鎮肝熄風湯含藥血清激活Nrf2/ARE信號通路對6-OHDA誘導PC12細胞氧化應激的保護作用＊

趙學梅，徐天嬌，董妙先＊＊

（1.齊齊哈爾醫學院藥學院齊齊哈爾161006；2.齊齊哈爾醫學院醫藥科學研究所齊齊哈爾161006）

鎮肝熄風湯含藥血清激活Nrf2/ARE信號通路對6-OHDA誘導PC12細胞氧化應激的保護作用＊

趙學梅1，徐天嬌2，董妙先2＊＊

（1.齊齊哈爾醫學院藥學院齊齊哈爾161006；2.齊齊哈爾醫學院醫藥科學研究所齊齊哈爾161006）

目的：研究鎮肝熄風湯含藥血清對6-羥基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）致PC12細胞氧化應激的保護作用及其相關機制。方法：應用鎮肝熄風湯低劑量（8 g·kg-1）、中劑量（16 g·kg-1）和高劑量組（32 g·kg-1）大鼠的含藥血清或空白血清預處理PC12細胞1 h后，加100 μM 6-OHDA共孵育24 h后收集細胞。二氯熒光素雙醋酸鹽（DCFH-DA）熒光探針染色法結合熒光酶標儀檢測活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）水平，采用實時定量PCR檢測核轉錄因子E2相關因子2（Nuclear Factor-erythroid 2 Related Factor 2，Nfe2l2））基因Nfe2l2、血紅素加氧酶-1（Heme Oxygenase-1，HO-1）、谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基（Glutamate-Cysteine Ligase Catalyticsubunit，GCLc）和調節亞基（GCLm）mRNA表達。采用熒光素酶報告基因系統檢測抗氧化反應元件（Antioxidant Response Element，ARE）活性。結果：鎮肝熄風湯含藥血清抑制了6-OHDA誘導的氧化應激，上調了6-OHDA處理細胞中Nfe2l2、HO-1和GCLc mRNA表達，但是對GCLm mRNA表達沒有顯著影響。結論：鎮肝熄風湯含藥血清對6-OHDA誘導PC12細胞氧化應激具有保護作用，其機制可能與上調Nfe2l2 mRNA表達，使ARE激活進一步誘導其下游II相解毒酶基因和抗氧化酶基因HO-1和GCLc mRNA表達有關。

鎮肝熄風湯6-羥基多巴胺活性氧簇Nfe2l2抗氧化反應元件含藥血清

帕金森病（Parkinson's Disease，PD）是以中腦黑質多巴胺（Dopamine，DA）能神經元變性死亡為主要病理改變的運動障礙性疾病[1]。目前黑質多巴胺能神經元變性確切的發病機制還不完全清楚。近期研究表明，PD的多種致病因素均可通過氧化應激這一共同通路造成神經元的損傷，氧化應激反應是PD的發病的重要機制[2，3]。因此，減輕多巴胺能神經元氧化應激是治療PD的重要策略[4]。許多學者認為某些PD的中草藥療法與其抗氧化作用密切相關，因而從中藥方劑中研究基于抗氧化活性的PD治療藥物具有重要意義[5]。中醫學認為PD病機為“肝腎陰虛為本，肝風內動為標”[6]。中醫通過辨證與辨病相結合治療PD取得了顯著療效[7]。本課題組前期在附子湯灌胃聯合6-OHDA單側損毀黑質法復制的PD肝陽上亢型大鼠模型上發現鎮肝熄風湯具有顯著改善PD模型動物行為的作用[8]，但其機制尚不清楚。本研究旨在驗證“鎮肝熄風湯激活Nrf2-ARE抗氧化系統是其抑制PD相關神經毒素致神經元氧化應激的重要機制”的假說。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器與試劑

Stratagene Mx3005P Real-time PCR儀（美國Agilent公司）；Safire2全波長多功能酶標儀（瑞士Tecan公司）。

OXiSelect?細胞內活性氧檢測試劑盒（美國Cell Biolabs公司，批號：59342027）；Dual-Glo?熒光素酶檢測系統（美國Promega公司，批號：0000077661）；Fu-GENE?6轉染試劑（Promega公司，批號：0000095764）；PRL-TK Vector（美國Promega公司，批號：0000078004）；PGL4.37[LUC2P/ARE/Hygro]vector（美國Promega公司，批號：0000125536）；TRLzol Reagent（美國Ambion公司，批號：87804）；untra SYBR Mixture（with Rox）Kit（北京康為世紀公司，批號：00151503）；Prime Script?RT reagent kit（日本TaKaRa Bio株式會社，批號：BK4001）。Nfe2l2上游引物5′-TGC CCC TGG AAG TGT CAA A-3′，下游引物5′-GGC TGT ACT GTA TCC CCA GAA GA-3′；HO-1上游引物5′-TGC TCG CAT GAA CAC TCT G-3′，下游引物5′-TCC TCT GTC AGC AGT GCC T-3；GCLc上游引物5′-GGC AAG ATA CCT TTA TGA CCA GTT-3′，下游引物5′-TGC AGC ACT CAA AGC CAT AA 3′；GCLm上游引物5′-AGA CAA AAC ACA GTT GGA GCA G-3′，下游引物5′CAG TCA AAT CTG GTG GCA TC-3′；GAPDH上游引物5′-GAC AAC TTT GGC ATC GTG GA-3′，下游引物5′-ATG CAG GGA TGA TGT TCT GG-3′由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.1.2 實驗動物

清潔級健康雄性Wistar大鼠40只，體重220-240 g，由維通利華（北京）實驗動物科技有限公司提供，用于含藥血清和空白血清的制備。

1.1.3 藥物

鎮肝熄風湯由懷牛膝（批號：130501）：代赭石（批號：30301）：天冬（批號：13110）：生龍骨（批號：130501）∶生白芍（批號：130401）∶生龜板（批號：140701）∶生牡蠣（批號：140701）∶元參（批號：130601）∶茵陳（批號：130201）∶川楝子（批號：140301）∶生麥芽（批號：130501）∶甘草（批號：130601）比例為60∶60∶30∶30∶30∶30∶30∶30∶12∶12∶12∶9，煎煮2次后將藥液合并濃縮，中藥飲片均購自哈爾濱市盛泰中藥飲片加工廠；6-OHDA（Santa Cruz公司，批號：#D2312）。

1.1.4 含藥血清制備[9]

大鼠隨機分為空白對照組、鎮肝熄風湯低（8 g·kg-1）、中（16 g·kg-1）和高劑量組（32 g·kg-1），每組10只。適應性喂養3天后，鎮肝熄風湯組大鼠連續7天灌胃給藥，每天2次；空白血清對照組則給予等體積生理鹽水。大鼠末次給藥1h后經戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈采血，3 500 r·min-1離心15 min，收集血清，同組大鼠的血清混合。血清在56℃水浴滅活30 min，0.22 μm millex?GP針頭式過濾器除菌分裝，-20℃凍存。

1.2 實驗方法

1.2.1 檢測細胞內ROS水平

PC12細胞藥物處理24 h后收集細胞，按照OXiSelect?細胞內活性氧檢測試劑盒的操作說明，用熒光探針DCFH-DA標記細胞，利用熒光酶標儀在480 nm激發波長和530 nm發射波長下測定DCF的熒光值。

1.2.2 熒光素酶報告系統檢測ARE活性

將PRL-TK Vector和PGL4.37[LUC2P/ARE/Hygro] vector用FuGENE?6轉染實際共轉染于PC12細胞中，24 h后加入10%的鎮肝熄風湯含藥血清或空白血清1 h后，加100 μM 6-OHDA共孵育24 h，用檢測試劑盒Dual-Glo?熒光素酶檢測系統，按照說明書利用全自動酶標儀進行螢火蟲熒光和海腎熒光檢測，計算標準化后熒光素酶的活性。

1.2.3 Real-time PCR檢測Nfe2l2、HO-1、GCLc和GCLmmRNA表達

PC12細胞藥物處理24 h后，收集細胞。采用TRIZOL方法提取總RNA，采用SYBR法按照untra SYBR Mixture（with Rox）Kit說明書在Stratagene Mx3005P Real-time PCR儀上進行PCR反應。采用2-ΔΔCt方法計算基因相對表達量。

1.2.4 統計分析

應用SPSS 13.0軟件包進行數據分析，結果用xˉ±s表示。多組間均數比較采用單因素方差分析，均數間兩兩比較用SNK檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 鎮肝熄風湯含藥血清抑制了6-OHDA誘導PC12細胞氧化應激

DCFH-DA熒光探針染色法檢測結果顯示：與空白血清對照組比較，模型組ROS水平顯著升高（P＜0.05）；與模型對照組比較，10%的低劑量、中劑量和高劑量鎮肝熄風湯含藥血清組ROS水平顯著降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性（圖1）。

圖1 鎮肝熄風湯含藥血清對6-OHDA處理的PC12細胞中ROS水平的影響

2.2 鎮肝熄風湯含藥血清上調了6-OHDA處理的PC12細胞中Nfe2l2mRNA表達和ARE轉錄活性

實時定量PCR檢測結果顯示：6-OHDA對PC12細胞Nfe2l2 mRNA表達無顯著影響，而10%的低劑量、中劑量和高劑量鎮肝熄風湯含藥血清呈劑量依賴性地上調了PC12細胞Nfe2l2 mRNA表達（P＜0.05）（圖2A）。熒光素酶報告系統檢測結果顯示：與空白血清對照組比較，模型組ARE熒光素酶活性代償性升高（P＜0.05）。與模型對照組比較，10%的低劑量、中劑量和高劑量鎮肝熄風湯含藥血清組呈劑量依賴性的增加了ARE熒光素酶的活性（P＜0.05）（圖2B）。

2.3 鎮肝熄風湯含藥血清在轉錄水平上調6-OHDA處理的PC12細胞中Ⅱ相解毒酶的表達

實時定量PCR檢測結果顯示：6-OHDA對PC12細胞HO-1、GCLc和GCLm mRNA表達無顯著影響，而10%的中劑量和高劑量鎮肝熄風湯含藥血清呈劑量依賴性地上調了PC12細胞HO-1和GCLcmRNA表達（均P＜0.05），10%的低劑量鎮肝熄風湯含藥血清也上調了PC12細胞GCLc mRNA表達（P＜0.05）（圖3）。

圖2 鎮肝熄風湯含藥血清對6-OHDA處理的PC12細胞中Nrf2-ARE抗氧化系統的影響

圖3 鎮肝熄風湯含藥血清對6-OHDA處理的PC12細胞HO-1、GCLc和GCLm mRNA表達的影響

3 討論

PD的發病機制可能涉及遺傳缺陷、興奮性氨基酸毒性作用、環境毒性作用、線粒體功能障礙和氧化應激等因素。已有越來越多的證據提示，氧化應激可能是PD多種致病因素的共同病理基礎[10]。本研究的實驗結果支持了我們的假說，表明Nrf2-ARE抗氧化系統介導的抗氧化活性可能是鎮肝熄風湯抗PD的主要機制。

PD屬中醫學“顫證”范疇，古代醫家多從肝、腎、風方面治療。例如《素問》云：“腎者，作強之官，伎巧出焉”；《靈樞》有曰：“髓海有余，則輕勁多力，自過其度”。腎藏精生髓，腎精虧虛則腦髓失充，出現肢體運動障礙。肝主筋，肝陰不足，筋脈失濡則拘急痙攣。肝腎陰虛動風，同氣相求則震顫抖動。現代多數醫家認為，PD病機關鍵是肝腎陰虛，虛風內動。因此，滋養肝腎、熄風定顫是其治療大法[11]。

鎮肝熄風湯出自清代名醫張錫純的《醫學衷中參西錄》，功用鎮肝熄風，滋陰潛陽，是治療肝陽化風證的經典方。鎮肝熄風湯中牛膝歸肝腎之經，補益肝腎。代儲石、牡蠣和龍骨降逆潛陽，龜板、天冬、白芍和玄參滋陰潛陽。茵陳和川楝子清泄肝陽，生麥芽斂陰。臨床應用鎮肝熄風湯可改善陰虛陽亢的客觀癥狀，對PD有一定療效[12]。

許多學者認為氧化應激是PD發病的核心環節之一[13]。有研究報道自由基損害對多巴胺能神經元的變性發揮重要作用[14]。ROS作為氧化應激的產物，首先出現在線粒體中。當ROS大量累積時就會氧化重要的細胞結構如脂質、蛋白質及DNA，通過線粒體途徑引起細胞凋亡，導致PD發生發展[15]。因此，抑制ROS對阻止PD發病具有重要意義。本研究發現鎮肝熄風湯含藥血清抑制了6-OHDA誘導PC12細胞中ROS產生，表明抗氧化作用可能是其發揮抗PD的機制之一。

Nrf2是調節細胞內抗氧化應激反應的關鍵轉錄因子，能夠激活內源性抗氧化應答，是細胞抗氧化還原的中樞調節者[16]。ARE是位于抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶基因上游調節區的一個DNA-啟動子結合序列，而Nrf2是這一序列的激活因子[17]。Nrf2通過與ARE相互作用，誘導編碼抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的表達，在細胞防御保護中發揮重要作用[18]。發現能調控Nrf2及其下游靶基因的中藥方劑，從而發揮抗氧化損傷作用，是防治PD的重要策略。本研究在體外采用6-OHDA誘導PC12細胞損傷模型，觀察發現鎮肝熄風湯含藥血清具有激活Nrf2/ARE抗氧化系統，進而誘導誘導了Ⅱ相酶HO-1和GCLc基因的表達，從而減少了6-OHDA誘導PC12細胞氧化應激。

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Protective Effects of Zhen-Gan Xi-Feng Decoction-containing Serum on 6-OHDA-induced Oxidative Stress in PC12 Cells through Nrf2-ARE PathwayActivation

Zhao Xuemei1,Xu Tianjiao2,Dong Miaoxian2
(1.College of Pharmacy,Qiqihar Medical University,Qiqihar 161006,China; 2.Institute of Medicine,Qiqihar Medical University,Qiqihar 161006,China)

This paper was aimed to study the protective effects and related mechanisms of Zhen-Gan Xi-Feng(ZGXF) decoction containing serum on 6-OHDA-induced oxidative stress in PC12 cells.The ZGXF decoction containing rat serum with low-,medium-,and high-dose(8,16,or 32 g·kg-1)or blank serum was used to preprocess PC12 cells for 1 h,and cultured together with 100 μM 6-OHDA for 24 h.And then,cells were collected.The fluorescent probe 2',7'-dichlorofluorescin diacetate(DCFH-DA)and fluorescence microplate reader were used to detect the level of reactive oxygen species(ROS).Real-time quantitative PCR was used to analyze the mRNA expressions of nuclear factor erythroid 2-related factor 2(Nrf2),Nfe2l2,heme oxygenase-1(HO-1),glutamate-cysteine ligase catalytic subunit(GCLc),and GCL modulatory subunit(GCLm).The luciferase report gene system was used to detect the antioxidant response element (ARE)activation.The results showed that ZGXF decoction-containing serum inhibited the 6-OHDA-induced oxidative stress,upregulated the Nfe2l2,HO-1 and GCLc mRNA expressions in cells processed with 6-OHDA.However,it has no significant effect on GCLm mRNA expression.It was concluded that ZGXF decoction-containing serum had protective effects on 6-OHDA-induced oxidative stress in PC12 cells.Its mechanism may be correlated with the upregulation on Nfe2l2 mRNA expression,which activated ARE and further induced its downstream gene of phase II detoxifying enzyme, as well as the HO-1 and GCLc mRNA expressions of antioxidant enzyme gene.

Zhen-Gan Xi-Feng decoction,6-hydroxydopamine,reactive oxygen species,Nfe2l2,antioxidant response element,drug-containing serum

10.11842/wst.2017.03.017

R285.5

A

（責任編輯：馬雅靜，責任譯審：王晶）

2017-02-20

修回日期：2017-02-00

＊國家自然科學基金委面上項目（81373629）：基于PI3K/Akt/GSK-3β信號通路的鎮肝熄風法抑制帕金森病氧化應激損傷的機制研究，負責人：董妙先。

＊＊通訊作者：董妙先，主任醫師，主要研究方向：中藥藥理學研究。