鏈霉菌L10608產木聚糖酶純化及特異水解底物生成益生元型產物研究

熊科，熊蘇玥，崔曉亭，侯潔，鮑藝佳，孫佳月，李秀婷*

1(北京工商大學，北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，北京，100048)2(北京工商大學，北京市食品添加劑工程技術研究中心，北京，100048)3(北京工商大學，北京市風味化學重點實驗室，北京，100048)4(北京工商大學，北京市質量與安全重點實驗室，北京，100048)

鏈霉菌L10608產木聚糖酶純化及特異水解底物生成益生元型產物研究

熊科1,2，熊蘇玥1,2，崔曉亭1,4，侯潔1,3，鮑藝佳1，2，孫佳月1，4，李秀婷1,2*

1(北京工商大學，北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，北京，100048)2(北京工商大學，北京市食品添加劑工程技術研究中心，北京，100048)3(北京工商大學，北京市風味化學重點實驗室，北京，100048)4(北京工商大學，北京市質量與安全重點實驗室，北京，100048)

研究對前期篩選的一株產木聚糖酶菌株L10608進行鑒定，判定其為鏈霉菌。并對該菌株所產木聚糖酶進行純化得到電泳級純度木聚糖酶L10608-Xyn11。該酶蛋白質分子量為24 kDa。探究L10608菌株所產木聚糖酶以商品玉米芯木聚糖、商品燕麥木聚糖、自制水不溶性玉米芯木聚糖為底物時的水解特性，結果表明該菌所產木聚糖酶對木三糖有很強的水解作用，以自制水不溶性玉米芯木聚糖為底物水解時效果最為明顯，底物中木三糖的含量下降了1.521 mg/mL，產物中木二糖增加了1.635 mg/mL，木糖僅增加了0.180 mg/mL。菌株L10608的酶解產物中低聚木糖的產量遠高于木糖，且高產低聚木糖中的主要有效成分木二糖，其水解特異性表明該菌有潛力作為益生元型低聚木糖的生產菌株。

鏈霉菌L10608；木聚糖酶；分離純化；益生元產物

木聚糖作為植物半纖維素的重要組分，是自然界中除纖維素以外含量最豐富的可再生生物質資源[1]。木聚糖可被降解用于生產低聚木糖，后者具有降低癌癥風險、抗齲齒、降低血壓、降低血清膽固醇、抑制病原菌和腹瀉潤腸通便等作用，可應用于酸奶、焙烤食品、功能性食品等[2]。目前，生物酶降解法是制備低聚木糖的主要方法之一[3]，木聚糖酶來源主要依靠真菌、細菌等微生物的發酵產生，鏈霉菌屬在低聚木糖的工業化生產中已實現初步的應用[4-5],具有一定的安全性與應用潛力。而目前酶法生產采用微生物來源的木聚糖酶水解木聚糖時除了存在菌株本身產酶活力低下外，水解產物中木二、木三糖等特異性成分含量也大多低于30%且含大量木糖、阿拉伯糖等非功能性成分，導致后期需要較復雜的工藝和高額的成本來對酶解產物進行提純，以提高功能低聚木糖純度(60%～70%)[6-7]。目前報道的只有極少數菌株具有底物水解高酶活力,且水解底物時產物中木二糖、木三糖比例超過50%[8]。

微生物來源的木聚糖酶普遍存在于自然界中且種類繁多，其中細菌和霉菌來源的木聚糖酶研究較多[9]。本實驗從土壤中篩選得到1株L10608菌株，在前期已完成其液體發酵條件優化及水解特性初步研究發現其適合以農業廢棄物玉米芯木聚糖為底物，開展水解產物特異性的研究。基于此本研究通過形態學、分子生物學手段對研究菌株進行鑒定，并純化其所產木聚糖酶和對其產酶性質進行研究，針對目前酶法生產中反應過程難以控制，低聚木糖功能性成分產率低，提純成本高，難以實現規模生產的問題。研究采用不同種木聚糖底物，用HPLC分析考察菌株所產木聚糖酶水解產物特性，以期為工業生產益生元型低聚木糖提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鏈酶菌L10608(實驗室篩選)；燕麥木聚糖和玉米芯木聚糖(VETEC)，細菌 DNA提取試劑盒(Sigma)；木糖標品 (木糖、木二糖、木三糖、木四糖)色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司；硝酸銨、鹽酸、氫氧化鈉、乙酸、醋酸鈉、檸檬酸、三鈉無水亞硫酸鈉：分析純，北京化工廠；玉米芯木聚糖(實驗室提取)。

TCYQ培英臺式恒溫振蕩器，蘇州市培英實驗設備有限公司；紫外可見分光光度計UV-2600，尤尼柯上海儀器有限公司；VEGA-LSU型掃描電子顯微鏡，捷克Tescan公司；SP-Sepharose柱填料，Healthcare公司；AKTAUPC-900蛋白純化儀，美國GE公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒，Solarbio公司。

1.2 培養基

菌株發酵產酶培養基(g/L)：牛肉膏5，胰蛋白胨10，NaCl 5，瓊脂20，定容至1L；液體搖瓶發酵培養基(g/L)：牛肉蛋白胨10，玉米芯木聚糖20，酵母膏3，NaNO32，KH2PO46，K2HPO41.5，MgSO4·7H2O 0.5，定容至1L。LB培養基(g/L)：氯化鈉10，胰蛋白胨10，酵母浸粉5，定容至1L。上述培養基均要求pH 5.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.3 產木糖酶菌株鑒定

將菌株在LB培養基37℃恒溫箱培養2 d，在顯微鏡下進行菌株形態特征的觀察與革蘭氏染色反應。DNA的提取按照細菌DNA提取試劑盒的試劑說明書進行。引物為：Primer1: AGAGTTTGATCMTGGCTCAG，Primer2: TACGGCTACCTTGTTACGACTT。將提取的基因組 DNA 進行 PCR擴增[8]，PCR反應體系為10×PCR Buffer 2.5 μL，20 μmol/L Primer1 0.5 μL，20 μmol/L Primer2 0.5 μL， 2.5 mmol/L dNTP 4 μL，5 U/L rTaq酶0.3 μL，DNA 1.0 μL，ddH2O 17.5 μL[10]。 PCR擴增條件預變性95 ℃10 min，變性95 ℃ 30s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，再延伸72 ℃10 min，1 %瓊脂糖凝膠電泳。送出測序后獲得16S rDNA片段的基因序列，在 NCBI 中BLAST 分析與已登錄基因序列進行比對，選擇相似度最高的基因序列用Clustalx 1.8[9]進行多序列對比分析以及MEGA 6.0軟件構建菌株的系統發育樹。

1.4 木聚糖酶純化

菌株液態發酵結束后，將發酵液10 000 r/min 離心10 min，收集上清液即為粗酶液。取550 mL的粗酶液在冰水浴中，緩慢加入(NH4)2SO4粉末，使(NH4)2SO4的濃度達30 %的飽和度，然后繼續攪拌1 h，在10 000 r/min下離心10 min，上清液和沉淀收集測木聚糖酶活力和蛋白含量。向上清液中繼續加入(NH4)2SO4，至(NH4)2SO4飽和度達到50%，10 000 r/min 離心10 min 收集沉淀。將沉淀用20 mmol /L的醋酸緩沖液(pH5.5) 溶解，在相同緩沖液體系中4℃透析過夜。

將上述發酵條件下產生的粗酶液經30%～50%(NH4)2SO4沉淀后得到部分提純的酶液，利用AKTA蛋白純化系統，進一步用SP-Sepharose離子交換樹脂交換層析純化酶蛋白。實驗條件為：緩沖體系為pH8的0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液；洗脫液為0～0.2mol/L NaCl溶液(溶于pH8的0.02 mol/L Tris-HCl)；以1 mL/min的流速；每管設定收集1 mL，收集樣品備用。

1.5 酶活力測定

木聚糖酶活力測定參照DNS[11]法：將0.1 mL的酶液(適當稀釋)，加到0.9 mL的質量分數為1%樺木木聚糖底物液中(底物液用pH5.5的0.05 mol/L的醋酸緩沖液配制)，在55 ℃下反應5 min，用1 mL DNS來終止反應，以木糖作標準，酶活力單位定義為在一定條件下，單位時間內生成1 μmol木糖所要的酶量(U)。蛋白濃度測定采用蛋白含量測定試劑盒。

1.6 木聚糖酶酶譜及分子量測定

聚丙烯酰胺凝膠電泳[12]在分離膠和濃縮膠質量分數為12.5%和4.5%的條件下進行，電泳后的凝膠用考馬斯亮蘭染色。變性狀態下的酶譜分析是添加質量分數為0.1%樺木木聚糖到分離膠中，其他與SDS-PAGE一致，電泳后的凝膠用異丙醇(25%)與pH7.0的0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液各洗4次，然后在50 ℃反應15min，接著用質量分數為0.1%剛果紅染色15 min，最后用NaCl溶液 (1 mol/L)脫色，直至出現透明斑。根據標準蛋白Marker在SDS-PAGE 中的相對遷移率對分子質量作圖，求出該木聚糖酶的分子質量。

1.7 酶解產物HPLC分析

配置1mL反應體系：分別以500μL 20 mg/mL的實驗室自制水不溶性玉米芯木聚糖、玉米芯木聚糖(VETEC)、燕麥木聚糖(Biotopped)為底物，10 U的酶液，用醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(pH5.5)補足至1 mL。將配置好的1 mL反應體系于55℃水浴鍋水浴加熱反應12 h，0.22 μm水相膜注入進樣瓶中等待檢測。色譜柱條件：糖分析柱(4.6ID×250mm,COSMOSIL)；實驗條件：流動相為乙腈:水70:30，流速為0.8 mL/min，柱溫箱溫度30 ℃，示差折光檢測器溫度30 ℃，進樣量20 μL。

標準品曲線繪制。分別吸取木糖、木二糖、木三糖、木四糖標準品溶于水中，依次稀釋為濃度為：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的標準溶液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得木糖、木二糖、木三糖、木四糖標準溶液系列。分別取20μL 標準系列溶液進樣分析，以木糖、木二糖、木三糖、木四糖濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制木糖、木二糖、木三糖、木四糖的峰面積-濃度標準曲線。

以木糖、木二糖、木三糖、木四糖濃度為橫坐標，以液相檢測峰面積為縱坐標，其標準曲線分別為

式中：X1、X2、X3、X4分別為木糖、木二糖、木三糖、木四糖濃度(mg/mL)。Y1、Y2、Y3、Y4分別為木糖、木二糖、木三糖、木四糖峰面積。

降解率的計算是酶解后體系中木糖、木二糖、木三糖、木四糖含量的變化與空白底物中相應含量的比值。

2 結果與討論

2.1 菌株鑒定

菌株L10608在LB培養基上(圖1A)菌落為白色、表面濕潤，菌體呈大小不等的圓形，菌落濕潤不易挑起，長時間培養后菌體周圍培養基呈深綠色，產生了色素。

圖1 菌株L10608在LB培養基上及顯微鏡(10×100)下形態特征Fig.1 The morphological characteristics of strain L10608 on a LB medium and a microscope (10×100)

菌株在顯微鏡下的鑒定(圖1B)顯示了生長在LB培養基上的菌株L10608在顯微鏡下結構形態，從圖中可以看出該菌株革蘭氏染色呈陽性，具有分支狀菌絲體菌體，細胞小，成鏈狀排列，符合鏈霉菌的形態學特點。對菌株進行基因組DNA提取，隨后進行PCR擴增，得到片段為1500bp左右的目的條帶。將PCR擴增后的產物進行基因序列的測定，測序結果在NCBI數據庫中BLAST比對，選取相似度最高(均在99 %以上)的10株菌株與該段基因序列進行比對，構建系統發育樹(圖3)。由系統發育樹可以判斷L10608為鏈霉菌，并與Streptomycessp.GY2序列相同源性最高為72 %。

圖2 菌株L10608的基因發育樹Fig.2 L10608 strain gene phylogenetic tree

2.2 木聚糖酶的純化

注: M：低分子量標準蛋白；1：粗酶液；2：30%～50%硫酸銨沉淀；3：SP-sepharose離子交換層析；4：酶譜。圖3 鏈霉菌L10608 Xyn11純化圖Fig.3 SDS-PAGE analysis of purified L10608-Xyn11

粗酶液經過硫酸銨沉淀、SP-Sepharose離子交換層析分離純化后得到電泳級純酶L10608-Xyn11 (圖3)。圖3表明經純化的酶在SDS-PAGE凝膠上呈現單一條帶且酶譜相對應位置出現透明條帶，表明該純化的木聚糖酶達到電泳純級，根據標準蛋白Marker 在SDS-PAGE 中的相對遷移率可得該木聚糖酶的分子質量為24 kDa，純化過程中酶活力回收率為4.62%，木聚糖酶純化倍數為11.91，木聚糖酶的比酶活升高至4590.9 U/mg(表1)。研究發現由于鏈霉菌L10608 能夠產生11族、10族兩種木聚糖酶，而L10608-Xyn11 只是其中之一，因此導致該酶的純化倍數與酶活回收率略低。這與菌株Trichodermasp. K9301[13]的研究結果類似，該菌也產生2種不同種類的木聚糖酶，其酶活回收率也略偏低。

表1 鏈霉菌L10608產木聚糖酶的純化總結

研究顯示，鏈霉菌木聚糖酶的分離純化通常要經過多步分離，得到的木聚糖酶通常分為11族與10族兩個水解酶家族，蛋白分子質量大多分別為20～25 kDa與30～55 kDa[14]，該酶分子量為24 kDa極可能屬于11家族木聚糖酶。用Edman降解法測定L10608-xyn11N-末端的10個氨基酸殘基序列用N端序列為ATTITTNQTG(Ala-Thr-

Thr-Ile-Thr-Thr-Asn-Gln-Thr-Gly)，經NCBI BLAST對比后發現與糖苷水解酶11家族Streptomycessp. JHA19 1,4-beta-xylanase(Sequence ID: WP_055619964.1)N端序列100%相似，可判斷L10608-xyn11為11家族木聚糖酶。

2.3 酶解產物HPLC分析

由表2所示不同來源木聚糖酶在相同酶解條件下，水解不同底物后產物中木糖、木二糖、木三糖、木四糖含量變化情況(mg/mL)。

表2 不同來源木聚糖酶與水解不同底物后的木糖、木二糖、木三糖含量及降解率

結果表明，L10608-Xyn11與實驗室另外2株菌同期篩選出的菌株L2524與L3221所產的木聚糖酶在同樣酶解條件下，水解3種不同的木聚糖底物時，不同來源酶與不同底物水解后的木糖、木二糖、木三糖含量的變化差異明顯。當水解玉米芯木聚糖(VETEC)底物時，從結果可知L10608-Xyn11對底物中木三糖的水解能力明顯強于另外2株菌所產木聚糖酶，其對空白中木三糖的水解率達到了84%以上，使水解產物中木二糖的含量顯著上升至空白樣品的2.8倍，相對空白水解產生了1.035 mg的木糖。L10608-Xyn11與一些11族的木聚糖酶水解底物生成產物的性質不同，比如來自Bacillussubtilis的11族木聚糖BsXynA[15]以20 mg/mL櫸木木聚糖為底物時其主要水解產物為木三糖。Qi Yang[16]等人從黑曲霉中純化出一種水解終產物主要為木二糖的11族的木聚糖酶rAfxynA，rAfxynA水解10 mg/mL的櫸木木聚糖時水解產物中含有木糖(0.61±0.04)μmol/mL，木二糖(6.05±0.14)μmol/mL，木三糖(2.47±0.22)μmol/mL，其對木三糖的水解特異性不高，水解率低。

在同樣酶解條件下水解實驗室自制水不溶性玉米芯木聚糖底物的結果表明，其與水解玉米芯木聚糖(VETEC)底物時情況相似，L10608-Xyn11對木三糖同樣有很強的水解能力，導致水解產物中有大量的木二糖與部分木糖累積，相對空白水解產物中木二糖的含量增加了1.635 mg，木糖含量增加了0.180 mg。另外2株菌所產的木聚糖酶雖然超過了L10608-Xyn11對木三糖的水解率，但其木二糖的產率遠低于L10608-Xyn11。可以判斷L10608-Xyn11對玉米芯來源的木聚糖水解能力良好，對木三糖有較強的底物特異性。一般研究認為木二糖至木五糖均是較好的低聚木糖類雙岐因子，雖然木三糖對某些益生菌如青春雙歧桿菌的增殖能力與降低總糖含量的能力強于木二糖[17]，其降低培養液 pH 值的能力和木二糖及低聚木糖相當[18],但同時也有研究認為雙歧桿菌傾向于優先利用聚合度較低的低聚糖[19-20]，因此在一定的水解時間內，木二糖的利用率可能高于木三糖。

表2中3株菌所產木聚糖酶在同樣酶解條件下水解燕麥木聚糖(Biotopped)底物時，由于空白底物本身含有大量的木二糖、木四糖和少量木三糖，且無木糖。L10608-Xyn11酶解產物中木四糖與木二糖的含量下降，木三糖含量相對空白底物上升了0.340 mg，與水解玉米芯木聚糖底物的酶解結果相反。推測可能由于燕麥木聚糖中木二糖含量較高，常常會產生一些終產物抑制作用[21-22]，從而抑制了木三糖進一步分解為木二糖，且底物中大量木四糖水解為木三糖，因此產物中木三糖含量相對空白底物有所上升。為進一步驗證L10608-Xyn11對木三糖的強水解能力，采用相同的實驗條件對木三糖單品進行水解。發現水解產物中木糖和木二糖含量分別為0.655 mg和0.578 mg，木三糖已被完全水解。證明了L10608-Xyn11對木三糖的水解能力。結果圖4所示。

圖4 以木三糖為底物的酶解產物圖(HPLC)Fig.4 Thehydrolysates when use xylotriose as substrate

鏈霉菌L10608產木聚糖酶的水解木聚糖底物可大量產生木二糖產物的特點與Meagher[23]等人對Aspergillusnigersp.中來源的木聚糖酶的研究結論相似。該研究發現此木聚糖酶圍繞著催化位點存在8個結合位點，無法水解木二糖，推測可能是因為當木聚糖酶與木二糖只存在兩個位點結合時(±1)，無法形成穩定的中間體參與水解反應。劉亮偉[24]等人通過構建發育樹研究了木聚糖酶11家族木聚糖酶及10家族木聚糖酶兩個家族的分子進化差別，認為10家族木聚糖酶族催化域結合底物位點數要比11家族木聚糖酶少一些，而11家族木聚糖酶需要多于4個底物結合位點，因此可能無法水解聚合度較低的木聚糖。而蛋白質分子量[25]及后續實驗得到基因序列推斷，鏈霉菌L10608產木聚糖酶屬于11家族木聚糖酶。因此該酶也無法水解聚合度較低的木二糖。

有大量研究表明，當不同結構和組成成分的木聚糖與木聚糖酶結合時，由于木聚糖酶空間結構的容納性，導致結合方式的改變引起產物發生變化。Ebringerova[26]等人分析了玉米芯木聚糖的結構，認為玉米芯可溶性木聚糖和水不溶性木聚糖的主要差別在于前者含較多的阿拉伯糖, 阿拉伯糖連接在木糖主鏈上形成較多的支鏈結構[27]，因此可能是較多的阿拉伯木聚糖側鏈在空間結構上阻礙了酶與底物的結合，導致了L10608-Xyn11水解玉米芯木聚糖(水溶性木聚糖)與實驗室自制木聚糖(水不溶性木聚糖)時，水不溶性木聚糖的水解效率是水溶性木聚糖的2倍。燕麥同屬禾本科植物, 其木聚糖結構與玉米芯木聚糖的結構相似性較高但較多的分支側鏈結構，燕麥木聚糖樣品中含有約15%的葡萄糖殘基和10%阿拉伯糖殘基, 木糖殘基僅占70%左右[28]，水解產物可能含有大量的葡萄糖醛、阿拉伯糖殘基等側鏈結構的異五糖，這樣的結構影響了木聚糖酶對其的進一步降解降低。這導致了燕麥木聚糖作為水解底物時L10608-Xyn11對其水解效率較低。KatarínaKolenova[29]等人的研究也得出類似結果。他們認為來自鏈霉菌StreptomyceslividansXlnA的Xyn-11因為空間結構的原因無法水解帶有葡萄糖醛酸側鏈的木三糖，導致了水解產物組成和比例的改變。

3 結論

鏈霉菌L10608發酵液經硫酸銨沉淀和SP-Sepharose離子交換層析兩步純化后，得到分子量為24 kDa的電泳級純酶(L10608-Xyn11)酶活力達到4 590.9 U/mg。同時，該酶對木三糖的水解能力非常強，有一定的底物特異性，可水解多種木聚糖產生低聚木糖木二糖，但同時會產生一定量的木糖，可以通過分子改造等手段進一步提升其水解底物形成低聚木糖的產率，使其在低聚木糖工業生產等方面具備良好的應用價值。

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Research on xylanase fromStreptomycessp. L10608 hydrolysis substrate to generate specific prebiotics product

XIONG Ke1,2, XIONG Su-yue1,2, CUI Xiao-ting1,4, HOU Jie1,3,BAO Yi-jia1,2, SUN Jia-yue1,4,LI Xiu-ting1,2*

1(Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)2 (Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives,Beijing Technology and Business University, Beijing 100048,China) 3 (Beijing Key Laboratory of Flavor Chemistry，Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China) 4 (Beijing Laboratory for Food Quality and Safety, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

Preparation of oligosaccharide from xylan hydrolysis is an effective way to add value to hemicellulose material of agricultural waste recycling, which has enormous economic potential and environmental protection significance. A 24 kDa xylanase (L10608-Xyn11) fromStreptomycessp. L10608 was purified by ammonium precipitation and anion-exchange chromatography, and its hydrolysis products from three different xylan substrates were analyzed by HPLC. The xylanase fromStreptomycessp. L10608 displayed strong hydrolysis on xylotriose. The content of xylotriose in the substrate was decreased by 1.521mg/ml, that of xylobiose increased by 1.635mg/ml and that of xylose only increased by 0.180mg/ml. The yield of xylooligosaccharides in substrate hydrolyzed by L10608 strain was much higher than that of xylose, and the main effective component in xylooligosaccharides produce was xylobiose. It indicated that the xylanase fromStreptomycessp. L10608 had potential application prospect in prebiotics production.

Streptomycessp. L10608; xylanase; purification; prebiotics

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201705009

博士，副教授(李秀婷教授為通訊作者,E-mail：lixt@btbu.edu.cn)。

國家自然科學基金(31601408)；北京自然科學基金面上基金(6172003)；國家自然科學基金(31371723)

2016-10-20，改回日期：2017-02-10