AGT在高血壓合并心肌肥厚大鼠體內表達的研究

袁麗粉杜 勤王玉強王 健*

AGT在高血壓合并心肌肥厚大鼠體內表達的研究

袁麗粉①杜 勤②王玉強②王 健①*

目的：探討自發性高血壓大鼠(SHR)心肌肥厚與血管緊張素原(AGT)的相關性。方法：選用20只18周齡的雄性SHR，為SHR組；選用20只同齡WKY雄性高血壓模型對照大鼠，為WKY組，均飼以標準飼料。對兩組大鼠分別于0周和12周時采用無創尾套法測量尾動脈收縮壓(SBP)和心率，采用酶聯免疫吸附測定(ELISA)法檢測血清AGT、AngⅡ濃度，并于光鏡、電鏡下評估心肌組織超微結構病變。結果：經ELISA法血清檢測，SHR組大鼠血清AGT、AngⅡ水平在0周和12周的時間點均顯著高于WKY組大鼠，兩組比較差異有統計學意義(tAGT=27.94、t=27.29，tAngII=16.20、t=31.33；P＜0.05)。存在心肌病變的SHR組大鼠，12周時血清AGT、AngⅡ濃度水平明顯高于0周時的濃度水平，2個時間點AGT、AngⅡ濃度水平比較，其差異有統計學意義(t=15.17，t=13.77；P＜0.05)，且隨著心肌肥厚病變嚴重性的增加，血清AGT、AngⅡ濃度亦增加。結論：AGT與自發性高血壓大鼠中心肌病變有一定的相關性，抑制AGT的表達很有可能會為高血壓患者中心肌肥厚的防治提供一種新方法。

自發性高血壓大鼠；高血壓；心肌肥厚；血管緊張素原

高血壓引起的心血管疾病是中老年患者重要的死亡原因之一。流行病學調查顯示，在我國中老年患者中高血壓的患病率約為25%，其中近半數高血壓患者合并有心肌肥厚[1]。高血壓是心肌肥厚發生發展的一個重要危險因素[2]。腎素-血管緊張素系統(reninangiotensin system，RAS)在高血壓以及心肌肥厚的發生發展過程中起著重要的作用[3-4]。而血管緊張素原(angiotensinogen，AGT)，作為RAS系統中的初始底物，直接控制著RAS系統活性的強弱[5]。為探索AGT在高血壓合并心肌肥厚大鼠中的表達情況，進行自發性高血壓大鼠心肌肥厚與AGT的相關性研究。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

(1)Nikon生物光學顯微鏡(日本Nikon公司)；CMl20透射電鏡(荷蘭飛利浦公司)；Powerlab/8SP生理信號采集與處理系統(澳大利亞AD Instruments，Castle Hill，NSM，Australia)；Chart多通道生理信號記錄儀系統軟件，全自動生化分析儀(美國DADE公司Dimension RXL)。

(2)5%戊巴比妥鈉(中國醫藥集團上海化學試劑公司)；大鼠AGT ELISA試劑盒(美國R&D公司)；大鼠血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)ELISA試劑盒(美國R&D公司)。

1.2 實驗動物

選用20只雄性自發性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)為SHR組；選用20只Wistar京都大鼠(Wistar Kyoto rats，WKY)為WKY組，均為18周齡，大鼠體重均為395～450 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。40只大鼠均分籠飼養(每籠3只)，自由飲用食物和水，12 h晝夜周期喂養。所有大鼠經標準飼料適應性喂養2周，分別于2周后的0周、12周時各組取10只處死。

1.3 血壓測量

將清醒狀態的大鼠置于PowerLab系統配備的大鼠固定器內，露出鼠尾，于40 ℃恒溫水浸泡30 min，待鼠尾動脈充分擴張，將鼠尾套入套袖，待動物安靜后充氣，測量尾動脈收縮壓和心率，重復3次，取平均值。每周測量1次。

1.4 測量全心重量與體重比值

測量全心重量與體重比值(heart weight/body weight，HW/BW)于實驗結束時，稱取大鼠體重，按0.4 ml/l00g的劑量腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠，迅速取出心臟，稱取全心重量，求HW/BW值(即心肌肥厚指數)。

1.5 標本采集和處理

各組動物分別于喂養2周后的0周、12周時空腹股靜脈采血，置于抗凝管中，搖勻，于3 000 r/min離心15 min，收集上層血清，通過酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測血清AGT、AngⅡ水平。

1.6 觀察心肌組織超微結構

大鼠處死后無菌分離心肌，將經10%甲醛固定的心肌標本，常規脫水，石蠟包埋，間斷均勻切片，切片厚度為5 μm，行蘇木素-伊紅(hematoxylineosin，HE)染色，切片做好后光鏡下觀察。取1 mm3心尖區心肌組織數粒于4 ℃、2%的戊二醛固定液中固定24 h，電鏡下觀察組織超微結構。

1.7 統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析。數據以均值±標準差(x-±s)表示，呈正態分布，兩組比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

兩組大鼠在2周的適應性喂養期間均生長情況良好。兩組大鼠至實驗結束均無不良反應。

2.1 血壓和心肌肥厚指數HW/BW值

(1)對兩組大鼠于0周和12周時測量血壓，SHR組大鼠血壓值明顯高于WKY組，其差異有統計學意義(t=31.99，t=35.01；P＜0.05)；SHR組大鼠12周時血壓值明顯高于0周，其差異有統計學意義(t=19.48，P＜0.05)，見表1。

表1 兩組大鼠血壓變化情況，mmHg)

表1 兩組大鼠血壓變化情況，mmHg)

組別只數0周12周t值P值WKY組20126.00±1.67128.00±5.10--SHR組20175.33±3.39207.67±2.2519.48＜0.05 t值31.9935.01 P值＜0.05＜0.05

(2)大鼠的心肌HW/BW值測量，SHR組大鼠與WKY組大鼠于0周時心肌重量分別為(3.16±0.11)mg/g和(2.53±0.06)mg/g；12周時分別為(3.96±0.13) mg/g和(2.55±0.03)mg/g，HW/BW值明顯高于WKY組，兩組比較其差異有統計學意義(t=12.25，t=26.15；P＜0.05)；而SHR組大鼠HW/BW值12周時明顯高于0周時的HW/BW值，其差異有統計學意義(t=11.66，P＜0.05)，提示SHR組大鼠有明顯的心肌肥厚現象，且隨著周齡的增加，心肌肥厚加重。兩組大鼠之間心率變化無差異。

2.2 血清AGT和AngⅡ水平

經ELISA法血清檢測，SHR組大鼠血清AGT、AngⅡ水平在0周和12周的時間點均顯著高于WKY組大鼠，兩組比較差異有統計學意義(tAGT=27.94、t=27.29，tAngII=16.20、t=31.33；P＜0.05)。SHR組大鼠12周時血清AGT、AngII水平較0周時顯著升高，2個時間點比較差異有統計學意義(t=15.17，t=13.77；P＜0.05)，見表2。

表2 兩組大鼠不同時間點血清AGT和AngII水平變化(x-±s，pmol/L)

2.3 心肌組織超微結構改變

2.3.1 光鏡結果

經HE染色光鏡下顯示，SHR組較WKY組心肌細胞明顯肥大，肌纖維排列紊亂，部分有溶解。隨著時間的變化，SHR組大鼠12周時心肌細胞肥大較0周時明顯，且肌纖維排列越加紊亂，溶解較多。而WKY組大鼠，心肌組織結構從0周至12周未發生明顯改變(如圖1所示)。

圖1 兩組大鼠各個時間點光鏡心肌組織結構(HE染色，×200)

2.3.2 電鏡結果

電鏡下顯示，WKY組大鼠心肌細胞核膜完整，橫紋清楚，線粒體清晰，肌原纖維清晰，排列整齊，間質膠原纖維無增生。SHR組心肌細胞核膜不完整，線粒體腫脹堆積，內有空泡形成，內質網增生，肌原纖維模糊，排列紊亂，肌絲有部分消失，可見橫紋不清，間質膠原纖維增生。隨著時間的變化，SHR組大鼠心肌細胞核膜不完整越加明顯，內質網大量增生，線粒體空泡形成明顯，間質膠原纖維明顯增生。而WKY組從0周到12周未見明顯變化(如圖2所示)。

圖2 兩組大鼠各個時間點心肌組織電鏡結果(×9700 )

3 討論

高血壓是多種心、腦血管疾病的重要病因和危險因素，影響重要臟器例如心臟的結構和功能，最終導致心肌肥厚、心力衰竭，近半數高血壓患者伴有心肌肥厚[6]。高血壓、心肌肥厚被稱為人類健康的“無形殺手”，是全球范圍內的重大公共衛生問題。隨著人民生活水平的提高和人口老齡化的加速，高血壓、心肌肥厚的發病率呈上升趨勢。研究顯示，高血壓是促進心肌肥厚發生、發展的重要因子，而心肌肥厚又可引起繼發性高血壓[7]。二者之間互相影響，互相促進，形影不離。因此，如何預防高血壓患者中心肌肥厚的發生已成為當今心血管病研究的重要課題。

SHR大鼠是一種高血壓模型鼠，與人類原發性高血壓的病態表現極為相似，平均壽命雄性為430 d，雌性為550 d，其高血壓發病率極高，8～10周齡幾乎全部動物血壓都在150 mmHg以上，16～20周齡達最高峰180～210 mmHg，并且與人類高血壓病的發病機制及所致病理生理學方面的變化十分相似，是進行人類原發性高血壓病研究理想動物模型[8]。本實驗選擇18周齡的SHR，其結果顯示，SHR組尾動脈壓顯著高于正常血壓對照組，證實了模型的成功建立。

AGT作為RAS中的初始底物，直接控制著RAS活性的強弱，主要在肝臟合成，血漿中的AGT主要來源于肝臟[9]。此外，脂肪組織、大動脈、腎臟、腎上腺及腦等也合成AGT[10]。AGT作為血管緊張素前體，是腎素的唯一作用底物。在血循環中，AGT在腎臟球旁細胞分泌的腎素作用下水解生成無活性的十肽Ang I，后者在肺等器官內皮細胞血管緊張素轉換酶(angiotensin converting enzymes，ACE)作用下，從AngIC端切除兩個氨基酸生成有生物活性的八肽血管緊張素Ⅱ。AngⅡ是RAS的主要效應物質，作用于血管緊張素Ⅱ受體(angiotensin Ⅱ receptor type 1，AT1)，使得小動脈平滑肌收縮，刺激腎上腺皮質球狀帶分泌醛固酮，通過交感神經末梢突觸前膜的正反饋使去甲腎上素分泌增加。這些作用均可使血壓升高，參與高血壓發病并維持[11-13]。AGT是這一最強血管活性物質AngⅡ的唯一前體，外周血循環及局部組織中AGT微小濃度變化即可引起AngⅡ產生量的明顯變化[14]。因此，血中AGT的濃度從根本上影響著AngⅡ的生成。本研究結果證實，SHR組大鼠AGT、AngⅡ濃度明顯高于WKY組，而且隨著時間的變化，SHR血AGT、AngⅡ濃度亦明顯升高。

血壓長期升高可逐漸加重左心室負荷，心室因代償而逐漸肥厚、擴張和功能不全而形成的器質性心臟病[15]。高血壓性心肌肥厚是最常見的病理改變，可見心肌細胞肥大，間質纖維化，同時出現一系列亞細胞形態和結構的改變，具體表現在肌膜的皺褶變多，細胞表面有許多指狀突起，常呈現活躍的吞飲現象，線粒體增多腫脹，后期線粒體也可發生空泡樣變性，肌漿網常有增生及擴張。在明顯肥大和變性的心肌細胞中，肌原纖維可見某種程度的排列紊亂或出現異常分支，隨著心肌細胞變性程度的增加，肌原纖維逐漸減少以至部分消失，在肌絲溶解部位可見增生的線粒體、肌漿網等。SHR在出生后10周齡左右開始出現左心室肥厚，隨年齡增加而進行性加重。由于本研究SHR組采用的是20周齡的大鼠，因此電鏡或光鏡下均觀察到了SHR組有很明顯的心肌肥大，肌原纖維模糊，排列紊亂，肌絲有部分消失，可見橫紋不清，線粒體腫脹堆積，內有空泡形成，內質網大量增生，間質膠原纖維增生，而且隨著年齡的增加呈現進行性加重，而WKY組未見上述變化。本研究結果顯示，隨著時間的變化，SHR組血AGT、AngⅡ濃度明顯升高，心肌肥厚程度亦明顯加重，而WKY組血AGT、AngⅡ濃度未見明顯變化，也未見明顯心肌肥厚。

高血壓性心肌肥厚是由于血壓長期升高導致心臟后負荷過重所誘發的心臟損害，本研究結果間接證明通過抑制AGT的表達，可減少血清AngⅡ水平，進而降低血壓，從而降低心臟后負荷，減輕甚至逆轉心肌肥厚的發生發展，為臨床對高血壓患者心肌肥厚的發生提供一種新的防治策略。

[1]吳錫桂，武陽豐，周北凡，等.我國十組人群高血壓發病率及其影響因素[J].中華醫學雜志，1996，76(1)：24-29.

[2]Ostroumova OD，Kochetkov AI.Effects of Amlodipine/Lisinopril Fixed-Dose Combination on Severity of Left Ventricular Hypertrophy and Parameters of Myocardial Stiffness in Patients With Hypertension[J].Kardiologiia，2016，56(11)：27-37.

[3]Ferrario CM，Strawn WB.Role of the renninangiotensin-aldosterone system and proinflammatory mediators in cardiovascular disease[J]. Am J Cardiol，2006，98(1)：121-128.

[4]Xu P，Wang Y，Sterner-Kock A，et al.Excessive hypertension and end-organ damage in a transgenic mouse line carrying the rat angiotensinogen gene[J].J Cardiovasc Pharmacol，2009，53(1)：38-43.

[5]Lu H，Cassis LA，Kooi CW，et al.Structure and functions of angiotensinogen[J].Hypertens Res，2016，39(7)：492-500.

[6]He J，Bian Y，Gao F，et al.RNA interference targeting the ACE gene reduced blood pressure and improved myocardial remodelling in SHRs[J].Clinical Science，2009，116：249-255.

[7]Nadruz W.Myocardial remodeling in hypertension[J].J Hum Hypertens，2015，29(1)：1.

[8]方喜業.醫學實驗動物學[M].北京：人民衛生出版社，1995：121.

[9]Ortiz-Melo DI，Spurney RF.Special delivery：podocyte injury promotes renal angiotensin II generation from liver-derived angiotensinogen[J]. Kidney Int，2014，5(5)：1009-1011.

[10]Kim S，Soltani-Bejnood M，Quignard-Boulange A，et al.The adipose renin-angiotensin system modulates systemic markers of insulin sensitivity and activates the intrarenal renin-angiotensin system[J].J Biomed Biotechnol，2006(5)：1-6.

[11]Meng W，Zhao W，Zhao T，et al.Autocrine and paracrine function of Angiotensin 1-7 in tissue repair during hypertension[J].Am J Hypertens，2014，27(6)：775-782.

[12]Wu J，You J，Wang S，et al.Insights into the activation and inhibition of angiotensin II type 1 receptor in the mechanically loaded heart[J]. Circ J，2014，78(6)：1283-1289.

[13]Wang X，Ye Y，Gong H，et al.The effects of different angiotensin II type 1 receptor blockers on the regulation of the ACE-AngII-AT1 and ACE2-Ang(1-7)-Mas axes in pressure overload-induced cardiac remodeling in male mice[J].J Mol Cell Cardiol，2016，97：180-190.

[14]Huo ZJ，Li D，Guo J，et al.Effect of electroacupuncture stimulation on expression of angiote-nsinogen，angiotensin II type 1 receptor，endothelin-1，and endothelin a receptor mRNA in spontaneously hypertensive rat aorta[J].Chin J Integr Med，2016，22(10)：778-782.

[15]Díez J.Arterial hypertension in patients with heart failure[J].Heart Fail Clin，2014，10(2)：233-242.

The study of expression of AGT in hypertensive rats model combined with myocardial hypertrophy/

YUAN Li-fen, DU Qin, WANG Yu-qiang, et al//China Medical Equipment,2017, 14(6):161-164.

Objective: To discuss the correlation between myocardial hypertrophy and angiotensinogen (AGT) in spontaneously hypertensive rats (SHR). Methods: The 20 healthy 18-week-old male SHRs were divided in SHR group and 20 age-matched male Wistar Kyoto rats (WKYs) were divided in WKY group. Both of them were fed with standard diet. The systolic blood pressure (SBP) and heart rate were detected by using noninvasive tail-cuff method in the 0 week and 12th week, respectively. The serum AGT and serum Ang II were detected by ELISA. And the lesion of ultra structure about cardiac muscle tissue were evaluated under light microscope and electron microscope. Results: The results of ELISA indicated that the serum AGT and serum Ang II of SHR group were significantly higher than that of WKY group at 0 week and 12th week (tAGT=27.94, t=27.29, tAngII=16.20, t=31.33; P＜0.05), respectively. The concentrations of serum AGT and serum AngII of rats with myocardial lesions of SHR group at 12th week were statistically significantly higher than that of SHR group at 0 week (t=15.17, t=13.77, P＜0.05), respectively. And the concentrations of serum AGT and serum Ang II increased with the increase of the seriousness of myocardial lesions. Conclusion: There might be a certain correlation between AGT and myocardial hypertrophy in spontaneously hypertensive rats. To inhibit the expression of AGT might likely provide a new method for the prevention and cure of patients with hypertension combined with myocardial hypertrophy.

Spontaneously hypertensive rats; Hypertension; Myocardial hypertrophy; Angiotensinogen

Department of Respiratory Medicine, Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200011, China.

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2017.06.044

1672-8270(2017)06-0161-04

R-332

A

袁麗粉,女,(1985- ),碩士，醫師。上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院呼吸內科，研究方向：呼吸內科。

2017-01-20

①上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院呼吸內科 上海 200011

②上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院老年病科 上海 200011

*通訊作者：wangjian0628@163.com