干酪乳桿菌胞外多糖基因簇的調控基因在大腸桿菌中異源表達

孔令慧，周煒，王光強，夏永軍，張匯，李紅梅，艾連中，熊智強*

1(上海理工大學 醫療器械與食品學院，上海食品微生物工程研究中心，上海，200093)2(揚州市揚大康源乳業有限公司，江蘇 揚州,225004)

干酪乳桿菌胞外多糖基因簇的調控基因在大腸桿菌中異源表達

孔令慧1，周煒2，王光強1，夏永軍1，張匯1，李紅梅1，艾連中1，熊智強1*

1(上海理工大學 醫療器械與食品學院，上海食品微生物工程研究中心，上海，200093)2(揚州市揚大康源乳業有限公司，江蘇 揚州,225004)

為研究干酪乳桿菌胞外多糖的生物合成和轉錄調控，對其生物合成基因簇中假定的轉錄調控因子LC2W_2170進行克隆，并在大腸桿菌(Escherichiacoli)中異源表達。首先，利用PCR技術從干酪乳桿菌LC2W中擴增出目的基因LC2W_2170，將其插入到大腸桿菌表達載體pET24a和pET30a中，構建出LC2W_2170 N端或C端和N端均含有His蛋白標簽的重組質粒。含上述質粒的E.coli經異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導后，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析并未發現LC2W_2170蛋白可溶性表達。對LC2W_2170氨基酸序列利用Phobius服務器分析，發現該蛋白N端存在跨膜區(前27個氨基酸為跨膜序列)。切除此跨膜區域重新構建重組表達質粒后，在E.coli中成功實現LC2W_2170蛋白可溶性表達。研究為進一步純化該轉錄調控因子，并研究其功能和對胞外多糖生物合成基因簇的轉錄調控機制奠定了基礎。

干酪乳桿菌；胞外多糖；轉錄調控因子；異源表達；大腸桿菌

乳酸菌是一類能利用碳水化合物并產生大量乳酸的細菌總稱，屬于革蘭氏陽性菌，不產芽孢，在自然界中分布廣泛，從各種植物的表面、人畜禽類的腸道和腌制食品等環境中都能檢測到它的存在，在食品和醫藥領域應用較多的乳酸菌主要有乳桿菌屬和乳酸乳球菌屬等。例如，干酪乳桿菌具有很高的乙醇耐受力[1]，能夠很好地適應惡劣環境。它具有能夠改善人體腸道微環境[2-3]，調節機體免疫力，抗過敏，調節血壓和降低膽固醇等[4]重要生理活性。目前乳酸菌的研究重點主要是其發揮作用的機理，比如它的次生代謝產物細菌素和胞外多糖(EPS)[5]如何在調節腸道平衡中發揮著重要作用。

乳酸菌EPS是乳酸菌在生長代謝過程中分泌到細胞壁外的黏多糖或莢膜多糖[2,5-6]。EPS被廣泛應用于食品和醫藥等行業，可作為增稠劑、穩定劑、乳化劑、增稠劑、膠凝劑、脂肪替代品和水黏合劑等[7-8]。在發酵過程中有助于改善發酵的流變學特性，減少發酵乳乳清析出現象，改善發酵乳質地和感官質量等[9]。此外，干酪乳桿菌產生的EPS對自發性高血壓大鼠和腎性高血壓大鼠都具有明顯的降血壓作用[10-11]。由于乳酸菌EPS的這些重要功能，展開乳酸菌EPS的生物合成和調控機制研究具有重要意義。

隨著許多重要的乳酸菌全基因組序列公布和EPS合成相關基因簇的克隆及功能分析，使得利用基因工程和代謝工程技術提高EPS的產量成為可能[7,13-15]。通過其生物合成的機制研究，可闡明其代謝過程中關鍵因素[16]，大量的研究已經證明EPS生物合成途徑中必需的一些基因和相對應編碼的酶。例如，eps基因簇在乳酸乳球菌中過表達，能顯著提高EPS的合成。在此基礎上，對產EPS的乳酸菌進行改造修飾和調控也取得了一定的進展[16]。本研究基于對干酪乳桿菌LC2W基因組數據分析的基礎上[17-18]，發現該菌EPS基因簇中含有一個假定的途徑特異性轉錄調控因子LC2W_2170，關于此調控因子的研究尚未見報道，對它在EPS生物合成中可能的調控作用尚不清楚。為了解LC2W_2170在轉錄水平上如何調控EPS生物合成，純化此蛋白展開凝膠遷移實驗(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)等體外基因表達調控研究非常有必要。因此，本文對LC2W_2170進行克隆，并在E.coli中異源表達，為該蛋白進一步的分離純化、功能鑒定和對EPS生物合成調控機制研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒

實驗所用的菌株與質粒如表1所示。

表1 本研究所使用的菌株與質粒

1.1.2 培養基

MRS(g/L)：細菌蛋白胨10，酵母粉5，牛肉膏10，檸檬酸氫二胺2，葡萄糖20，乙酸鈉8.3，K2HPO42，MgSO40.58，MnSO40.25，吐溫-80 1 mL。115 ℃滅菌20 min。固體培養基另加瓊脂粉20。

LB(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。121 ℃滅菌15 min。固體培養基另加瓊脂粉20。

1.1.3 試劑與儀器

質粒提取、PCR純化試劑盒購自Axygen；限制性內切酶、T4連接酶、IPTG、高保真酶以及DNA marker購自大連寶生物公司；卡那霉素等購自上海生工；蛋白試劑盒購自康為世紀。電泳儀、電泳槽、凝膠成像儀，購自Bio-Rad公司；冷凍離心機，購自Sigma公司；厭氧培養箱，購自RUSKINN公司。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物設計

根據NCBI數據庫中干酪乳桿菌LC2W的LC2W_2170基因完整序列，設計引物并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表2)。

表2 PCR擴增所用的引物及其序列

1.2.2 重組質粒pKLH01和pZX100的構建

以干酪乳桿菌基因組為模板，用LC2W_2170-F/LC2W_2170-R和LC2W_2170-R/LC2W_2170-F1兩對引物分別進行PCR擴增轉錄調控因子LC2W_2170。擴增條件：95 ℃預變性3 min，98℃變性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，30個循環，72 ℃，10 min。PCR產物進行凝膠電泳檢測，并用純化試劑盒回收。LC2W_2170-F/LC2W_2170-R純化產物和pET24a分別用NdeI和XhoI雙酶切，純化回收；LC2W_2170-R/LC2W_2170-F1和pET30a分別用EcoRI和XhoI雙酶切純化回收，16 ℃，連接1 h。將連接產物轉化至E.coliTop10，提取質粒雙酶切驗證正確后送上海生工測序，測序成功的重組質粒分別命名為pKLH01和pZX100，轉化至E.coliBL21(DE3)，涂布在含有卡那霉素(Kan)的LB固體培養基平板上進行篩選。

1.2.3 IPTG濃度對蛋白可溶性表達的影響

將質粒pET24a、pKLH01和pZX100轉化至E.coliBL21(DE3)，將含有重組質粒的BL21(DE3)接種于4 mL含卡那霉素(Kan)的LB液體培養基(kan終濃度為50 μg/mL)中，37 ℃，200 r/min培養過夜。以1%的接種量接種于新鮮LB培養基中，培養至OD600約0.6時，加入IPTG至終濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L，37℃，200 r/min 誘導表達3 h。

取菌液1 mL，12 000 r/min離心1 min，棄上清，無菌水重懸后取80 μL菌液，加入20 μL上樣緩沖液后于100℃煮沸5 min，離心取上清至新1.5 mL EP管，-20 ℃冷卻備用。取上述樣品，進行SDS-PAGE分析(采用康為世紀SDS-PAGE試劑盒)，分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%。電泳結束后凝膠染色2 h，將脫色后的凝膠用Bio-Rad凝膠成像系統照相。

1.2.4 不同溫度對蛋白可溶性表達的影響

細胞培養至OD600約為0.6時，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG，分別在28 ℃和37 ℃誘導，收集菌體，按1.2.3方法進行SDS-PAGE分析。

1.2.5 不同菌株對蛋白可溶性表達的影響

將pET24a、pKLH01和pZX100分別轉化至E.coliC43(DE3)和E.coliRosetta(DE3)中，培養至OD600約為0.6時，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG，37℃誘導3 h，收集菌體，按1.2.3方法進行SDS-PAGE分析。

1.2.6 切除跨膜區域對蛋白可溶性表達的影響

1.2.6.1 切除跨膜區域重組質粒的構建

以干酪乳桿菌基因組為模板，用引物Tru_orf2170-F/LC2W_2170-R1和Tru_orf2170-F1/LC2W_2170-R1兩對引物分別進行PCR擴增LC2W_2170基因。擴增條件：95 ℃預變性3 min,98 ℃變性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸1 min，30個循環，72 ℃，10 min。PCR產物進行凝膠電泳檢測，并用純化試劑盒回收。Tru-orf2170-F1/LC2W_orf2170-R1和pET30a分別用EcoRI和XhoI雙酶切純化回收；Tru-orf2170-F/LC2W_orf2170-R1純化產物和pET30a分別用NdeI和XhoI雙酶切，純化回收，16 ℃，連接1 h。將連接產物轉化至E.coliTop10，提取質粒雙酶切驗證正確后送上海生工測序，測序正確的質粒分別命名為pKLH12和pKLH11。

1.2.6.2 重組質粒pKLH11和pKLH12的表達

將pET24a、pKLH11和pKLH12轉化至E.coliBL21(DE3)，培養至OD600約為0.6時，加入IPTG分別至終濃度為0、0.2、0.4、0.6和0.8 mmol/L，37 ℃，200 r/min 誘導表達3 h，收集菌體，按1.2.3方法進行SDS-PAGE分析。

2 實驗結果

2.1 重組質粒pKLH01和pZX100的構建

干酪乳桿菌中存在與EPS合成有關的基因簇，并且該基因簇中存在一個假定的轉錄調控因子LC2W_2170。本實驗以LC2W基因組為模板，利用PCR擴增出目的基因LC2W_2170，預期條帶大小為897 bp，PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分析，結果顯示(圖1A)，在750 bp與1 000 bp之間有明顯特異性擴增條帶，片段大小與理論預期值一致。

將擴增出的目的基因LC2W_2170經酶切后分別連入表達載體pET30a和pET24a，轉化至E.coliTop10，挑取陽性轉化子過夜培養后提取質粒，進行酶切鑒定。結果顯示(圖1B)雙酶切獲得1條約800 bp及1條約5 400 bp的條帶。前者與插入片段大小一致，后者與pET24a和pET30a大小相一致，2種重組質粒經酶切和PCR擴增鑒定正確。

對重組質粒進一步通過測序來進行鑒定，經過軟件分析比對，結果表明：插入片段的序列同NCBI中公布的結構基因序列完全一致，且插入方向和讀碼框架均正確無誤，表明目的基因LC2W_2170正確插入到了pET24a和pET30a載體中，成功構建了C端含有His-tag的重組質粒pKLH01及C端和N端都含有His-tag的重組質粒pZX100，重組質粒結構圖(圖1C)。

(A)目的基因LC2W_2170的克隆；M：DNA marker DL 2000；1：pZX100質粒中LC2W_2170；2：pKLH01質粒中LC2W_2170。(B)重組質粒雙酶切驗證；M：DNA marker DL 10000；1：pZX100質粒雙酶切結果；2：pKLH01質粒雙酶切結果；3：pZX100質粒電泳結果；4：pKLH01質粒電泳結果。(C)表達載體結構示意圖；T7 promoter：T7啟動子；RBS：核糖體結合位點；His-tag：組氨酸純化標簽；LC2W_2170：LC2W_2170基因；Terminator：終止子圖1 LC2W_2170蛋白表達重組質粒構建與驗證Fig.1 Construction and validation of recombinant plasmid of LC2W_2170

2.2 不同條件對重組蛋白可溶性表達的影響

為研究轉錄調控因子LC2W_2170性質和功能，將pZX100和pKLH01轉化至E.coliBL21(DE3)、C43(DE3)和Rosseta(DE3)中進行蛋白表達，分別在28 ℃和37 ℃兩種溫度，以及在不同IPTG濃度(0、0.2、0.4、0.6和0.8 mmol/L)下誘導下。LC2W_2170蛋白分子量約為30 kDa，但通過SDS-PAGE分析(圖2)，各泳道中25～35 kDa之間與對照組泳道1相比，并無明顯蛋白表達，表明LC2W_2170蛋白在E.coli中并未可溶性表達。

M-蛋白marker；1-pET24a(對照)；2-pKLH01，未加IPTG誘導表達；3-pKLH01，0.2 mmol/L IPTG誘導表達；4-pKLH01，0.4 mmol/L IPTG誘導表達；5-pKLH01，0.6 mmol/L IPTG誘導表達；6-pKLH01，0.8 mmol/L IPTG誘導表達圖2 不同條件對LC2W_2170重組蛋白表達的影響Fig.2 Effect of different conditions on the expression of LC2W_2170

2.3 切除跨膜區域對蛋白表達的影響

2.3.1 切除跨膜區域重組質粒構建與驗證

為解決LC2W_2170蛋白在E.coli中未表達問題，我們對此蛋白進行了序列分析。利用Phobius服務器(http://phobius.sbc.su.se)對LC2W_2170蛋白氨基酸序列分析，發現該蛋白N端存在跨膜區(前27個氨基酸為跨膜序列，圖3A)，所以很可能是此跨膜區影響了蛋白表達。利用NCBI蛋白質保守結構域搜索(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)顯示(圖3B)，LC2W_2170蛋白的保守結構域(如Cps2a保守結構域)并不包括跨膜序列。因此，截去跨膜區并不影響LC2W_2170蛋白的功能。由于前面的實驗用E.coli并沒有成功表達LC2W_2170蛋白，所以嘗試去除此蛋白的跨膜區來提高表達。設計引物PCR擴增不含此跨膜區域的LC2W_2170目的基因，PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分析，結果顯示(圖3C)，在800 bp附近出現單一條帶，與目的片段大小相符。

將PCR產物插入表達載體后，提取重組質粒酶切，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳分析，結果顯示(圖3D)雙酶切獲得1條800 bp及1條約5 400 bp的片段，與預期結果相符合，表明目的基因已經連接到載體pET30a上，分別構建C端含有His-tag及C端和N端均含有His-tag的重組質粒pKLH11和pKLH12(圖3E)。將重組質粒送測序鑒定，測序結果再次證明重組質粒構建成功。

2.3.2 切除跨膜區的LC2W_2170重組質粒在大腸桿菌中表達

將切除跨膜區域重組表達質粒pKLH11、pKLH12以及對照pET30a轉化至E.coliBL21(DE3)，37 ℃培養至OD600約為0.6時，加入不同濃度(終濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L)的IPTG誘導后，進行SDS-PAGE分析。發現所有IPTG濃度都能誘導蛋白表達，不管是C端含有His蛋白標簽的pKLH11，還是C端和N端均含有His蛋白標簽的pKLH12，在30 kDa處有明顯的表達蛋白條帶(圖4A和4B)，并與預測的LC2W_2170蛋白大小相當。而未誘導的含重組質粒的轉化菌以及未誘導的含pET30a質粒的轉化菌(對照)都無目的蛋白條帶，說明此蛋白條帶的出現與IPTG的誘導密切相關，而不是宿主菌本身的蛋白。同時也表明該蛋白在之前條件下未表達，是由于此蛋白跨膜區域的存在影響了其在E.coli中的可溶性表達。

(A)pKLH11蛋白表達結果；M蛋白marker；1：對照pET30a；2：未加IPTG誘導蛋白表達；3：0.2 mmol/L IPTG 誘導蛋白表達；4：0.4 mmol/L IPTG誘導蛋白表達；5：0.6 mmol/L IPTG誘導蛋白表達；6：0.8 mmol/L IPTG誘導蛋白表達。(B)pKLH12蛋白表達結果；M蛋白marker；1：對照pET30a蛋白表達；2：未加IPTG誘導蛋白表達；3：0.2 mmol/L IPTG 誘導蛋白表達；4：0.4 mmol/L IPTG誘導蛋白表達；5：0.6 mmol/L IPTG誘導蛋白表達；6：0.8 mmol/L IPTG誘導蛋白表達圖4 切除跨膜區LC2W_2170蛋白在大腸桿菌中表達Fig.4 Truncated LC2W_2170 expression in E.coli

3 討論

乳酸菌能夠促進消化，有利于營養物質的攝取，在機體腸道內產生有機酸、細菌素和EPS等益生因子，從而維持腸道平衡、增強生物屏障功能和減少疾病的發生[19]。EPS在乳酸菌胞內生物合成的效率普遍偏低，目前其調控機制研究鮮有報道，這些已成為制約其在食品工業中應用的重要因素。

利用基因工程改造是提高乳酸菌EPS產量的重要途徑[20-21]。例如，在干酪乳桿菌LC2W中，通過過表達NADH氧化酶基因，發現可以顯著增加EPS產量[15]。STINGELE等成功地將嗜熱鏈球菌Sfi6的EPS合成基因簇轉入乳球菌MG1363中，使乳球菌能高效表達嗜熱鏈球菌EPS[22]。VAN KRANENBURG等通過在乳酸菌內高效表達參與EPS合成的糖基轉移酶，顯著地提高了EPS的產量[23]。但目前并沒有利用基因工程方法對乳酸菌EPS生物合成中調控蛋白進行研究，因此展開乳酸菌EPS生物合成中調控蛋白功能研究，對進一步了解乳酸菌EPS的生物合成和調控機制研究具有重要意義。

為研究乳酸菌EPS生物合成中調控蛋白功能，對其蛋白表達純化是展開體外功能研究的先決條件。本文以干酪乳桿菌LC2W的EPS基因簇中途徑特異性轉錄調控因子LC2W_2170為研究對象，采用最常用的E.coli蛋白表達系統進行蛋白表達，其中E.coliBL21(DE3)是以T7 RNA聚合酶為表達系統的高效外源基因的蛋白表達宿主，pET系列載體是利用E.coliT7噬菌體的轉錄體系為元件構建的高效表達載體，也是目前最有效的E.coli表達載體。研究表明，在C端或者是N端含有His-tag目的蛋白易于表達，并且能夠增加目的蛋白的表達量[24]，同時也有利于后續對重組蛋白的純化。因此，本文構建了C端或N端含有His-tag重組質粒來表達LC2W_2170。但是將構建好的重組質粒轉化至E.coli表達宿主中，無論是改變溫度，采用不同IPTG誘導濃度、不同表達宿主，和選擇不同誘導時間，LC2W_2170蛋白都未成功實現可溶性表達。

為實現LC2W_2170蛋白的成功表達，我們對此蛋白的氨基酸序列進行分析，發現其N端存在跨膜區，可能造成蛋白在E.coli表達時跨膜信號肽翻譯不完全等問題[25]。因此，本文對其N端跨膜區(前27個氨基酸為跨膜序列)采用了截短策略，去除跨膜區后的重組質粒在E.coliBL21(DE3)中成功實現LC2W_2170蛋白可溶性表達。本研究不僅可為其他具有跨膜結構的調控蛋白在E.coli中表達作為一個成功范例，還為純化該轉錄調控因子，研究其功能及其對胞外多糖生物合成基因簇的轉錄調控機制奠定了基礎。

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Heterologous expression of the transcriptional regulator in the exopolysaccharides gene cluster fromLactobacilluscaseiinEscherichiacoli

KONG Ling-hui1, ZHOU Wei2, WANG Guang-qiang1, XIA Yong-jun1, Zhang Hui1,LI Hong-mei1, AI Lian-zhong1, XIONG Zhi-qiang1*

1(School of Medical Instrument and Food Engineering, University ofShanghaifor Science and Technology, Shanghai 200093, China)2(Kangyuan Dairy Co. Ltd, Yangzhou University, Yangzhou 225004, China)

To study biosynthesis of exopolysaccharides (EPS) and its transcriptional regulation, the putative transcriptional regulator, LC2W_2170, of EPS biosynthetic gene cluster fromLactobacilluscaseiwas cloned and expressed inE.coli.LC2W_2170 gene from the genome ofL.caseiwas amplified by polymerase chain reaction (PCR) and cloned into the vector pET24a and pET30a with His-tag fused to the N-or C- and N-terminus of LC2W_2170. However, the target protein LC2W_2170 cannot be expressed inE.coliafter isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) induction. Through analyzing the amino acid sequence of LC2W_2170 using Phobius server, there was a trans-membrane region at the N- terminal (the first 27 amino acids) of LC2W_2170. LC2W_2170 protein was successfully expressed inE.coliBL21 (DE3) after removal of the trans-membrane region. These results would be helpful for protein purification and transcriptional regulation of exopolysaccharides biosynthesis gene cluster.

Lactobacilluscasei; exopolysaccharides; transcription regulator; heterologous expression;Escherichiacoli

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201705002

博士研究生(熊智強副教授為通訊作者,E-mail：xiongzq@hotmail.com)。

國家自然科學基金(31371809)；新世紀優秀人才計劃(NCET-13-0901)；上海市曙光計劃項目(15SG42)；中國科學院合成生物學重點實驗室開放課題

2016-12-05，改回日期：2017-02-07