醬香型大曲細菌的多樣性

王曉丹，雷安亮，班世棟，邱樹毅*

1(貴州大學，貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽，550025)2(貴州珍酒釀酒有限責任公司，貴州 遵義，563003)3(貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽，550025)

醬香型大曲細菌的多樣性

王曉丹1，3，雷安亮2，班世棟1，邱樹毅1，3*

1(貴州大學，貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽，550025)2(貴州珍酒釀酒有限責任公司，貴州 遵義，563003)3(貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽，550025)

以醬香型大曲為研究對象，研究醬香型大曲細菌種群多樣性及功能基因預測。分別采用可培養稀釋平板法以及高通量測序方法分析大曲細菌群落組成，并結合功能基因篩選及高通量測序分析等宏基因組學研究手段，預測其相關基因功能。大曲細菌總數范圍在106～108CFU/g，可培養法分離到的51株Bacillussp.，1株Acinetobactersp.。確定醬香型大曲細菌的主體類群組成為以厚壁菌門(87.3%～91.8%)為主要類群，其次是放線菌門(3.3%～9.1%)，并發現了未曾報道過的藍細菌門Cyanobacteria(0.1%～1.5%)。確定了以Thermoactinomycessp.和Bacillussp.為主的醬香型大曲細菌群落結構組成，其相對含量占細菌總量的60%以上。通過第二代高通量測序方法還對大曲樣品中細菌的代謝功能基因進行了預測。

醬香型大曲；高通量測序；細菌多樣性；功能基因預測

白酒大曲的制作在中國已有2000多年的歷史，制曲過程中，經40 d發酵，逐漸形成了以細菌、霉菌和酵母菌為主的群落結構，其中，細菌尤其是耐高溫細菌的數量最多。目前對醬香大曲中細菌種類和功能的研究主要采用2種方式進行，一是用傳統可培養方法從大曲中分離細菌，通過形態特征和生理生化試驗鑒定細菌，一些研究表明，Bacillussp.是大曲中的優勢菌，有很強的耐熱能力，在發酵體系中能夠生產大量高溫型淀粉酶，促進大曲原料的降解[1]，同時能夠代謝產生多種游離氨基酸，經過發酵體系美拉德反應，產生醬香風味[2-3]；二是用新一代免培養技術研究大曲細菌群落結構，采用PCR-DGGE免培養技術研究大曲貯藏時的群落結構，得出了與傳統可培養法類似的結果，并檢測到了可培養法中沒有檢出的菌種[4-5]，更全面地分析了大曲中的細菌的群落特征。醬香型大曲研究一般只研究醬香型大曲制曲時微生物的動態變化，但是成品曲使用前還需要6個月的儲藏，以降低大曲的酸度和邪雜味，同時此過程又網羅了環境中微生物，細菌群落結構又發生變化[6]，因此，結合大曲的制作工藝和醬香型白酒的制酒工藝，以白酒生產時所用的曲粉作為研究對象，更能準確解析醬香型大曲中細菌的類群結構及功能，從而為今后更加深入地研究細菌在醬香白酒風味形成中的作用提供有意義的指導。

采用傳統茅臺高溫制曲工藝，選取貴州遵義地區的3個企業的生產用曲，通過可培養法和第二代高通量測序方法分析大曲中細菌群落組成，并基于宏基因組學技術，以功能基因篩選和測序分析為研究手段，預測醬香型大曲細菌的功能基因，將有助于揭示大曲特征性細菌群落與優質醬香白酒品質之間的重要關系。

1 材料和方法

1.1 材料

醬香型大曲制作以優質小麥為原料，加水潤糧3h左右，磨碎，加入5%～10%的曲母，37%～40%的水，攪拌均勻；加入曲模，腳踩成型，放置2 h后入曲房發酵40 d，在前14 d，每7 d翻曲1次，發酵結束后在曲倉儲藏3～6個月，粉碎后與高粱混合釀酒。研究共采集3種醬香型大曲MT01、ZJ01、ZX01。

1.2 細菌的分離鑒定

1.2.1 細菌的形態學鑒定

取樣品10 g，90 mL已滅菌的生理鹽水，于35 ℃，120 r/min搖床振蕩30 min。稀釋到合適的濃度梯度，并進行菌落計數。取菌懸液0.2 mL涂布于營養瓊脂培養基上， 35 ℃培養1 d，觀察菌落形態。挑選出不同的菌落形態進行平板劃線，分離出單菌落。接種單菌落觀察菌落形態，并用革蘭氏染色法在光學顯微鏡(江南永新光學(南京)有限公司)下觀察菌落形態特征。

1.2.2 生理生化鑒定

對細菌分別進行糖發酵試驗、檸檬酸鹽試驗、V-P試驗、接觸酶試驗、淀粉水解試驗、厭氧生長、吲哚試驗等生理生化試驗(《伯杰氏細菌鑒定手冊(第八版)》及《一般細菌常用鑒定方法》)。

1.2.3 分子生物學鑒定

取LB培養基37 ℃培養1 d菌液1 mL于1.5 mL離心管中，8 000 r/min離心3 min，棄上清；按照細菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取DNA。擴增細菌16S rDNA序列，擴增引物為27f (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3′)，和1492r (5′-GGT-TACCTTGTTACGAC TT-3′)。在25.0 μL PCR反應體系下，2×Taq PCR Mastermix(天根生化科技(北京)有限公司)12.5 μL，0 μmol/L的上、下游引物各1.0 μL，DNA 2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR擴增條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性0.5 min，55 ℃退火0.5 min，72 ℃延伸1.5 min，30個循環，72 ℃保持10 min。取2 μL電泳，PCR產物經瓊脂糖電泳確定目的條帶后，利用凝膠回收試劑盒切膠回收DNA(寶生物工程(大連)有限公司)，并電泳檢測。PCR產物由上海生工生物工程有限公司測序完成，將測序得到的16S rDNA序列在NCBI上Blast比對鑒定。

1.3 高通量測序方法

取大曲0.25 g，按照Fast DNA SPIN Kit (MP Biomedicals, Santa Ana, CA, USA)試劑盒提取DNA。擴增細菌16S V3～V5區，選擇F (5-CCTACGGGAGGCAGCAG-3) 和R (5-CCGTCAATTCMTTT

1.4 數據分析

高通量測序建庫過程中的PCR擴增會產生嵌合體序列(chimera sequence)，測序過程中會產生點突變等測序錯誤，為了保證分析結果的準確性，需要對有效序列進行進一步過濾和去除嵌合體處理，得到最終用于后續分析的優質序列。運用mothur軟件(version 1.31.2，http://www.mothur.org/)中uchime的方法去除嵌合體序列，標準如下：去除5’端引物錯配堿基數> 1的序列；去除含有N(模糊堿基)的序列；去除含有連續相同堿基數>8的序列；去除長度≤150 bp的序列。對這些優質序列依據序列相似性，用軟件Qiime調用uclust對所有樣品的優質序列按0.97的相似度進行聚類，將序列歸為1個操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)，去除無法分類的OTU，選取每一類中最長的序列作為OTU的代表序列。采用Blast的方法在Green gene經每個分類水平注釋發現，在屬水平，注釋的序列最多，所以數據在屬水平分析。根據NCBI信息數據庫，將測序得到的物種豐度信息回歸至數據庫分類學系統關系樹中，從整個分類系統上全面了解樣品中所有微生物的進化關系和豐度差異。在本研究中，取豐度前100位的OTU表信息，應用軟件MEGAN 4[7-8]進行功能基因的預測和相關統計分析。

2 結果和討論

2.1 醬香型大曲細菌群落組成

2.1.1 可培養方法解析醬香型大曲細菌群落組成

采用可培養方法，測定樣品中細菌總數大小順序為：ZJ01(1.85×108cfu/g)>MT01(3.6×107cfu/g)>ZX01(3.8×106cfu/g)，細菌作為大曲三大微生物類群之一，在釀造過程中呈現出種類多、功能多的特點，是發酵生香的動力來源[9]，細菌多樣性和豐富度高的大曲具有更高的發酵品質，對出產白酒良好風味特征的形成造成重要影響。

共分離鑒定出的5種細菌，4種為Bacillussp.，1種為Acinetobactersp.，在MT01、ZX01、以及ZJ01大曲中的含量分別為29.70%、7.00%、48.10%和0.20%、0.10%、0.20%。其中Bacilluslicheniformis和Bacillusamyloliquefaciens在大曲中含量都比其他細菌多，是典型的嗜熱芽孢桿菌，也是大曲中產醬香功能細菌，在發酵體系中能產生大量淀粉酶以及蛋白酶[10-12]。在貴州遵義地區醬香大曲制曲過程中發現以厚壁菌門為主的49個細菌屬，其中以Thermoactinomycessp.和Bacillussp.為優勢菌種，初步推測為地域性微生物類群[13-14]；在福建省福矛窖酒高溫大曲中同樣分離到Bacillussp.[15]；在濃香型大曲[16-17]同樣也發現了數量占優的Bacilluslicheniformis等產香芽孢桿菌。Acinetobacterbaumannii又被稱為鮑曼不動桿菌，為醫院感染的重要的條件致病菌，具有天然和獲得性耐藥能力[18]，目前還沒有其在白酒領域的研究報道。

可培養法可以分離得到單菌株，從而探究菌種的功能并應用于實際的工業生產，但在不確定大曲菌群結構的情況下，采用常用的分離培養基，故難以全面地分析大曲中細菌的種群結構[19]。本研究中可培養法的鑒定結果只能檢出得細菌兩個屬，分析結果不夠全面，可能與采用未優化的培養基進行分離篩選有較大的關系。

表1 可培養細菌種類

注：表1中的數據代表菌株的數量，“-”表示沒有該菌株。

2.1.2 免培養的方法

采用454 FLX+平臺高通量測序技術對樣品細菌種群進行分析，得到在各分類水平上(門、綱、目、科、屬)的物種組成比例以及群落結構情況。細菌類群分析平均92%以上的序列可以注釋在科水平。有70%的序列可以注釋到屬的水平，16類細菌沒能注釋到屬。許多細菌均不能注釋到種的水平，5類的細菌只能注釋到目，說明該方法仍有缺陷。確定醬香型大曲細菌的主體類群組成為以厚壁菌門為主要類群，其次是放線菌門，芽孢桿菌目占細菌總數的一半以上。芽孢桿菌科Bacillaceae和高溫放線菌科Thermoactinomycetaceae是醬香型大曲細菌的優勢種類。最終確定Actinopolysporaceae, Bacillaceae, Brevibacteriaceae, Enterobacteriaceae, Lactobacillaceae, Leuconostocaceae, Sporolactobacillaceae, Staphylococcaceae, Streptomycetaceae, Thermoactinomycetaceae, Moraxellaceae, Pseudonocardiaceae, 和Planococcaceae.是醬香型大曲的細菌的科水平下類群結構。

根據OUT聚類結果，在屬的層次下進行分析3個樣品中共有的14個細菌類群，這與醬香大曲的制曲生產工藝有著密不可分的聯系[13-14]，這些細菌屬是醬香大曲的主要類群構成，其中的Thermoactinomycesp.、Bacillussp.[13]、Lactobacillussp.、Acetobactersp.[20]等菌屬經證實對醬香型白酒風味品質的形成有重要貢獻。

如圖1所示，MT01中有4個屬相對含量大于1%，相對含量均勻，主要以Firmicutes門(厚壁菌門)為主，占大曲細菌總量的81.0%，是主要細菌種屬；ZX01中有6個屬相對含量大于1%，Thermoactinomycessp.超過總量的50%，其代謝功能對大曲品質的影響很大；ZJ01中有4個屬相對含量大于1%，Bacillussp.的相對含量與MT01相近，Thermoactinomycessp.含量略高于MT01低于ZX01。

圖1 三種醬香型大曲MT01、ZX01、ZJ01細菌種群比例圖Fig1 Scale map of bacterial population in three kinds of Maotai-flavor Daqu: MT01, ZX01, ZJ01注：未注釋到屬的細菌分別在MT01,ZX01和ZJ01占細菌總數的15.70%, 16.6%、10.70%。未被檢測的序列在3個樣本的比例分別為0.00%, 0.10%和0.20%。

采用可培養方法分析大曲中細菌群體主要由Bacillussp.組成，免培養研究發現Thermoactinomycessp.與Bacillussp.為主要優勢菌群，在發酵溫度超過60 ℃的高溫制曲中，Thermoactinomycessp.數量高于Bacillussp.，這表明在醬香型大曲中同樣扮演了重要的角色。劉洋、姚粟等從山東扳倒井芝麻香型高溫大曲中分離得到1株Zm60菌株，經鑒定屬于Thermoactinomycesvulgaris，確定其具有堿性磷酸鹽酶、酯酶、類脂酯酶及萘酚-AS-BI-磷酸水解酶活性，在芝麻香型白酒風味的形成中具有不可忽視的作用[21]。這也說明該菌屬在醬香大曲中是否具有類似功能就值得進行深入研究。醬香型大曲中的細菌種類繁多，主體類群結構相似。溫度為高溫大曲細菌群落形成的重要因素，通過40 d的固態發酵，從45 ℃升溫期到65 ℃高溫期再回落到45 ℃的降溫期，大曲細菌類群均呈現一定程度的增長，成熟期品溫接近環境溫度時，細菌總量趨于穩定[22]，以嗜熱性Thermoactinomycessp.、Bacillussp.為主的細菌特征性種群結構基本形成。

因此，通過本研究發現，在研究白酒釀造微生物的細菌類群結構時，可以先通過高通量測序技術對樣品的細菌組成有明確的了解，再根據這一結論設計不同的培養方法，獲得可培養的細菌，進一步研究其在大曲中的功能。

此外，在免培養分析過程中也發現，使用16S細菌和古菌數據庫：RDP、Silva、Greengene進行比對，40%的細菌均不能注釋到種的水平，有含量高達16%的16類細菌沒能注釋到屬，5類細菌只能注釋到目，說明該方法仍有缺陷。

2.2 大曲細菌功能多樣性預測

通過第二代高通量測序方法不僅能分析細菌的類群組成，還可以以序列分析為主，采用與已知功能基因進行序列比對的方式來預測醬香大曲樣品中細菌群落的功能基因組成，并繪制功能基因柱狀圖反映菌種功能基因的種類以及其豐度信息。結果見圖2。

圖2 功能基因的柱狀圖功能基因的種類及其豐度信息Fig.2 Bar graph of functional genes. Information about species and abundance of functional genes

從功能基因的種類及其豐度信息來看，環境信息處理功能中膜運輸是所有功能基因豐度最高的；新陳代謝最為豐富，其中氨基酸代謝與碳水化合物代謝均十分豐富；此外，對遺傳信息處理、有機物的合成、細胞過程及信號等方面的功能基因也進行了預測。在這些功能基因中值得關注的是在大曲中的微生物都預測到了萜類代謝、聚酮類化合物、膜轉運蛋白等功能，而其中萜類代謝功能大曲中豐度很高，一些研究也表明，萜類尤其是萜烯類物質同樣是藥香型白酒中一類重要的香氣成分，在發酵及陳釀過程中逐漸釋放出來[23]，聚酮化合物作為微生物代謝生產的次級代謝產物對菌體細胞的穩定有重要作用[24]，研究的結果無疑暗示著醬香大曲中細菌在這類物質代謝合成上的重要貢獻。啤酒微生物功能分析獲取了乳桿菌的基因序列及1824個預測基因的功能信息[25]；在人和動物胃腸道微生物類群多樣性及功能性探究中，Swanson 對狗糞便微生物的宏基因組進行隨機測序分析，發現擬桿菌門Bacteroidetes和厚壁菌門Firmicutes是優勢菌群，動物胃腸道中還含有種類和數量豐富的生物質降解酶類[26]；同樣在土壤研究領域，賀紀正等[27]采用第二代測序平臺進一步探討不同類型土壤微生物群落的演化特點和驅動因子。

根據上述的預測結果，可以進一步對大曲細菌群落的功能性做出科學推測，在大曲中細菌群落的控制代謝以及信號分子的相互作用功能基因大量存在，這暗示著細菌群落在大曲中必然參與到各種物質代謝的過程之中，是醬香大曲中的關鍵微生物類群，通過大曲細菌功能多樣性的預測，再次證實了醬香大曲中細菌群落在原料降解及風味形成中的重要功能。

3 結論

分別采用可培養方法和免培養技術來分析醬香型白酒大曲中的細菌微生物種群，從物種分類水平上詳細描述了醬香型大曲細菌群落的特征性結構，同時通過功能基因組成的預測，證實醬香型大曲中的細菌種群主要具有環境信息處理功能、控制代謝功能以及遺傳信息處理功能，加深了對大曲細菌群落的功能性特征的了解，從而為今后大曲細菌多樣性及功能性的深入研究提供了新的思路。

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Research on bacterial diversity of Maotai-flavor Daqu

WANG Xiao-dan1，3, LEI An-liang1,2, BAN Shi-dong1, QIU Shu-yi1*

1(Guizhou Provincial Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biological Pharmacy,Guizhou University, Guiyang 550025,China)2(Guizhou Zhenjiu Co., Ltd.，Zunyi 563003, China)3(School of Liquor and Food Engineering, Guizhou University, Guiyang 550025, China)

In this study, we investigated the bacterial diversity and functional genes prediction of the Maotai-flavorDaqusamples. The bacterial diversities in three kinds of Maotai-flavorDaqusamples were analyzed via the dilution-plate method and high-throughput sequencing method. The results showed that the total number of bacteria colonies was in the range of 106-108CFU/g, and a total of 51 strains ofBacillussp. and only 1 strain ofAcinetobactersp. were identified by the dilution-plate method. Meanwhile, Firmicutes (87.3%-91.8%) were demonstrated to be the dominant bacterial phylum in the three Maotai-flavorDaqusamples via the high-throughput sequencing method. Intriguingly, Cyanobacteria (0.1%-1.5%) were firstly identified in this study. Moreover,Thermoactinomycessp. andBacillussp., with the relatively abundances > 60%, were also demonstrated to be the dominant bacterial genera in the three Maotai-flavorDaqusamples. Furthermore, the metabolic functional genes prediction was also investigated via the high-throughput sequencing method.

Maotai-flavorDaqu; high-throughput sequencing; bacterial diversity; functional genes prediction

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201705012

博士，副教授(邱樹毅教授為通訊作者，E-mail:syqiu@gzu.edu.cn)。

貴州省科技支撐計劃項目(黔科合支撐[2016]2340);貴州省工業攻關項目(黔科合GZ字[2014]3012);貴州省重大專項項目(黔科合重大專項字[2015]6012)

2016-11-03，改回日期：2017-01-04