基于代謝組學方法的濕熱證“異病同證”研究＊

劉暢，茍小軍，黃迪，趙超群，劉平，4，慕永平，曹健美，張華＊＊

（1.上海中醫藥大學附屬曙光醫院上海中醫藥大學肝病研究所肝腎病證教育部重點實驗室上海市中醫臨床重點實驗室上海201203；2.上海市寶山區中西醫結合醫院中心實驗室上海201999；3.上海中醫藥大學附屬曙光醫院上海中醫藥大學腎病研究所上海201203；4.上海中醫藥大學上海高校中醫內科學E-研究院上海201203；5.上海中醫藥大學研究生院上海201203；6.山東省戒毒監測治療所濟南250000）

基于代謝組學方法的濕熱證“異病同證”研究＊

劉暢1，6，茍小軍2，黃迪3，趙超群1，劉平1，4，慕永平1，曹健美5＊＊，張華1＊＊

（1.上海中醫藥大學附屬曙光醫院上海中醫藥大學肝病研究所肝腎病證教育部重點實驗室上海市中醫臨床重點實驗室上海201203；2.上海市寶山區中西醫結合醫院中心實驗室上海201999；3.上海中醫藥大學附屬曙光醫院上海中醫藥大學腎病研究所上海201203；4.上海中醫藥大學上海高校中醫內科學E-研究院上海201203；5.上海中醫藥大學研究生院上海201203；6.山東省戒毒監測治療所濟南250000）

目的：從代謝組學變化層面揭示“濕熱證”異病同證的物質基礎。方法：以慢性乙型病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝病及慢性腎小球腎炎的典型濕熱證患者各30例為研究對象，以健康者30例為對照，聯合選用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜儀和氣相色譜-飛行時間質譜儀兩個代謝物檢測平臺，對血清樣本進行全譜代謝組學檢測。并運用多維統計方法對數據進行分析，以探索三種不同疾病濕熱證的共性及特異性變化物質。結果：通過比較不同疾病濕熱證組間代謝組學差異物質，并與健康組對照，發現肌苷、尿苷、天門冬氨酸、油酸甘油酯、乳酸鹽是三種疾病濕熱證的共同變化物質。結論：基于代謝組學技術發現，上述三種不同疾病的典型濕熱證之間，既有反映不同疾病的差異性物質，又存在與濕熱證相關的共性物質，從而在代謝水平上為中醫“異病同證”理論提供了客觀依據。

中醫證候代謝組學濕熱證異病同證物質基礎

中醫學以整體觀念和辨證論治為理論基礎和思維特色。“證”是中醫臨床診治的核心，是中醫從診斷到治療的橋梁和關鍵。然而，中醫證候具有主觀性、復雜性、多態性，既往以還原論的思路出發的研究發現的證候的微觀指標往往是主觀、分散、非特異性的，無法客觀、全面、真實地反映中醫學“證”的本質[1]。因此，揭示“證的生物學基礎及其規律”仍是中醫學有待突破的關鍵科學問題之一。

代謝組學是研究生物體系受到內外因素的擾動后，全體分子量低于1 000的代謝產物隨之產生相應改變的一種組學方法[2]，具有能夠從整體、動態的角度進行綜合分析的特點。代謝組學研究通過整體觀察生物體代謝系統網的終端表象，分析生物體機能狀態，與中醫學的系統觀、整體觀相一致。代謝產物的變化是機體生理、病理改變的代謝水平的體現，因而可以很好地揭示中醫“證”的本質[3]，代謝組學技術為中醫證候的物質基礎和臨床有效性研究提供了方法學依據[4，5]。

本研究以慢性乙型病毒性肝炎（Chronic Viral Hepatitis B，CHB）、非酒精性脂肪性肝病（Nonalcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD）及慢性腎小球腎炎（Chron-ic Glomerulonephritis，CGN）三種不同疾病的典型濕熱證患者為研究對象，并以健康者為對照，聯合選用超高效液相色譜-四極桿飛行時間高分辨質譜聯用儀（UPLC-QTOFMS）和氣相色譜-飛行時間質譜聯用儀（GC-TOFMS）兩個代謝物檢測平臺，對患者的血清樣本進行血清全譜代謝組學檢測，采用多維統計方法進行數據分析，最終發現肌苷、尿苷、天門冬氨酸、油酸甘油酯及乳酸鹽與三種疾病濕熱證相關的5種共性物質和反映各自不同疾病的差異物質。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集自2012年10月至2015年2月期間在上海中醫藥大學附屬曙光醫院東院肝硬化科病房、脂肪肝專科門診、腎病科專家門診以及在廈門中醫院肝病中心就診的慢乙肝、非酒精性脂肪肝及慢性腎炎三種不同疾病濕熱證患者各30例（按人體I期臨床探索性試驗最小樣本量30例，并同時滿足代謝組學檢測人的樣本所需最小樣本量要求）。并在曙光醫院東院體檢中心收集健康志愿者30例。

1.1.1 納入標準

受試對象符合CHB、NAFLD、CGN疾病診斷標準[6-8]及濕熱證診斷標準。濕熱證診斷標準參照《中藥新藥臨床研究指導原則》[9]，主癥：①身目黃染，黃色鮮明；②脅肋脹滿或痛；③脘腹脹悶；④煩熱；⑤口干而苦，或口渴少飲；⑥小便黃赤；⑦舌質紅，苔黃膩。次癥：①食欲不振；②惡心嘔吐；③肢體困重或困倦乏力；④皮膚瘙癢；⑤大便秘結或便溏不爽；⑥脈弦滑數。凡符合上述主癥3項（舌象必備）；或主癥2項（舌象必備），加次癥2項的患者，即辨為濕熱證。

1.1.2 排除標準

研究對象的排除標準包括：①有甲、丙、丁和戊型肝炎等病毒重疊感染；②重型肝炎；③腎功能不全者（Scr≥177 μmol·L-1）；④合并惡性腫瘤、結締組織疾病者；⑤妊娠或哺乳期婦女；⑥過敏體質及明確有其他重要疾病者。

本研究方案經所在醫院醫學倫理委員會批準并簽署知情同意書后實施。

1.2 儀器與試劑

YB-86-400LA型低溫冷凍冰箱（上海億倍實業有限公司）；TGL-16B型離心機（上海安亭科學儀器制造廠）；5500型離心機（北京東迅天地醫療儀器有限公司）；QL-901型微型漩渦混合器（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）；BS124S型電子分析天平（北京賽多利新儀器系統有限公司）；Mill-QⅡ型超純水器（美國Milipore公司）；Xevo G2型超高效液相色譜-四極桿飛行時間高分辨質譜聯用儀（Ultraperformance Liquid Chromatography Quadrupole Time-Of-Flight Mass Spectrometry，UPLC-QTOFMS，美國Waters公司）；氣相色譜-飛行時間質譜聯用儀（Gas Chromatography Time-Of-Flight Mass Spectrometry，GC-TOFMS，美國Leco公司）；KQ-250DB型數控超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；LightCycler480實時熒光定量PCR儀，實驗方法為固相吸附法；DXC 800型全自動生化分析儀（美國Beckman Coulter Synchron公司）；Elecsys 2010型電化學發光自動免疫分析儀（瑞士Roche公司）；μs-2200型全自動血細胞分析儀（深圳市庫貝爾生物科技股份有限公司）；ACL7000型全自動凝血分析儀（南京利艾成貿易有限公司）；STZH-HMF-1型肝纖四項檢測儀（北京樂普醫療器械股份有限公司）。

雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA，含1% TMCS，批號：LB67634，美國Sigma公司）；無水乙醇（批號：20117012）、氯苯丙氨酸（批號：2011314）、甲醇（批號：20111007）、乙腈（批號：20110327）、十七酸（批號：20110421）、氯仿（批號：20110121）、吡啶（批號：20110223）、甲氧胺（批號：20110213）均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；實驗用水為超純水。

1.3 血樣采集

采集早晨空腹血，用4 mL非抗凝真空采血管采血4 mL，4℃，3 000 rpm·min-1離心15 min，離心后用移液器吸取上清（血清）分裝放入EP管內，每管400 μL，標注后，-80℃下保存備用。注意事項：①血清樣本采集前避免劇烈運動；②樣本采集前1周囑患者飲食宜清淡，不宜高脂飲食，攝入適量蛋白質，禁止飲酒，并忌用刺激性食物如辣椒、胡椒、芥末等，盡量不抽或少抽香煙，不宜喝濃茶及咖啡。

1.4 生化檢測

生化檢測指標包括：總膽紅素（Total Bilrubin，TBIL）、直接膽紅素（Direct Bilrubin，DBIL）、丙氨酸氨基轉移酶（Alanine Aminotransferase，ALT）、天門冬氨酸轉氨酶（Aspartate Aminotransferase，AST）、γ-谷氨酰轉氨酶（Glutamine Transaminase，GGT）、尿素氮（Urea Nitrogen，BUN）、血肌酐（Serum Creatinine，Scr）、白蛋白（Albumin，ALB）、球蛋白（Globulin，GLB）、血糖（Glu-cose，GLU）等指標均在上海中醫藥大學附屬曙光醫院檢驗科采用全自動生化分析儀和全自動血細胞分析儀檢測。

1.5 代謝組學檢測

1.5.1 血清樣品預處理方法

（1）UPLC-MS待測樣品制備方法

取解凍后的血清樣本，混和均勻，精密吸取40 μL于1.5 mL的離心管中，加入0.3 mg·mL-1的氯苯丙氨酸水溶液20 μL，再加入40 μL水后，加入于4℃下放置過30 min的萃取溶劑甲醇∶乙腈（1∶9）500 μL，混旋2 min，超聲1 min。于-20℃下放置10 min后，于4℃下，12 000 rpm離心15 min，取上清液各150 μL于玻璃進樣瓶中的內插管，-80℃凍存。

（2）GC-TOFMS待測樣品制備方法

血清溶解，渦旋混勻后移取100 μL。加入甲醇溶解的1 mg·mL-1的十七酸10μL和水溶解的0.3 mg·mL-1氯苯丙氨酸10μL，混勻后加入混合溶劑300 μL（氯仿∶甲醇=1∶3，v/v），渦旋混勻，-20℃下靜置10 min，4℃下離心10 min（10 000 rpm）。取300 μL上清液于1.5 mL高回收進樣瓶中，室溫下真空干燥。抽干后用氮氣對樣品再次干燥，以確保樣品中沒有水分并排除空氣中水分對衍生的影響（衍生時，空氣濕度≤35%）。氮氣吹干后加入15 mg·mL-1吡啶溶解的甲氧胺80μL，密封后振蕩30 s，30℃搖床（220 rpm）反應90 min；反應結束后，在反應瓶中加入80μL的BSTFA（含1%TMCS），密封后振蕩30 s，70℃下反應60 min。反應結束之后，振蕩10 s，置于室溫下1 h后進樣分析。

1.5.2 UPLC-MS分析條件

色譜分離時采用的色譜柱為AcquityBEHC18分析柱（100·2.1 mm，1.7 μm）（美國Waters公司），柱溫為60℃，流速為0.4 mL·min-1。自動進樣器溫度設為4℃，每次進樣5μL。流動相：A相為含0.01%甲酸水溶液，B相為含0.01%的乙腈∶甲醇（95∶5），洗脫方式為梯度洗脫。

質譜分析采用ES-（W）模式，檢測參數設置如下：毛細管電壓（Capillary Voltage）為2 300 V，錐孔電壓（Cone Voltage）為40 V，離子源溫度（Source Temperature）為350℃，脫溶劑氣溫（Desolvation Temperature）為120℃，脫溶劑氣流量（Desolvation Gas），700 L·h-1；錐孔氣流量（Cone Gas），40 L·h-1；掃描時間（Scan Time）為0.2 s；掃描范圍（Scan Range）為50-1 000 m/z。

1.5.3 GC-TOFMS分析條件

色譜分析時，取1μL“1.5.1（2）”項下得到的樣品于GC-TOFMS色譜系統進樣。色譜及質譜參數如下：系統載氣及流速為氦氣（1 mL·min-1）；電子碰撞電離為70 eV；全掃描范圍（m/z）為30-600；進樣口溫度為260℃；接口溫度為270℃；離子源溫度為200℃；色譜柱升溫程序為80℃，保持2 min；以10℃·min-1的速度升溫到180℃，以1.5℃·min-1的速度升溫到300℃，保持8 min。

質譜分析條件和參數設置包括：溶劑延時5 min，電離方式EI，電子能量70 eV，質譜掃描范圍：m/z 30-600。

1.6 代謝組學數據處理

將原始數據導入到R2.7軟件中，完成基線校正，峰辨識，峰對齊及內標扣除和歸一化等計算過程，最終得到一個保留時間、質荷比和峰強度組成的三維矩陣表。將三維矩陣導入SIMCA-P11.5軟件（Umetrics Sweden）中進行多維統計分析。利用商業化的代謝物譜庫（如Wiley和NIST質譜庫）及本實驗室建立的標準品代謝物譜庫進行代謝物鑒定。

1.7 統計學分析

2 實驗結果

2.1 人口學特征

分別入組CHB濕熱證患者（YS組）、NAFLD濕熱證患者（FS組）、CGN濕熱證患者（SS組）各30例為病例組；同時收集健康志愿者（N組）30例以對照，4組人口學分布特征見表1。

2.2 生化檢測

由表2可知，與N組比，YS組的TBIL、DBIL、ALT、AST、GGT、BUN、ALB、GLB含量有顯著差異（P＜0.05或P＜0.01），FS組的GGT及S組的ALB的含量有顯著差異（P＜0.01）。與YS組比，FS組的DBIL、ALT、AST、BUN、ALB、GLB及SS組的TBIL、GGT、ALB含量有顯著差異（P＜0.05或P＜0.01）。與FS組比，SS組的TBIL、GGT和ALB的含量有顯著差異（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 疾病組與健康組人口學分布特征表

表2 各組理化指標檢測結果

表2 各組理化指標檢測結果

注：YS.慢乙肝濕熱證組，FS.非酒精性脂肪肝濕熱證組，SS.慢性腎炎濕熱證組，N.健康對照組。與N比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與YS比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與FS比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

SS組10.80±3.59##△2.074±0.71#22.17±13.50##22.28±6.44##23.74±14.79#△△5.15±2.42##72.80±59.22 43.93±3.88**##△△28.7367±3.47##5.86±1.45#檢測項目TBIL/μmol·L-1DBIL/μmol·L-1ALT/IU·L-1AST/U·L-1GGT/IU·L-1BUN/mmol·L-1Scr/μmol·L-1ALB/g·L-1GLB/g·L-1GLU/mmol·L-1N組13.12±3.99 2.60±0.897 44 26.10±14.51 22.375±5.66 22.81±10.73 4.92±1.19 68.66±14.04 48.13±2.88 28.87±2.86 5.37±0.51 YS組26.04±25.38**7.52±16.33*220.57±263.13**117.23±147.02**56.13±51.53*3.39±1.06**75.55±18.21 40.33±3.99**33.13±3.22**5.07±0.53 FS組19.20±8.00 3.29±1.29#83.90±51.29##43.60±27.47##76.98±77.22**4.64±0.97548##70.28±9.85 47.59±2.45##27.79±3.04##5.38±1.09

2.3 代謝組學

2.3.1 代謝譜分析

為彌補不同檢測平臺的缺陷，聯合采用氣質和液質2個代謝物檢測平臺進行檢測。GC-TOFMS平臺檢測了91個物質，UPLC-MS平臺檢測了79個物質。為觀察所有樣本的大致趨勢以及樣本的自然分布和組別關系，發現聚類和奇異點，首先使用非監督的主成分分析（PCA）法，分別對CHB、NAFLD及CGN的濕熱證和健康對照人群（每組30例）的血液代謝譜進行分析。結果顯示，在無監督狀態下各組血代謝物譜不能明顯區分。為進一步篩選對分類有重要貢獻的代謝物，再采用有監督的偏最小二乘法（PLS-DA）分析方法，對上述4組人群的空腹血清樣本的代謝譜進行分析，結果顯示：每兩組間能完全區分開（圖1）。

2.3.2 差異物質分析

聯合采用單維Mann-Whitney方法的P值（M-WP，P＜0.05，FDR=0.1）和多維模型給出的VIP值（VIP＞1）篩選每兩組間的差異物質。結果顯示，與N組比，YS組發現β-丙氨酸（Beta-Alanine）等58種差異物質（表3），FS組找到胱氨酸（Cystine）等55種差異物質（表4），SS組找到膽胺（Ethanolamine）等49種差異物質（表5）；3種不同疾病兩兩組間比較：發現YS組與FS組的差異物質63種（表6），YS組與SS組的差異物質57種（表7）；FS組與SS組的差異物質57種（表8）。

2.3.3 不同疾病濕熱證的差異性代謝物分析

通過對上述3種疾病的濕熱證組與健康對照組比較，找出了既包括濕熱證也包括疾病信息在內的差異物質。而通過對不同疾病濕熱證組間差異物質的比較，則可以發現與疾病信息相關的差異物質。故在不同疾病濕熱證整體的差異物質中減掉與疾病相關的信息，便可得到僅與濕熱證相關的特異性物質。

（1）CHB濕熱證的物質基礎分析

通過與健康對照組比較，找出CHB濕熱證的58種差異物質（表3）；通過對CHB濕熱證與NAFLD濕熱證組疾病差異物質的比較，找出反映兩種疾病的63種物質信息（表6）。從CHB濕熱證的物質中減去CHB疾病的特異性物質，得出CHB濕熱證的特異性物質（表9）。

（2）NAFLD濕熱證的物質基礎分析

通過與健康對照組比較，找出NAFLD濕熱證的55種差異物質（表4）。再通過將CHB濕熱證組與NAFLD濕熱證組的差異物質比較，找出反映兩種疾病的63種物質的信息（表6）。從NAFLD濕熱證的物質中減去NAFLD疾病的物質后，即為NAFLD濕熱證的28種特異性物質（表10）。

（3）CGN濕熱證的物質基礎分析

圖1 各組PLS-DA得分圖

表3 YS組與N組的58種差異物質

續表3

表4 FS組與N組的55種差異物質

續表4

表5 SS組與N組的48種差異物質

續表5

表6 YS組與FS組比較的63種差異物質

續表6

表7 YS組與SS組的57種差異物質

續表7

表8 FS組與SS組的57種差異物質

通過與健康對照組比較，找出CGN濕熱證的48種差異物質（表5）。又通過CGN濕熱證與CHB濕熱證組比較，找出57種反映兩種疾病的物質信息（表7）。再從CGN濕熱證的物質中減去CGN疾病的特異性物質后，就是CGN濕熱證的24種特異性物質（表11）。

2.3.4 濕熱證“異病同證”的物質基礎分析

通過比較三種不同疾病各自濕熱證特異性物質中的共性物質，便可發現其共性物質基礎，即異病同證的物質基礎。比較表9、表10、表11的特異性物質，共找到肌苷、尿苷、天門冬氨酸、油酸甘油酯及乳酸鹽5種與濕熱證相關的共同物質（圖2、表12）。

續表8

3 討論

“證”的生物學基礎及其規律，是當下中醫研究有待突破的關鍵環節之一。既往對證的研究，由于未將“病”、“證”結合討論，故無法厘清所得特異性代謝物是與證相關還是與疾病相關。為此，本研究以CHB、NAFLD、CGN 3個具高典型度濕熱證病種的濕熱證患者為研究對象，并與健康者對照，運用GC/MS和LC/MS代謝組學技術及多維統計分析技術，探索濕熱證的共性變化物質，以闡釋中醫異病同證的科學內涵。

CHB、NAFLD、CGN均為臨床常見疾病。雖然三者病因迥異，但炎癥反應是引起三者肝、腎損傷的共同特點，而相關研究表明，炎癥與濕熱證密切相關，炎癥反應可能是濕熱證形成的一個重要病理基礎[10-12]。本研究通過對三個疾病組與健康組肝腎功等生化檢測指標比較發現，CHB濕熱證組的肝功能指標明顯升高，提示肝細胞損傷、炎癥狀態明顯；NAFLD濕熱證組僅見GGT明顯升高，提示脂肪性肝病主要以GGT的變化為主；CGN組則見ALB顯著降低，提示CGN患者腎小球濾過率異常。三種不同疾病組相互比較，CGN濕熱證組與兩個慢性肝臟病濕熱證組比較，差異主要反映在肝臟功能改變上，顯示了不同臟器疾病的損傷特點；而兩種慢性肝病相比，在不同的肝功能指標上也有顯著差異，提示兩種不同的肝臟疾病也存在損傷程度及機制的區別。但三組濕熱證沒有發現特異性共性變化指標，因而需代謝組學方法探索其相關物質基礎。

代謝組學檢測平臺常用的為氣質聯用、液質聯用和核磁共振，因每種儀器都有各自的檢測范圍及缺陷，因而一種儀器不可能檢測到所有物質。我們聯合采用氣質和液質2個代謝物檢測平臺檢測以彌補不同平臺之不足。結合多元統計分析方法，結果發現不同濕熱證組及健康組每兩組間能完全區分開。而通過聯合采用單維和多維模型篩選每兩組間的差異物質，我們分別發現了三種不同疾病濕熱證組各自的特異性物質（分別為58種、55種、49種）；兩兩組間比較，發現YS組與FS組、YS組與SS組及FS組與SS組的差異物質分別為63種、57種、57種。

表9 27種CHB濕熱證的差異性物質

表10 NAFLD濕熱證的差異性物質

表11 CGN濕熱證的特異性物質

圖2 三組間差異性物質維恩圖

表12 三種疾病濕熱證的共性物質

為尋找不同病、證的差異性物質及濕熱證的共性物質，需去除與病、證無關的影響因素。故選取了年齡、性別及體重基本可匹配的30例健康志愿者為對照。但因3種疾病中，CHB及NAFLD女性發病率比較低，3組間在性別上有顯著性差異。因而我們在數據的前處理過程中，采用標準化、中心化以及數據過濾技術以排除性別的影響。

此外，為了去除疾病的影響因素，理論上還應以非濕熱證組病例為對照。但考慮到非濕熱證組混雜因素較多，為提高對照效能，理想的方案是選擇同種疾病中的隱證者，即傳統中醫四診“無證可辨”或因信息量少“難以辨證”，而實驗室檢查或影像學診斷發現疾病的患者為對照。但受臨床研究時間及患者量所限，很難在有限時間內收集到與3個不同疾病各自對應的真正隱證的患者。有些看似隱證的患者也只是癥狀表現不典型而已。最終只收集到了醫院的優勢病種且隱證者相對多見的慢乙肝患者隱證30例。因而，我們選擇通過對三種不同疾病的濕熱證差異物質進行比較分析以去除疾病信息的方法（經與慢乙肝中與隱證者對照的方法比較，得到基本一致的結果，具體結果略），最終找到肌苷（Inosine）、尿苷（Uridine）、天門冬氨酸（Aspartic acid）、油酸甘油酯（1-oleoyl-rac-glycerol）及乳酸鹽（Lactate）等5種濕熱證共同的差異物質。這5個物質，除了肌酐在非酒精性脂肪肝患者血清中升高外，其他4個物質在三種疾病患者血清中表達均是下降的，變化的趨勢一致，表明三種疾病的濕熱證具有共同的物質基礎。

肌苷屬于機體的正常成分，為腺嘌呤的前體，與體內能量代謝、核酸代謝及蛋白質的合成密切相關。能活化丙酮酸氧化酶系，提高輔酶A的活性，而輔酶A是體內諸多酶促反應的輔助因子，與人體能量代謝、物質合成、免疫系統的激活都密切相關，可使組織細胞在低能缺氧狀態下的代謝能夠繼續順利進行[13]。其特異性變化反映了濕熱證可能與機體組織細胞缺氧狀態相關，其外候可能與其影響體內一系列代謝及免疫功能的狀態有關；尿苷，即尿嘧啶核苷酸，是嘧啶合成代謝的中間體，與核酸代謝相關，揭示濕熱證可能與嘧啶代謝紊亂相關；天門冬氨酸對生物體的合成至關重要。是生物體內賴氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸等氨基酸的合成原料之一，同時也是嘌呤、嘧啶堿基的合成的前體。它是鳥氨酸循環的必需物質，具有增強肝功能、消除疲勞的作用。有報道表明天門冬氨酸含量與濕熱傷陰耗氣所導致的疲勞感聯系密切。天門冬氨酸作為底物可生成谷氨酸和草酰乙酸，谷氨酸可進一步轉化為谷氨酰胺和谷胱甘肽，谷胱甘肽具有抗氧化和解毒功能，草酰乙酸參與三羧酸循環，為組織細胞提供能量，促進損傷肝細胞的修復與再生，恢復肝臟功能[14]。這也從另一方面表明濕熱證與能量代謝有很大關系；油酸甘油酯屬于不飽和甘油酯，是由油酸和甘油酯化所生成的，其代謝水平改變可能與濕熱證患者厭食油膩，甘油三酯攝入不足，或是肝臟分解甘油三酯功能減弱有關；乳酸鹽參與調控機體的代謝平衡，對酸堿平衡、ATP的合成等方面起重要作用。乳酸鹽可以在肝臟進行糖異生，但大部分是通過血液到達氧充足的臟器進行氧化反應。乳酸鹽水平的變化從另一個角度證明了機體氧化反應增強，新陳代謝加快[15]。

綜上，上述5種物質的發現，提示CHB、NAFLD及GGT三種疾病濕熱證的出現，可能與體內核酸代謝、能量代謝、脂肪酸代謝以及氨基酸失調等環節有關。因而部分揭示了中醫“異病同證”存在共性物質基礎的假說。魏濱等[16]通過采用GC-MS檢測平臺及PCA方法對大腸癌和肝癌兩種不同疾病術后肝腎陰虛證、脾虛證、濕熱證和隱證的血漿代謝物譜進行分析，亦發現了甘氨酸等7種濕熱證的共同代謝產物，同樣涉及到能量代謝通路，與我們的結果有相似之處。因而表明代謝組學方法是研究“異病同證”生物學基礎的有效工具之一。但囿于臨床收集患者濕熱證的典型度、樣本量、病種以及不同疾病人群人口學特征匹配度低等的局限，故上述結果，還有待于今后擴大樣本量，并通過代謝組學靶向檢測以進一步驗證，以期能更準確地揭示不同疾病濕熱證的共性物質基礎。

1陳逸明.作為方法的中醫學—中醫藥的復雜性研究.哈爾濱：黑龍江中醫藥大學碩士學位論文,2012：1-106.

2Nicholson J K,Lindon J C,Holmes E.Metabonomics：understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli viamultivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data. Xenobiotica,1999,29(11)：1181-1189.

3Sun S,Dai J,Fang J,et al.Differences of excess and deficiency zheng in patients with chronic hepatitis B by urinary metabonomics.Evid Based Complement Alternat Med,2013：738245.

4方衡,張愛華,周小航,等.基于代謝調控通路的京尼平苷干預陽黃證的作用靶標研究.世界科學技術—中醫藥現代化,2016,18(10)：1697-1708.

5張愛華,劉琦,趙宏偉,等.基于中醫方證代謝組學的男仕口服液治療腎陽虛證的物質基礎與作用機理研究.世界科學技術—中醫藥現代化,2016,18(10)：1670-1683.

6中華醫學會肝病學分會,中華醫學會感染病學分會.慢性乙型肝炎防治指南標準(2010年版).中華肝臟病雜志,2011,19(1)：15.

7中華醫學會肝病學分會脂肪肝和酒精性肝病學組.非酒精性脂肪性肝病診療指南(2010年修訂版).中華肝臟病雜志,2010,18(3)：164.

8貝政平.內科疾病診斷標準.北京：科學出版社,2001：548-549.

9鄭筱萸.中藥新藥臨床研究指導原則.北京：中國醫藥科技出版社. 2002：147-372.

10郭彥清.慢性肝病濕熱證與慢性炎癥關系的臨床探討.石家莊：河北醫科大學博士學位論文,2004：34-45.

11駱歡歡,王新華.論溫病濕熱證的證候實質.中國中醫藥現代遠程教育,2011,9(15)：6-7.

12李小會,謝桂權.原發性腎病綜合征濕熱證與促炎癥因子的相關性研究.遼寧中醫雜志,2011,54(6)：1096-1098.

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Study on“Different Diseases of the Same Syndrome”Damp-heat Syndrome based on Metabonomics

Liu Chang1,6,Gou Xiaojun2,Huang Di3,Zhao Chaoqun1,Liu Ping1,4, Mu Yongping1,Cao Jianmei5,Zhang Hua1
(1.Institute of Liver Diseases,Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Key Laboratory of Liver and Kidney Disease(Ministry of Education),Shanghai Key Laboratory of Traditional Chinese Clinical Medicine,Shanghai 201203,China;2.Central Laboratory,Baoshan District Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine of Shanghai,Shanghai 201999,China;3.Traditional Chinese Medicine Institute of Kidney Disease, Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 201203,China;4.EInstitute of TCM Internal Medicine,Shanghai Municipal Education Commission,Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 201203,China;5.Graduate School of Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 201203,China;6.Institute of Detoxification Monitoring and Treatment of Shandong Province,Jinan 250000,China)

This study was aimed to reveal the material basis on“different diseases of the same syndrome”damp-heat syndrome from the level of metabonomics.The typical damp-heat syndrome patients diagnosed as chronic viral hepatitis B,non-alcoholic fatty liver disease,or chronic glomerulonephritis were included,with 30 cases in each disease.There were 30 healthy volunteers in the control group.The serum samples were detected by UPLC-QTOFMS and GC-TOFMS. And then,the results were analyzed by variance analysis in order to find out the generality and specificity of metabolic material in three different diseases with damp-heat syndrome.The results showed that through comparisons of different diseases with damp-heat syndrome,as well as the healthy group as control,it was revealed that inosine,uridine,aspartic acid,oleic acid glyceride and lactate were the same substances of three diseases of damp-heat syndrome.It was concluded that based on metabonomics,as for three different diseases with damp-heat syndrome,there were different substances among different diseases,but common substances related to damp-heat syndrome.Thus,it provided objective evidences for the theory of“different diseases of the same syndrome”in traditional Chinese medicine(TCM)from the level of metabonomics.

Traditional Chinese medicine syndrome,metabonomics,damp-heat syndrome,different diseases of the same syndrome,material basis

10.11842/wst.2017.03.003

R2-031

A

（責任編輯：吳朦，責任譯審：王晶）

2017-01-16

修回日期：2017-03-15

＊上海市自然科學基金（12ZR1432300）：基于代謝組學技術的濕熱證"異病同證"生物學基礎研究，負責人：張華；上海市教育委員會科研創新項目（重點項目）（14ZZ119）：基于代謝組學及化學計量學方法的肝炎后肝硬化中醫虛實證候分類特征研究，負責人：張華；國家自然科學基金（81673849）：慢性乙型肝炎及非酒精性脂肪性肝病“濕熱證”的代謝網絡研究，負責人：張華。

＊＊通訊作者：張華，博士，副教授，主要研究方向：中醫肝病與證候物質基礎研究；曹健美，博士，副研究員，主要研究方向：中醫肝病臨床與基礎。