回收率等指標可以看出，該衍生化方法的衍生效果可以滿足檢測的要求。

4 結論

該檢測方法的分離效果好，靈敏度高，檢測范圍廣，可以準確檢測血清中β-羥丁酸的含量，為早期準確診斷奶牛酮病提供新的途徑。

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Determination of β-hydroxybutyrate in cow serum by gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS)

DONG Chun-guang1, WU Shou-yan1, YANG Li-hua1, HAN Wen-ru1, ZHAO Jing-jing2, CHEN Jian-bo1, HAN Yi-chao1, WANG Jun-dong3

(1.Animal Husbandry and Veterinary Institute, Shanxi Academy of Agricultural Science, Taiyuan 030032, China; 2.Shanxi Province Institute of Feed and Veterinary Drug Control, Taiyuan 030027, China; 3.College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China)

To establish the method of gas chromatography-mass spectrometry for measuring β-hydroxybutyrate in cow serum and provide a new way to diagnose dairy ketosis. Methanol was used for precipitating the proteins and supernate was dried by nitrogen. The concentrate was analyzed by gas chromatography-mass spectrometry after derivatization with slilylreagents. Linear relation of β-hydroxybutyrate detected in cow serum ranged from 0.05mmol/L to 8mmol/L. The correlation coefficient was 0.9995. The detection limit was 0.003mmol/L and the limit of quantitation was 0.05mmol/L. Relative standard deviation was 5.79% and the adding standard recovery was 95.10% to 99.91%. The method can separate and detect β-hydroxybutyrate in dairy serum simply, rapidly and effectively, and it is suitable for early diagnosis of dairy ketosis.

Gas chromatography-mass spectrometry ; β-hydroxybutyrate ; Dairy ketosis

s：HAN Yi-chao ; WANG Jun-dong

2016-04-06

“十二五”農村領域國家科技計劃課題(2012BAD12B06-2)；山西省農業科學院畜牧獸醫研究所課題(xms201502)

韓一超，E-mail:hyc7092502@126.com；王俊東，E-mail：wangjd53@outlook.com

S854.4

A

0529-6005(2017)05-0101-03