截斷逆挽方對慢加急性肝衰竭大鼠死亡受體途徑的影響

穆凌云 李金霞 張秋云 陳煜 高連印 杜宇瓊

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截斷逆挽方對慢加急性肝衰竭大鼠死亡受體途徑的影響

穆凌云 李金霞 張秋云 陳煜 高連印 杜宇瓊

目的 觀察“截斷逆挽方”對慢加急性肝衰竭大鼠JNK信號通路死亡受體途徑的影響。方法 SPF級Wistar雄性大鼠70只，隨機分為正常組、模型組、截斷逆挽方組和SP600125組，各組大鼠給予豬血清腹腔注射13周，聯(lián)合D氨基半乳糖/脂多糖(D-galactosamine/lipopolysaccharide,D-GalN/LPS)急性攻擊，構(gòu)建慢加急性肝衰竭大鼠模型，截斷逆挽方組在急性攻擊前給予截斷逆挽方連續(xù)灌胃3天，SP600125組于急性攻擊前半小時腹腔注射。各組大鼠均在急性攻擊后4、8、12小時平行取材。用免疫組化法(Immunohistochemical detection,IHC)檢測肝組織中半胱氨酸蛋白酶-8(Cysteine Proteinase-8,Caspase-8)、Caspase-3、脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase ,Fas)的表達量，用蛋白印跡法(Western Blot,WB)檢測肝組織中Fas配體(Fas ligand,FasL)的表達量。結(jié)果 與正常組相比，模型組各時間點Caspase-3、Caspase-8、Fas、FasL表達增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，截斷逆挽方組及SP600125組在4小時和8小時表達減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)，12小時較模型組升高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 截斷逆挽方可以有效降低Caspase-3、Caspase-8、Fas、FasL的表達量，阻斷死亡受體途徑，減少模型大鼠肝細胞凋亡。

慢加急性肝衰竭； 截斷逆挽方； 細胞凋亡； 死亡受體途徑

慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure，ACLF)是在慢性肝病的基礎(chǔ)上，較短時間內(nèi)發(fā)生急性或亞急性肝功能失代償?shù)呐R床癥候群[1]。細胞凋亡又稱程序性細胞死亡，是維持生物體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和保證機體正常發(fā)育的主動死亡進程[2]，過度細胞凋亡可以導(dǎo)致肝組織細胞大量死亡，并破壞其生理結(jié)構(gòu)及功能。作為參與細胞凋亡的重要信號傳導(dǎo)途徑之一，死亡受體途徑的傳導(dǎo)機制是細胞表面的死亡受體接受胞外信號，經(jīng)由胞質(zhì)內(nèi)的死亡結(jié)構(gòu)域(death domain，DD)進一步傳遞，介導(dǎo)細胞凋亡。本研究通過觀察截斷逆挽方對ACLF模型大鼠肝組織半胱氨酸蛋白酶-8(Cysteine proteinase-8，Caspase-8)、Caspase3、脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase,Fas)及Fas配體(Fas ligard,FasL)表達的影響，探討該方對肝細胞凋亡的部分作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Wistar雄性大鼠70只，SPF級，體質(zhì)量(180～200) g，購于中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，首都醫(yī)科大學(xué)動物房SPF級飼養(yǎng)，每籠三只，不控制水食，室溫18～23℃，濕度為(50.0±2.0)%，每隔12小時開燈照明。

1.2 主要試劑

豬血清(北京平睿生物有限公司，批號：20140713)；D-GalN(Inalco，批號：P29/14/221)；LPS(Sigma，批號：109K4075)；小鼠超敏二步法試劑盒(中杉金橋，批號：PV-9005)，兔二步法檢測試劑盒(中杉金橋，批號：PV-9001)，DAB試劑盒(中杉金橋，批號：ZLI-9018)；Caspase-8 p18 antibody(Santa Cruz，批號：sc-5263)；Caspase-3(P12) antibody(普益華，批號：BA3968)；Anti-Fas antibody(Abcam,批號：ab82419)；Anti-Fas Ligand antibody(Abcam，批號：ab15285)；Beta-tubulin rabbit polyclonal antibody(Proteintech，批號：10094-1-AP)，Beta-actin rabbit polyclonal ntibody(CST，批號：4967S)；封閉用羊血清原液(中杉金橋，批號：ZLI-9021)；RegeRuler Prestained Protein Ladder(Fermentas，批號：26616)。

1.3 主要藥物

截斷逆挽方組成：苦味葉下珠30 g、瓜蔞30 g、金錢草30 g、生黃芪30 g、槲寄生30 g、三七6 g、莪術(shù)6 g、丹參20 g、生地黃20 g、黑附片15 g，藥材購自北京同仁堂藥店，濃煎，生藥量為4.34 g/mL，4℃保存?zhèn)溆茫褂们?7℃水浴加熱。

1.4 主要儀器

Eclipse 80i共聚焦熒光顯微鏡(Nikon)；Universal 320R低溫離心機(Hettich)；1-14高速離心機(Sigma)；F6/10超細勻漿器(Fluko)；Model680酶標儀(Bio-Rad)；165-8003垂直電泳儀(Bio-Rad)；電泳電源(Bio-rad，Powerpac universal power supply 164-5070)；170-3930濕轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)儀(Bio-Rad)；Odysseey2.1紅外熒光掃描成像系統(tǒng)(LI-COR)；EM-1400高襯度投射電子顯微鏡(JEOL)。

教育是未來的事業(yè)，兒童是民族的未來。教師要把一個不懂事的孩子培養(yǎng)成國家的棟梁，民族的脊梁，要付出畢生的精力。教師工作是平凡的，每天上課下課、備課、批改作業(yè)，為學(xué)生解惑排難；但教師的職業(yè)又是偉大的，教師要把兒童這個幼苗培育成參天大樹。古人說：“十年樹木，百年樹人。”說明創(chuàng)造物質(zhì)是比較容易的，塑造人、鑄造人的精神是要經(jīng)過幾代人的努力。因此，教師要滿懷對學(xué)生的真心關(guān)愛，以學(xué)生的發(fā)展為本，甘為人梯，樂于奉獻，用心靈和汗水一點一滴地滋潤學(xué)生的心田，把全部精力和滿腔熱情獻給教育事業(yè)。

1.5 方法

1.5.1 大鼠模型的建立ACLF大鼠模型建立方法 (1)免疫階段：Wistar雄性大鼠70只，隨機分為正常對照組6只和處理組64只，處理組腹腔注射豬血清每次一只、一周兩次注射0.5 mL，正常組大鼠注射等量生理鹽水，共13周，造模過程中無死亡。于13周末隨機抽取1只處理組大鼠處死，取肝組織做病理觀察，根據(jù)《肝纖維化中西醫(yī)結(jié)合診療指南》[3]判定免疫型肝纖維化造模是否成功。造模成功后，將處理組隨機分為模型組、截斷逆挽方組及SP600125組，各21只。(2)急性攻擊階段：模型組、截斷逆挽方組及SP600125組同時給予D-GalN 800 mg/kg聯(lián)合LPS 100 μg/kg腹腔注射造成急性攻擊，建立ACLF模型。

1.5.2 分組與給藥方法 急性攻擊前，截斷逆挽方組給予截斷逆挽方濃縮液21.7 g/(kg·d)連續(xù)灌胃三天，正常組及模型組給予同等劑量生理鹽水灌胃。各組大鼠分別于急性攻擊4小時、8小時、12小時進行平行取材，每組每個時間點7只。大鼠麻醉后腹主動脈取血，摘取肝右葉同一部分置于10%福爾馬林溶液固定，余下部分于液氮中快速凍存。

1.5.3 IHC法檢測肝組織中Caspase-3、Caspase-8、Fas蛋白的表達 10%福爾馬林固定肝組織后進行石蠟包埋、切片，常規(guī)脫蠟、水化，微波抗原修復(fù)，10%正常羊血清封閉1小時，Caspase-3多克隆抗體(1∶50)、Caspase-8多克隆抗體(1∶200)、Fas多克隆抗體(1∶50)4℃過夜孵育，PBS洗滌后滴加HRP標記二抗37℃孵育1小時，Caspase-3、Caspase-8、FasDAB分別顯色2分鐘、4分鐘、90秒，蘇木素復(fù)染。每組每個時間點觀察三張切片，隨機選取10個高倍視野進行拍攝，并運用NIKON NIS-Elements BR軟件進行陽性表達的標示及積分光密度值(IOD)檢測。

1.5.4 WB法檢測肝組織中FasL蛋白的表達 取出凍存肝組織樣品，在冰上操作，每組每個時間點取5支進行勻漿、蛋白定量，按照蛋白定量試劑盒說明書步驟測定蛋白濃度。每支上樣蛋白84 μg，經(jīng)10%SDS-聚丙烯凝膠電泳分離后300 mA電轉(zhuǎn)1小時至0.22 μm NC膜上，5%脫脂奶粉封閉1小時，F(xiàn)asL抗體(1∶500)4℃孵育過夜，TBST洗滌，加山羊抗兔二抗(1∶5000)室溫孵育1小時，紅外熒光掃描成像系統(tǒng)Oddsey掃膜。以β-actin作為參照蛋白，使用ImageJ2x軟件獲得目的蛋白條帶的灰度值，通過灰度比較的方法來確定目的蛋白相對于內(nèi)參的表達量，以分析樣本之間目的蛋白表達量差異。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

Caspase-3被染成棕褐色，在細胞質(zhì)表達。與正常組相比，模型組各時間點表達增多，4小時 Caspase-3表達明顯增多，隨著時間延長逐漸增多，8小時達到高峰，12小時較前減少，經(jīng)LSD檢驗差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，在4、8小時截斷逆挽方組及SP600125組Caspase-3蛋白表達明顯降低，經(jīng)LSD檢驗差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而12小時其表達經(jīng)LSD檢驗無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05); 同時Caspase-3蛋白表達減少，證明截斷逆挽方可以有效減慢細胞凋亡的進程，抑制蛋白表達，減少肝細胞凋亡，其作用機制與JNK抑制劑SP600125相似。詳見表1、圖1。

表1 各組大鼠Caspase-3表達IOD值比較

注： 與正常組比較，aP<0.05，與對應(yīng)時間點模型組比較，bP<0.05，cP<0.01；與同一處理組前一時間點比較，dP<0.01。

注：A.正常組；B.截斷逆挽方4小時組；C.模型4小時組； D.SP600125 4小時組；E.截斷逆挽方8小時組； F.模型8小時組；G.SP600125 8小時組；H.截斷逆挽方12小時組； I.模型12小時組；J.SP600125 12小時組

圖1 免疫組化法檢測大鼠肝組織Caspase-3蛋白表達(×200)

2.2 截斷逆挽方對 ACLF 大鼠肝組織Caspase-8蛋白表達的影響

Caspase-8被染成棕褐色，在細胞核表達。與正常組相比，模型組4小時Caspase-8表達明顯增多，隨著時間延長表達逐漸增多，至8小時達到高峰，12小時表達則較前減少，經(jīng)LSD檢驗具有統(tǒng)計學(xué)明顯差異(P<0.01)；與4、8小時模型組相比，截斷逆挽方組及SP600125組Caspase-8蛋白表達明顯降低，經(jīng)Tamhane’s T2檢驗差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，至12小時表達略高，整體趨勢隨著時間的推移而逐漸升高。提示截斷逆挽方可以抑制Caspase-8的表達，其作用同JNK抑制劑SP600125相似。詳見表2、圖2。

表2 各組大鼠Caspase-8表達IOD值比較

注：與同一時間點模型組比較，aP<0.01；與同一時間點正常組比較，bP<0.05、cP<0.01；與同一處理組上一時間點比較，dP<0.01。

注：A.正常組；B.截斷逆挽方4小時組；C.模型4小時組； D.SP600125 4小時組；E.截斷逆挽方8小時組； F.模型8小時組；G.SP600125 8小時組；H.截斷逆挽方12小時組；I.模型12小時組；J.SP60012512小時組

圖2 免疫組化法檢測大鼠肝組織Caspase-8蛋白表達(×200)

注：A.正常組；B.截斷逆挽方4小時組；C.模型4小時組；D.SP600125 4小時組；E.截斷逆挽方8小時組；F.模型8小時組； G.SP600125 8小時組；H.截斷逆挽方12小時組；I.模型12小時組；J.SP600125 12小時組

圖3 免疫組化法檢測大鼠肝組織Fas蛋白表達(×200)

2.3 截斷逆挽方對ACLF大鼠肝組織Fas蛋白表達的影響

Fas蛋白被染成棕褐色，在細胞核表達。與正常組相比，模型組4小時Fas表達明顯增多，且隨著時間的延長其表達逐漸增多，至8小時達到高峰，12小時表達則較前減少，經(jīng)LSD檢驗差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，在4、8小時截斷逆挽方組及SP600125組Fas蛋白表達明顯降低，經(jīng)LSD檢驗差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，而至12小時其表達則略高于模型組，其表達隨著時間的推移呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢。結(jié)果提示截斷逆挽方及SP600125可以有效抑制FasL蛋白的表達，減少肝細胞凋亡，與SP600125作用大致相似。詳見表3、圖3。

表3 各組大鼠Fas表達IOD值比較

注：與同一時間點模型組比較，aP<0.01；與同一時間點正常組比較，bP<0.05、cP<0.01；與同一處理組上一時間點比較，dP<0.05。

2.4 截斷逆挽方對ACLF大鼠肝組織FasL蛋白表達的影響

與正常組相比，模型組4小時FasL蛋白表達增多，至8小時達到高峰，12小時表達減少，經(jīng)LSD檢驗具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)；截斷逆挽方組4、8小時FasL蛋白表達較模型組少，而12小時表達較多，整體呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢。與模型組相比，SP600125組4小時(P<0.05)、8小時(P<0.01)FasL蛋白表達較少，經(jīng)LSD檢驗差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，而12小時(P>0.05)經(jīng)Tamhane’s T2檢驗差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，蛋白呈持續(xù)增高表達。結(jié)果提示截斷逆挽方可以有效抑制FasL蛋白的表達，減少肝細胞凋亡，作用機制與SP600125大致相似。

注：A.SP600125 12小時組； B.模型12小時組； C.截斷逆挽方12小時組；D.SP600125 8小時組；E.模型8小時組；F.截斷逆挽方8小時組；G.P600125 4小時組；H.模型4小時組； I.截斷逆挽方4小時組；J.正常組

圖4 Western Blot法檢測各組大鼠肝組織FasL蛋白表達情況

表4 各組大鼠FasL表達IOD值比較

注：與同一時間點模型組比較，aP<0.01；與同一時間點正常組比較，bP<0.05、cP<0.01；與同一處理組上一時間點比較,dP<0.01。

3 討論

ACLF可在短期內(nèi)出現(xiàn)較高死亡率，28天內(nèi)死亡率可高達15%[4]，臨床多采用內(nèi)科常規(guī)治療、人工肝及肝移植等措施，但治療效果均不理想。近些年來，中醫(yī)藥對ACLF的干預(yù)研究在臨床實踐和基礎(chǔ)研究方面均取得了很大進展，為中醫(yī)藥參與治療并不斷提高療效奠定了良好的基礎(chǔ)。JNK抑制劑SP600125可以對JNK信號通路產(chǎn)生特異性地抑制作用，目前已有相關(guān)動物實驗證實SP600125可以直接抑制c-Jun磷酸化并且在一定程度上干預(yù)治療動物疾病模型[5-6]。據(jù)此，有望為中醫(yī)藥臨床治療ACLF提供新的分子作用靶點。

筆者課題組前期實驗研究結(jié)果表明[7-9]：截斷逆挽方可改善肝細胞超微結(jié)構(gòu)損傷、降低ACLF大鼠死亡率；也可以降低血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、白細胞介素1β、白細胞介素6及肝組織腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和腫瘤壞死因子受體(TNFR1)的含量，即可通過阻斷TNF-α/TNFR1途徑減輕肝細胞凋亡。肝細胞凋亡主要通過兩種途徑介導(dǎo)：線粒體途徑和死亡受體途徑。且李金霞等[10]已證實截斷逆挽方可以減輕肝細胞超微結(jié)構(gòu)損傷程度以及抑制Bid、CytC蛋白的表達，與阻斷線粒體途徑有關(guān)。死亡受體途徑又稱外源性凋亡途徑，由胞外信號誘導(dǎo)細胞凋亡，凋亡介導(dǎo)的通路主要有三條[11]：Fas/FasL途徑、TNFR途徑、TRAIL途徑。死亡受體屬于TNFR超家族，已知存在于哺乳動物細胞表面的至少有8種：TNFR1、TNFR2、Fas、DR3、DR4、DR5、DcR1和DcR2[12]。Fas/FasL誘導(dǎo)細胞凋亡是細胞表面的Fas蛋白被激活后，啟動了Fas配體FasL的表達，F(xiàn)asL與Fas結(jié)合后，誘導(dǎo)Fas胞內(nèi)的死亡區(qū)形成三聚體并活化，然后募集胞漿內(nèi)Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白，形成并激活死亡信號復(fù)合物[13]，引起Caspase-8激活，啟動下游Caspase蛋白級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細胞凋亡。此外，Caspase-8還可以激活Bid、Bax等Bcl-2家族蛋白，促進Cytc釋放，通過線粒體途徑誘導(dǎo)細胞凋亡。吳文秀等[14]證實截斷逆挽方可以有效降低肝細胞Caspase-3、Caspase-8表達量，減輕肝細胞凋亡和壞死。

本實驗中，與正常組相比，模型組在4～8小時Fas、FasL、Caspase-3、Caspase-8表達均呈現(xiàn)逐漸升高趨勢，提示Fas與FasL結(jié)合，并激活下游Caspase-3、Caspase-8蛋白發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)，高峰出現(xiàn)在急性攻擊后8小時。12小時Fas、FasL、Caspase-3、Caspase-8表達均較8小時降低，但仍高于正常組，這可能與8～12小時肝細胞發(fā)生大量死亡有關(guān)，此時細胞凋亡活動減少。截斷逆挽方組及SP600125組在4小時、8小時時Fas、FasL、Caspase-3、Caspase-8表達量均較模型組減少，4～12小時呈現(xiàn)持續(xù)升高表達。以上結(jié)果表明截斷逆挽方及SP600125可以在4、8小時有效減少Fas、FasL、Caspase-3、Caspase-8的表達。但12小時模型組蛋白表達減少，而給藥組表達量卻持續(xù)增多，提示ACLF大鼠急性攻擊后可能出現(xiàn)肝細胞大量死亡，凋亡活動減少。

上述結(jié)果提示截斷逆挽方可以有效降低ACLF大鼠肝組織蛋白Fas、FasL、Caspase-3、Caspase-8的含量，抑制死亡受體信號途徑上關(guān)鍵蛋白表達，其作用機制與JNK抑制劑SP600125相似。

綜上分析，降低肝組織蛋白Fas、FasL、Caspase-3、Caspase-8表達，干預(yù)JNK信號通路相關(guān)死亡受體途徑從而減少肝細胞凋亡，可能是截斷逆挽方減輕ACLF模型大鼠肝細胞損傷的部分作用機制。

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(本文編輯： 王馨瑤)

Effect ofJieDuanNiWanprescription on death receptor pathway in acute-on-chronic liver failure rat model

MUlingyun,LIjinxia,ZHANGqiuyun,etal.

CapitalMedicalUniversitySchoolofTraditionalChineseMedicine&BeijingKeylaboratoryofTCMCollateralDiseaseTheoryResearch,Beijing100069,China

ZHANGqiuyun,E-mail:zhangqiuyun8202@aliyun.com

Objective To observe the effect ofJieduanNiwan(JDNW) on the death receptor pathway of JNK signaling pathways in acute-on-chronic liver failure (ACLF) rats, and study its mechanism. Methods 70 SPF male Wistar rats were randomly divided into normal group, model group,Jieduan-Niwanprescription group and JNK inhibitor SP600125 group. Except normal group, other groups were given intraperitoneal injection with porcine serum for 13 weeks combined with D-galactosamine / lipopolysaccharide (D-GalN/LPS) acute attack to induce the model of ACLF,JDNWgroup intragastric administration for 3 days before acute attack, SP600125 group was intraperitoneal injection half an hour before acute attack. The rats were sacrificed in 4,8,12h after acute attack. Caspase-3, Caspase-8, Fas in liver tissue was detected by immunohistochemical method, the expression of FasL in liver tissue was detected by Western Blot. Results Compared with normal group, the expression of Caspase-3, Caspase-8, Fas, FasL were increased(P< 0.05) in model group at different time points; compared with the model group,JDNWgroup and SP600125 group was reduced at 4h and 8h(P<0.01 orP<0.05), while that was higher than model group at 12h, result had not statistically significant (P>0.05). BothJDNWgroup and SP600125 group can reduce the expression of Caspase-3, Caspase-8, Fas, FasL, and the mechanism was similar. Conclusion The prescription ofJieduan-Niwancan effectively reduce the expression of Caspase-3, caspase-8, Fas, FasL, the mechanism may be related to blocking the death receptor pathway of JNK signaling pathway.

Acute-on-Chronic Liver Failure;JieduanNiwanformula; Apoptosis; Death receptor pathways

首都中醫(yī)藥研究專項(14ZY01)

100069 北京, 首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院[ 穆凌云(碩士研究生) 、李金霞(碩士研究生)、張秋云、高連印、杜宇瓊] ; 中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點實驗室[ 穆凌云( 碩士研究生) 、張秋云、高連印、杜宇瓊]；首都醫(yī)科大學(xué)附屬佑安醫(yī)院人工肝中心(陳煜)

穆凌云(1992- )，女，2014級在讀碩士研究生。研究方向：中醫(yī)藥防治肝膽證治規(guī)律。E-mail：mumu920308@163.com

張秋云(1962- )，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師。研究方向：中醫(yī)內(nèi)科肝病。E-mail: zhangqiuyun8202@aliyun.com

R259

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.04.007

2016-12-17)