山羊源偽中間葡萄球菌的分離鑒定及耐藥性檢測

李雪嵩 ， 董文龍 ， 王 羽 ， 張紅偉 ， 張喜慶 ， 馬紅霞 ， 高云航

(吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院 ， 吉林長春130118)

山羊源偽中間葡萄球菌的分離鑒定及耐藥性檢測

李雪嵩 ， 董文龍 ， 王 羽 ， 張紅偉 ， 張喜慶 ， 馬紅霞 ， 高云航

(吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院 ， 吉林長春130118)

偽中間葡萄球菌是一種常見的致病菌，多引起寵物不同程度感染。2016年3月初，吉林省某羊場育肥羊出現(xiàn)零星死亡，病羊主要表現(xiàn)為呼吸系統(tǒng)癥狀。采集病羊呼吸系統(tǒng)各器官，以進行細菌的分離、培養(yǎng)。分離菌株經(jīng)培養(yǎng)特性、染色鏡檢、生化試驗及16S rDNA序列分析，確定為偽中間葡萄球菌，其對小鼠有致病性。對分離到的菌株通過微量稀釋法進行藥物敏感性測定，結果顯示，對慶大霉素、鏈霉素、紅霉素、阿莫西林、頭孢氨芐、磺胺間甲氧嘧啶、恩諾沙星、強力霉素耐藥；對阿米卡星、氟苯尼考、環(huán)丙沙星敏感。

山羊 ； 偽中間葡萄球菌 ； 分離鑒定 ； MIC

Correspouding author:GAO Yun-hang

偽中間葡萄球菌(Staphylococcuspseudintermedius，SP.)是2005年由Devriese等[1]發(fā)現(xiàn)并命名的，它是一種新的凝固酶陽性葡萄球菌，可引起寵物犬、貓等多種感染性疾病，如犬膿皮病、傷口感染、外耳道炎以及尿道感染等[2]。2016年3月初，吉林省某山羊場育肥羊發(fā)生以呼吸道癥狀為主的疾病，病羊出現(xiàn)零星死亡。作者從病死羊內臟分離得到1株細菌，通過鑒定，確定為偽中間葡萄球菌。本研究對分離出的偽中間葡萄球菌進行了藥敏試驗，以期對由該菌引起的疾病在臨床治療和用藥方面起到一定的指導作用。

1 材料與方法

1.1 病料來源 吉林省某養(yǎng)殖場發(fā)病山羊，剖檢取病變呼吸系統(tǒng)各器官，進行病原微生物分離培養(yǎng)。

1.2 培養(yǎng)基及試劑 TSA固體培養(yǎng)基、胎牛血清、TSB液體培養(yǎng)。DNA Marker DL-2 000、10×Buffer、d NTP Mixtur、ExTaqDNA聚合酶、pMD18-T vector、96孔細胞培養(yǎng)板、切膠回收試劑盒，購自寶生物工程(大連)服務有限公司。磺胺間甲氧嘧啶、頭孢氨芐、阿奇霉素、恩諾沙星、力霉素、阿米卡星、慶大霉素、鏈霉素、紅霉素、氟苯尼考、阿莫西林、環(huán)丙沙星等12種抗菌藥物，均購自北京海洋醫(yī)藥化工生物科技有限公司。

1.3 實驗動物 16只健康體重30 g昆明系小鼠，購自吉林大學實驗動物中心。

1.4 細菌的分離培養(yǎng) 在超凈工作臺里無菌分離病原菌，分別接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和TSA固體培養(yǎng)基(含5%胎牛血清)上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察細菌生長狀態(tài)及菌落形態(tài)。

1.5 涂片鏡檢 用接種環(huán)挑取上述培養(yǎng)得到的單個菌落進行革蘭染色，隨后鏡檢。

1.6 生化鑒定 取上述的24 h純培養(yǎng)物分別接種到PYR、V-P、甘露醇、精氨酸、木糖、棉子糖、七葉苷、麥芽糖、蕈糖、乳糖、蔗糖、甘露糖、山梨醇培養(yǎng)基內，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察結果并記錄。試驗結果參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》進行對比。

1.7 動物致病性試驗 挑取純培養(yǎng)物的單個菌落，接種于TSB液體培養(yǎng)基(含5%胎牛血清)，37 ℃搖菌18～24 h。所得菌液分別接種8只健康實驗小鼠，腹腔注射菌懸浮液0.2 mL/只。選用8只健康小鼠腹腔注射0.2 mL TSB液體培養(yǎng)基，作為陰性對照。觀察死亡情況，剖檢死亡小鼠，觀察病變，采集病料并進行細菌分離培養(yǎng)。

1.8 分離菌株16S rDNA基因序列測定 取1.6 mL培養(yǎng)菌液12 000 r/min離心10 min，收集菌體，按照Ezup柱式細菌基因組DNA提取試劑盒(購自上海生工生物工程技術服務有限公司)提取DNA，提取到的基因組作為16S rDNA基因PCR擴增模板。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫查詢，用Primer6.0設計16S rDNA引物，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

上游引物：5′-ATCCGCTATTTACCCAGTGG-3′；下游引物：5′-GCTGTAAACGAACTCGCCAC-3′。反應體系：DNA模板0.5 μL，10×Buffer 3.0 μL，dNTP 2.0 μL，Ex Taq 0.2 μL，上游引物 1 μL，取2.5 μL PCR擴增產(chǎn)物與0.4 μL 6×Loading Buffer(購自上海生工生物工程技術服務有限公司)混合后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。隨后將得到的PCR產(chǎn)物切膠回收，連接，轉化，提取質粒，將純化質粒直接送往上海生工生物工程技術服務有限公司進行核苷酸序列測定。

1.9 構建系統(tǒng)進化樹 將16S rDNA測序結果與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知的相關核酸序列進行Blast分析比對，并采用MEGA 5.05軟件構建系統(tǒng)進化樹。

1.10 藥敏試驗 選用獸醫(yī)臨床上較為常見的12種抗菌藥物，分別為強力霉素、阿米卡星、慶大霉素、鏈霉素、紅霉素、氟苯尼考、阿莫西林、環(huán)丙沙星、磺胺間甲氧嘧啶、頭孢氨芐、阿奇霉素和恩諾沙星。采用微量稀釋法進行最小抑菌濃度(MIC值)的測定。結果參照美國臨床和實驗室標準協(xié)會[3]的標準，判定其耐藥情況。

2 結果

2.1 細菌的分離培養(yǎng) 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上生長緩慢。在TSA固體培養(yǎng)基(含5%胎牛血清)生長出淡灰色、圓形、光滑、隆起、邊緣整齊的菌落(見中插彩版圖1)。

2.2 涂片鏡檢 在油鏡下觀察為革蘭陽性，球菌，單個或呈串狀排列(見中插彩版圖2)。

2.3 生化鑒定 生化試驗結果表明， V-P、精氨酸、木糖、棉子糖、七葉苷、山梨醇為陰性反應，而PYR、麥芽糖、蕈糖、乳糖、蔗糖、甘露糖、甘露醇為陽性反應，此結果符合偽中間葡萄球菌的生化特性。

2.4 動物致病性試驗 對照組死亡率為0%，試驗組的死亡率為75%。剖檢死亡的小鼠并采集肺臟，進行細菌分離培養(yǎng)和生化試驗，能夠得到與原分離菌株一致的病原菌。

2.5 16S rDNA基因擴增結果 以提取到的DNA為模版，利用16S rDNA通用引物進行PCR擴增，結果如圖3所示，得到的條帶大小約為1 500 bp，與預期大小相符，證明擴增成功。

圖3 16S rDNA擴增結果

M：DNA分子質量標準； 1：SP. 16S rDNA 的PCR 產(chǎn)物； P：表示對照菌株； N：表示陰性對照菌株

2.6 系統(tǒng)進化樹構建 擴增產(chǎn)物的核苷酸序列大小為1 512 bp，測序結果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行Blast分析比對并與葡萄菌屬的其他種建立進化樹(圖4)，結果顯示，該分離菌株與偽中間葡萄球菌(登錄號CP002439.2)同在一個分支，表明該分離菌株為偽中間葡萄球菌。

圖4 SP.株與相關菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.7 藥敏試驗結果 各種藥物的濃度測試范圍并分析MIC結果，根據(jù)美國臨床和實驗室標準協(xié)會的標準，得出以下結果：如表1所示，本試驗分離的偽中間葡萄球菌對慶大霉素、鏈霉素、紅霉素、阿莫西林、頭孢氨芐、磺胺間甲氧嘧啶、恩諾沙星、強力霉素耐藥；對阿奇霉素處于中介；對阿米卡星、氟苯尼考、環(huán)丙沙星敏感。

表1 藥敏試驗判定結果與判定標準

3 討論

本試驗結果表明，該羊場育肥羊發(fā)病的主要原因是感染了偽中間葡萄球菌，從而引起了系列呼吸系統(tǒng)癥狀。通過臨床診斷、流行病學調查和實驗室診斷，排除了病毒感染和寄生蟲感染所導致死亡的可能。通過16S rDNA基因分析以及生化特性可以將分離菌株鑒定為偽中間葡萄球菌。偽中間葡萄球菌作為一類重要的動物性細菌病的病原菌，在國內外已發(fā)表的文獻中，未見從山羊體內分離得到過的報道，本研究首次從羊體內分離得到偽中間葡萄球菌，表明在這種跨物種傳播趨勢愈演愈烈的情況下，獸醫(yī)臨床不可忽視病原微生物的跨物種傳播及變異將對養(yǎng)殖業(yè)帶來的潛在威脅[4]。

藥敏試驗結果表明，該分離菌對阿莫西林和頭孢氨芐表現(xiàn)為耐藥，而阿莫西林和頭孢氨芐皆屬于β-內酰胺類抗生素，抗菌譜與青霉素相同[5]，對革蘭陽性球菌和桿菌作用強，所以認為該養(yǎng)殖場在平時飼養(yǎng)中對羊常用青霉素類抗生素，從而使分離菌株對阿莫西林和頭孢氨芐耐藥。對阿米卡星、氟苯尼考、環(huán)丙沙星敏感，可選擇敏感藥物進行治療。對偽中間葡萄球菌治療較困難，其原因是對抗生素的耐藥范圍逐漸增大。Microbiol等人在2012年發(fā)表了相關研究，表明偽中間葡萄球菌對9種抗生素耐藥，這9種藥多為氨基糖苷類[6]，這也與本文所得結果相近。當然通過藥敏試驗所選擇的敏感類藥物在臨床應用中也未必取得較好療效，因為具體治療過程中存在太多的不確定性，要采取科學合理的治療手段才能取得好的療效[7]。

對于本病的治療，最重要的就是改善飼養(yǎng)管理，嚴格實行獸醫(yī)衛(wèi)生監(jiān)督體系，提高動物體的抵抗力能有效的預防本病傳染，加強圈舍環(huán)境衛(wèi)生，提高飼養(yǎng)員防控意識，完善肉羊繁殖過程中的飼養(yǎng)程序，以獲取更高的總經(jīng)濟價值。

[1] Devriese L A, Vancanneyt M, Baele M,etal.Staphylococcuspseudintermediussp. nov., a coagulase-positive specieces from animals[J]. Int J Syst Evol Microbiol, 2005, 55: 1569-1573.

[2] 韓濤, 張曉, 吳欣,等. 貂感染偽中間葡萄球菌的診斷及藥敏試驗[J]. 經(jīng)濟動物學報, 2014, 18(1):11-14.

[3] 廖延雄. 《伯杰氏鑒定細菌學手冊》與《伯杰氏分類細菌學手冊》[J]. 微生物學通報, 1992(4)：59.

[4] 董文龍, 王琦, 王巍,等. 山羊源犢牛摩拉菌的分離與鑒定[J]. 中國獸醫(yī)科學, 2016，46(2):198-202.

[5] Sandhu T S. Fecal streptococcal infection of com-merical white pekin ducklings [J]. Acain Dis, 1988, 32: 570-573.

[6] Casagrande Proietti P , Bietta A, Coletti M,etal. Insertion sequence IS256 in canine pyoderma isolates of Staphylococcus pseudintermedius associated with antibiotic resestance [J]. Vet Microbiol, 2012, 157: 376-382.

[7] 裴志花, 孫小寧, 王開. 1株羊肺源金黃色葡萄球菌的分離鑒定及耐藥性分析[J]. 中國畜牧獸醫(yī), 2014, 41(6): 220-223.

Isolation,Identification and Drug Resistance ofStaphylococcus

pseudintermediusIsolated from Goat

(Animal Science and Technology College, Jilin Agriculture University, Jilin 130118, China)

Staphylococcuspseudintermediusis a common pathogenic bacterium which causes different extent infection in pets. At the beginning of March in 2016, a small number of goat deaths appeared in Jilin province, and the respiratory symptom was the main symptom of the diseased goat. Each organs of the respiratory system were collected from diseased goats for bacterial isolation and cultivation. According to the analysis of the isolated bacteria by characteristics, staining microscopy, biochemical experiment, and 16S rDNA sequence, the bacteria was identified to beStaphylococcuspseudintermediusand was highly pathogenic to mice. Drug sensitivity was performed with the isolated strains through the micro-dilution method. The isolated strains were tested with the method of micro-dilution to identify their sensitivity to medicine, and the results showed that they Were to Cerant to gentamicin, streptomycin, erythromycin, amoxicillin, sulfamonomethoxine, enrofloxacin and doxycyclin and sensitive to amikacin, florfenicol, ciprofloxacin and chloramphenicol.

Goat ;Staphylococcuspseudintermedius; Isolation and identification ; MIC

2016-11-10

吉林省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項(2015-24);吉林省動物疾病防治研究創(chuàng)新團隊(20111820); 國家科技支撐計劃項目(2014BAK19B005)

李雪嵩(1994-)，男(蒙古族)，碩士生，主要從事動物疫病防治工作，E-mail：372238174@qq.com

高云航，E-mail：gaoyunhang@163.com

S858.27

A

0529-6005(2017)05-0098-03