不同中和劑對植物乳桿菌LP-C凍干菌粉制備的影響

謝萬勇，鮑志寧，黃秀敏，李學優，文國波

(廣州市微生物研究所，廣東 廣州，510000)

不同中和劑對植物乳桿菌LP-C凍干菌粉制備的影響

謝萬勇，鮑志寧*，黃秀敏，李學優，文國波

(廣州市微生物研究所，廣東 廣州，510000)

研究了氨水(NH3·H2O)、氫氧化鈉(NaOH)及碳酸鈉(Na2CO3)作為發酵中和劑對植物乳桿菌LP-C(以下簡稱LP-C)凍干菌粉制備的影響。研究中對高細胞密度培養過程中的活菌數、堿液消耗速率、細胞長度及凍干過程中的凍干存活率等參數進行了監測。結果表明：(1)在高細胞密度培養階段，使用Na2CO3作為中和劑時，培養終點活菌數最高，可達到(1.31±0.08)×1010CFU/mL；各實驗組堿液消耗速率變化趨勢基本一致，均是在培養前期0～6 h快速增長，之后逐步下降；各實驗組菌體長度均隨培養時間推移逐漸減小，至培養終點，Na2CO3實驗組細胞長度最小，為(1.05±0.13)μm；(2)在離心、凍干后，Na2CO3實驗組獲得的凍干菌粉活菌數最高，為(5.17±0.27)×1011CFU/g，凍干存活率最高，為(89.31±0.74)%。由此可以得出，Na2CO3更合適作為中和劑應用于LP-C凍干菌粉的制備，堿液消耗速率可作為判斷LP-C生長情況的間接指標，較小的細胞形態更利于提高培養液活菌數和凍干存活率。

植物乳桿菌；中和劑；細胞長度；凍干菌粉；高細胞密度培養

益生菌(Probiotics)具有調節腸道菌群平衡，預防和治療腹瀉，緩解腸道炎癥，治療乳糖不耐癥，激活機體免疫系統等多方面的生理功能[1-4]。隨著生物技術的不斷發展，市場需求的穩定增加，益生菌在食品、保健、醫藥、農業及畜牧業等方面都有不同程度的研究應用進展[5-7]。而隨著美國發布“國家微生物組計劃(National Microbiome Initiative, NIMI)”，更多種類的益生菌及其作用機理將會被探討和研究。國際組織也越發重視生物保健益生菌制劑在不同領域的開發以及制劑安全性的探索。

隨著高細胞密度培養(High Cell Density Culture，HCDC)、分離和冷凍干燥技術的發展，標準化、高穩定性的益生菌凍干菌粉為益生菌的廣泛應用提供了橋梁和保證。因此對于如何提高益生菌培養液活菌數、凍干存活率、生產效率及存儲穩定性已成為益生菌工業生產研究的熱點。因此控制發酵過程中pH值穩定，已成為實現HCDC的普遍手段。呂兵等[8]研究表明，在保加利亞乳桿菌HCDC過程中pH的控制可解除乳酸濃度不斷提高對乳酸菌自身增殖的抑制作用，從而獲得更高濃度的細胞培養物。Antonis等[9]研究表明，發酵過程中控制恒定的pH值，有利于提高鼠李糖乳桿菌LGG培養過程中糖代謝的速率，進而可提供足夠的ATP來保持細胞活性，加快菌體增殖和可提高LGG在凍干過程中的存活率。同時穩定的pH控制也有利于提高HCDC獲得產物的穩定性，如表達外源蛋白的穩定性、收獲活細胞的活性等[10]。目前尚未有對于不同中和劑對益生菌HCDC過程及后續凍干菌粉制備影響的報道。

本課題以植物乳桿菌LP-C(以下簡稱LP-C)為研究對象，對比在控制恒定pH的HCDC中，NH3·H2O、NaOH及Na2CO3三種中和劑對凍干菌粉制備的影響。研究中通過考察凍干菌粉制備過程中HCDC活菌數變化、菌體形態變化、堿液消耗速率及凍干存活率等參數，以期尋找出一種可提高LP-C HCDC活菌數和凍干存活率的中和劑并初步解析其作用機理，為益生菌的工業生產提供依據和參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

LP-C(lactobacillusplantarumC)，由廣東省微生物種質資源庫保藏(GW-4-1201-1612-04)。

1.2 主要儀器與試劑

主要儀器：50L機械攪拌發酵罐，江蘇豐澤生物工程設備制造有限公司；pH電極，METTLER TOLEDOCo.Ltd；超凈工作臺，江蘇凈化設備有限公司；恒溫培養箱，上海一恒科學儀器股份有限公司；顯微鏡重慶奧特光學儀器有限公司；管式離心機，上海浦東天本離心機械有限公司；凍干機，杭州創意冷凍干燥設備有限公司。

主要試劑：脫脂乳粉，新西蘭恒天然乳品有限公司，食品級；大豆分離蛋白，山東萬得福實業集團有限公司，食品級；葡萄糖，秦皇島驪驊淀粉股份有限公司，食品級；酵母粉，湖北安琪酵母股份有限公司，食品級；VC，山東西唐生物科技有限公司，食品級；司盤S-80，廣州市匯科科技，食品級，其他試劑為分析純。

1.3 培養基

1.3.1 發酵培養基[11]

脫脂乳粉(50 g/L)、大豆分離蛋白(8 g/L)、葡萄糖(20 g/L)、酵母浸膏(8 g/L)、NaCl(23 g/L)、MgSO4·7H2O(2 g/L)、MnSO4·H2O(0.05 g/L)、司盤S-80(1 g/L)、氫氧化胺(0.5 g/L)，調節pH5.80,121 ℃滅菌20 min。

1.3.2 凍干保護劑[11]

脫脂乳粉(20 g/L)，谷氨酸鈉(20 g/L)，海藻糖(40 g/L)，麥芽提取物(30 g/L)。

目前雖然尚未研發出針對非洲豬瘟的疫苗。但高溫、消毒劑可以有效殺滅病毒，因此，確保生物安全成為最重要的防線。泔水是一種方便、成本低廉，但存在高風險的飼料，可能含有多種病原。多項研究表明，食用被病毒污染的泔水是非洲豬瘟傳播的重要方式之一。因此，必須禁止用泔水和含有豬肉的食物殘羹飼喂生豬。

1.4 方法與步驟

1.4.1 LP-C凍干菌粉制備工藝流程[11]

1.4.2 凍干粉存活率計算

(1)

式中：FS為凍干存活率，%；C1為凍干菌粉活菌數，CFU/g；M1為凍干菌粉質量，g；C2為凍干前菌懸液活菌數，CFU/g；M2為凍干前菌懸液質量，g。

1.4.3 活菌計數

參考國標GB4789.35—2010。

(2)

式中：V堿，堿液消耗速率，g/min；M1，堿液初始質量，g；M2，培養一定時間后堿液質量，g，t，培養時間間隔，min。

1.4.5 細胞長度測量

在光學顯微鏡100倍油鏡下，采用OPTPro金相系統分析軟件進行細胞長度測量與記錄，每個樣品做3個鏡片，每個鏡片測量10個細胞的長度，單位μm。

1.4.6 分析方法

作圖軟件采用Excel2010，數據處理采用SPSS23.0。

2 結果與討論

2.1 不同中和劑對LP-C HCDC過程中細胞增殖的影響

圖1顯示了不同中和劑對LP-C HCDC過程中細胞增殖的影響，可以看出各實驗組菌體增殖趨勢基本一致，在培養前0～4.5h，菌體快速增殖，處于對數生長期；在培養后4.5～9 h，菌體增殖速度緩慢，進入平穩期；至培養終點，Na2CO3實驗組活菌數最高，達到(1.31±0.08)×1010CFU/mL，與NH3·H2O實驗組及NaOH實驗組差異顯著(P<0.05)。

圖1 不同中和劑對LP-C HCDC過程中細胞增殖的影響Fig.1 Effect of cell proliferation in the process of LP-CHCDC with different neutralizer

這是由于相比與NaOH和NH3·H2O，Na2CO3作為中和劑時，其與乳酸反應后產生CO2，而CO2的存在將進一步降低培養液中的溶氧水平，進而更利于屬于兼性厭氧型LP-C的生長。而NH3·H2O作為中和劑的同時也是一種速效氮源，在培養前期，菌體生長緩慢，產酸量低，NH3·H2O添加量少，此時培養液中碳氮比基本維持在初始培養基的水平，菌體增殖正常；但是在進入對數后期后，菌體快速增殖，原始培養基中碳源氮源不斷消耗，產酸速率加快，NH3·H2O添加量增加，增加了培養液中氮源，從而降低了培養液的碳氮比，進而不利于菌體的進一步增殖。這與高磊等[12]研究類似，其在研究不同碳氮比對乳酸菌生長的影響時發現較高的碳氮比(C∶N≥10)更適合乳酸菌的生長。NaOH作為中和劑時，隨著發酵的進行，培養液中Na+濃度不斷提高，至培養中后期，過高的鹽離子將抑制菌株的生長[13]。

2.2 不同中和劑對LP-C HCDC過程中堿液消耗速率的影響

微生物發酵是一個不斷消耗培養基中的營養成分，經過微生物細胞代謝合成菌體生長所需產物的過程，而營養成分的減少、代謝產物的增加將使培養液中的酸度不斷變化，因此培養液酸度作為微生物發酵過程中一個重要的監測參數，其可以間接的反映發酵液中營養成分的消耗情況、代謝產物的生成情況及菌體的增殖情況[14]。而在恒定pH高細胞密度培養過程中，與酸度變化直接相關的即中和劑的添加速率和添加量，可根據中和劑的添加情況判斷菌體生長情況。

圖2顯示了不同中和劑對LP-C HCDC過程中堿液消耗速率的影響，可以看出各實驗組堿液消耗速率變化趨勢基本一致，并與菌體生長的變化趨勢基本一致，在培養前0～2h，菌體生長處于遲滯期，堿液消耗速率緩慢；在培養2～6.5 h，菌體生長處于對數期，堿液消耗速率加快；在培養6.5～9.5 h，菌體生長處于平穩期，堿液消耗速率緩慢下降。對培養過程中堿液消耗的記錄及乳酸產量的計算(表1)，可以看出，NH3·H2O實驗組與Na2CO3實驗組乳酸生成量沒有顯著差異，NaOH實驗組乳酸生成量最低與其余兩個實驗組存在顯著性差異，由此可以看出NaOH實驗組碳源代謝率最低，而結合高細胞密度培養活菌數來看，NaOH實驗組的放罐活菌數也是最低，進而可以看出在LP-C的高細胞密度培養過程中，碳源的高效率代謝對活菌數的增加至關重要。

圖2 不同中和劑對LP-C HCDC過程中堿液消耗速率的影響Fig.2 Effect of alkali consumption rate in the process of LP-CHCDC with different neutralizer

項目堿液消耗量/mol乳酸生成量/molNH3·H2O實驗組10.19±0.18a10.19±0.18bNaOH實驗組9.39±0.22b9.39±0.22aNa2CO3實驗組4.99±0.09c9.99±0.90b

注：a、b、c表示同一列數據差異顯著(P<0.05)。

2.3 不同中和劑對LP-C HCDC過程中菌體形態的影響

微生物細胞在不同的培養基中[15]、不同的生長階段[16]及不同的生長環境中[17]，細胞形態會不同。圖3和圖4顯示了不同中和劑對LP-C HCDC過程中細胞長度的影響，由圖可以看出，3個實驗組細胞大小均隨培養時間的推移，菌體長度在逐步減小；在培養前1.5～6.0h(對數生長期)，細胞長度迅速減小，在培養6.0～9.5h(穩定期)，細胞長度減小速度減慢。相比于培養1.5h時，各實驗組HCDC結束時，細胞長度分別下降了(62.05±0.35))%、(62.00±0.31)%和(67.81±0.18)%，并且至培養終點時，Na2CO3實驗組細胞長度最小，為(1.05±0.13)μm，與其余兩個實驗組存在顯著性差異。由此可以看出，3個實驗組均隨培養時間的推移細胞長度逐漸變小，分析可能是隨著培養時間的推移，培養液中細胞總量不斷增加，培養液中營養成分不斷被消耗，至培養后期菌體之間營養和空間競爭加劇，細胞生長不是足夠充分；并且隨著培養時間的推移，培養液中乳酸鹽濃度不斷增加，培養液滲透壓也不斷增加，為了維持細胞內外滲透壓平衡，細胞失水收縮，進而細胞體積也會隨之減小[18]。

圖3 不同中和劑對LP-C HCDC過程中細胞長度的影響Fig.3 Effect of cell length in the process of LP-C HCDC with different neutralizer

圖4 不同中和劑HCDC過程中不同時期菌體鏡檢圖Fig.4 The microscopic examination of the bacteria in the process of HCDC with different neutralizer in different periods

2.4 不同中和劑對LP-C凍干菌粉制備的影響

離心菌體分離及冷凍干燥獲得菌粉作為益生菌菌粉制備過程中的關鍵步驟，對其品質有著重要影響。從表2中可以看出，3組實驗中的菌泥重量、菌懸液重量及凍干菌粉重量均沒有顯著差異；冷凍干燥后，Na2CO3實驗組凍干存活率最高，為(89.31±0.74)%，與NH3·H2O實驗組及NaOH實驗組存在顯著差異；并且獲得凍干菌粉的活菌數也是Na2CO3實驗組最高，達到(5.17±0.27)×1011cfu/g，與NH3·H2O實驗組及NaOH實驗組存在顯著差異。由此可以看出，不同中和劑的使用不僅對LP-C HCDC過程存在影響，而且對其后期菌粉制備也有較大影響，使用Na2CO3作為中和劑時，HCDC獲得菌體細胞活力更高，在整個凍干菌粉制備過程中活細胞損失率更小。結合HCDC過程中細胞形態的變化及凍干菌粉細胞長度來看，長度更小的細胞更利于提高冷凍干燥過程的凍干存活率和獲得活菌數更高的凍干菌粉。Carvalho等[19]研究表明，在凍干過程中，短小的細胞受到冰晶的損傷更小，更利于提高凍干存活率和保持細胞活力。并且Martin等[20]在研究不同培養基組成對嗜酸乳桿菌NCFM HCDC的影響時，發現短小的細胞比長細胞更加穩定，并且在凍干及儲存過程中的穩定性更高。本課題首次將細胞長度變化與LP-CHCDC過程及凍干過程相結合，結果表明細胞長度可作為益生菌凍干菌粉制備過程中一個重要的參數進行監測。

表2 離心及凍干過程中數據記錄

注：a、b、c表示同一列數據差異顯著(P<0.05)。

表3 離心及凍干過程中活菌數記錄

注：a、b、c表示同一列數據差異顯著(P<0.05)。

圖5 不同中和劑HCDC凍干菌粉鏡檢圖Fig.5 The microscopic examination of the freeze-dried bacteria powder in the process ofhigh density culture with different neutralizer

3 結論

在50L發酵罐水平探討了NH3·H2O、NaOH及Na2CO3作為中和劑時對LP-C凍干菌粉制備的影響。通過對制備過程中活菌數、pH變化率、堿液消耗速率、細胞形態變化及凍干存活率等參數分析可得出以下結論：(1)3種中和劑中Na2CO3更適合作為LP-C HCDC的中和劑，相比于NH3·H2O和NaOH，使用Na2CO3時的安全性更高、成本更低，將更加有利于LP-C的工業化生產；(2)在LP-C HCDC過程中可以堿液消耗速率作為移種、補料及培養終點的參數指標；(3)在LP-C HCDC過程中，細胞長度在逐漸變小，并且較小的細胞形態有利于提高益生菌培養液活菌數和凍干存活率。

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Effect of different fermentation neutralizer on preparation ofLactobacillusplantarumLP-C lyophilization powder

XIE Wan-yong, BAO Zhi-ning*, HUANG Xiu-min, LI Xue-you, WEN Guo-bo

(Guangdong Institute of Microbiology, Guangzhou 510000, China)

This article studied the effect of ammonia (NH3·H2O), sodium hydroxide (NaOH) and sodium carbonate (Na2CO3) as fermentation neutralizer on preparation of plant Lactobacillus LP-C lyophilization powder. In this study, viable count, neutralizer consumption rate, cell length and lyophilization survival rate were be monitored during the process of high density culture and lyophilization. The results showed that, the highest number of living bacterium reached (1.31+0.08)×1010CFU/mL at the stage of high cell density cultivation (HCDC) with Na2CO3as a neutralizer. The change trend of alkali consumption rate was substantially identical among all experimental groups, which was fast at the early stage of culture (0-6 h) and decline gradually at the late culture stage (6-9.5 h). The length of cells in each experiment decline gradually during the process of HCDC, and the minimum cell length reached (1.05 + 0.13) μm when using Na2CO3as a neutralizer. After centrifugation and lyophilization, the highest number of living bacterium of lyophilization powder reached (5.17±0.27)×1011and the highest lyophilization survival rate reached (89.31±0.74)% when using sodium carbonate as a neutralizer. In conclusion, sodium carbonate was a more suitable neutralizer for lyophilization powder preparation of LP-C. Alkali consumption rate can be used as indirect indicator of growth of LP-C. Smaller cell length is more conducive to improve the number of living bacterium during fermentation and survival rate after lyophilization.

Lactobacillusplantarum；cell length；neutralizer；lyophilization powder; high cell density culture

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201705020

碩士研究生(鮑志寧博士為通訊作者,E-mail：janinebao@gmail.com)。

廣州市科技計劃項目產學研協同創新聯盟專題“益生菌資源庫建設及產業化關鍵技術研究和應用示范”；廣東省省級科技計劃項目技術交易體系與科技服務網絡建設領域“廣州市生物科技園科技創業服務平臺建設”(2015B040403004)

2016-10-11，改回日期：2017-01-07