數控與傳統發酵普洱茶抗氧化活性與化學成分的比較

王興華，念波，段雙梅，嚴亮，楊瑞娟，崔廷宏，蔣勛，鄭文忠，趙明，羅朝光*

1(云南省普洱茶樹良種場，云南 普洱，665000)2(云南農業大學 龍潤普洱茶學院，云南 昆明，650201) 3(普洱茶研究院，云南 普洱，665000)

數控與傳統發酵普洱茶抗氧化活性與化學成分的比較

王興華1，念波2，段雙梅2，嚴亮3，楊瑞娟3，崔廷宏1，蔣勛1，鄭文忠1，趙明2，羅朝光1*

1(云南省普洱茶樹良種場，云南 普洱，665000)2(云南農業大學 龍潤普洱茶學院，云南 昆明，650201) 3(普洱茶研究院，云南 普洱，665000)

分別應用數控與傳統方法進行普洱茶發酵，應用紫外分光光度法和高效液相色譜法測定發酵樣品的化學成分，結合電子鼻和感官審評比較發酵樣品品質特征，并測定比較出堆樣品的體外抗氧化活性。結果表明，2種發酵過程水浸出物、茶多酚、茶黃素、茶紅素、兒茶素含量降低，茶褐素、咖啡堿含量增加，但數控發酵過程中，化學成分含量變化速度更快，且“堆味”更少。數控發酵出堆樣的總抗氧化活性、超氧陰離子清除活性能力低于傳統發酵，羥自由基清除活性高于傳統發酵，而DPPH自由基清除活性二者之間沒有顯著性差異。總之，數控與傳統發酵茶葉化學物質變化規律相同， 但發酵速度更快，香氣更好。

普洱茶發酵；數字化；化學成分；抗氧化活性；電子鼻

普洱茶是以云南大葉種茶樹[Camelliasinensis(Linn.) var.assamica(Masters) Kitamura]的曬青毛茶為原料，采用后發酵等工藝制成的具有獨特品質特征的茶葉[1]。其湯色紅濃明亮，香氣陳香，滋味醇厚甘滑。研究發現普洱茶具有降脂減肥、抗氧化、抗菌、抗突變或腫瘤、保護神經損傷、抑制α-葡萄糖苷酶等保健功能或生物活性[2-3]。由于獨特的口感和良好的保健功能，普洱茶在國內外具有較好的銷量。

后發酵是普洱茶加工的關鍵工藝，一般是將曬青毛茶潮水、渥堆、翻堆(潮水)數次的過程。目前云南普洱茶的發酵一般沿用傳統的人工操作，依靠環境微生物進行自然發酵。在傳統的普洱茶生產過程中存在著品質不穩定、人工勞動強度大、生產效率低等諸多問題，嚴重影響普洱茶產業健康、持續、穩定發展[4]。開發新的發酵控制設備，成為普洱茶產業轉型升級的必由之路。近年來已有部分學者在普洱茶發酵機械方面開展了一些研究，如孫楊鋒等設計了滾筒式潮水機械[4]，吳曉強等開發出一套以S7-300 PLC為核心的發酵車間溫濕度控制系統[5-6]，劉晗通過硬件(傳感器、集成網控系統與PC)和軟件(zigbee通信、WIFI通信和GPRS通信監測)的研究建立了數字化普洱茶發酵系統[7]，趙永潔等設計了普洱茶發酵車間測控系統[8]，馬振綱等構建了普洱茶發酵清潔化車間[9]，吳紹帥等研發集自動潮水、保溫保濕發酵、旋轉翻堆等技術于一體的多功能雙層保濕轉動式普洱茶發酵罐[10]，馬振綱等建立了由PLC主控設備、傳感器(溫濕度傳感器)、變送器、計算機處理系統(人機界面顯示)、智能化加溫和加濕設備等構成的普洱茶發酵自動化設備[11]。這些發酵設備，尤其是基于PLC控制系統的發酵設備為普洱茶的現代化生產提供了技術支持。但以上發酵控制設備仍存在翻堆困難及發酵罐每批次發酵茶葉量較少的缺點，在實際應用方面存在一定的局限。

為了建立可實際使用的普洱茶發酵系統，本項目組前期在紅茶發酵控制系統的基礎上研究開發了數字控制立體普洱茶發酵系統(圖1)。該系統主要包括由PLC、溫濕度傳感器以及溫濕度控制系統組成的發酵室與立體普洱茶發酵筐組成。與已有報道相比，本系統最大的特點是采用立體發酵筐代替渥堆方式，更容易實現機械化翻堆。為此本研究應用該數控普洱茶發酵系統與傳統方式分別發酵了一批次普洱茶，測定比較發酵樣品的化學成分、抗氧化活性與感官品質，為該系統的推廣應用提供實驗依據。

圖1 普洱茶數控發酵系統照片Fig.1 Photographs of numerical control Pu-erh tea fermentation system

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 發酵原料

普洱茶樹良種場2014年生產的三級曬青毛茶。

1.1.2 實驗試劑

甲醇、FeSO4、酒石酸鉀鈉、Na2HPO4、KH2PO4、醋酸乙酯、正丁醇、乙醇、超純水、Na2CO3、草酸、AlCl3、磷酸鹽、茚三酮、抗壞血酸、DPPH(1,1-二苯基-2-苦基苯肼)、焦性沒食子酸為國產分析純試劑，羥自由基測試試劑盒與總抗氧化能力測試試劑盒為南京建成生物工程研究所產品，液相色譜所用的色譜純乙腈為Sigma產品。咖啡堿(CA)、兒茶素(C)、沒食子酸(GA)、1,4,6-tri-O-galloyl-_-D-glucose(G-G)、表沒食子酸兒茶素(EGC)、表兒茶素(EC)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)對照品均購自天津一方科技有限公司。

1.1.3 實驗儀器

電子分析天平，奧豪斯儀器有限公司；HH-S28S數顯恒溫水浴鍋，金壇市大地自動化儀器廠；101A-2型電熱鼓風恒溫干燥箱，上海市崇明實驗儀器廠；電子鼻(PEN3)，北京盈盛恒泰科技有限責任公司；756CRT紫外可見分光光度計、茶樣粉碎機、實驗室蒸餾水機、玻璃干燥器、茶葉審評設備等；1200型高速液相色譜系統，美國安捷倫；包括VWD檢測器、柱溫箱、自動進樣器、在線脫氣機、溶劑輸送泵。

1.2 方法

1.2.1 普洱茶發酵與樣品采集

1.2.1.1 傳統普洱熟茶發酵

曬青茶2 t，潮水800 kg，至含水量38%，堆成0.7 m高的茶堆，覆蓋濕麻布發酵；發酵過程間隔6～8 d翻堆補水；發酵過程記錄發酵堆4個層面的堆溫以及發酵室的溫濕度。翻堆前取發酵階段樣品，室溫陰干進行后續分析，各樣品見表1。

1.2.1.2 數控立體普洱茶發酵

曬青茶6 t，潮水2.4 t，至含水量38%。潮水混勻后，將茶葉盛滿大號塑料框，每框30 kg左右，放置在多層發酵架上置于發酵室發酵。發酵室全封閉，應用PLC系統對溫度、濕度、供氧、排碳進行調控，實現發酵過程茶葉溫度、濕度、氧氣的自動化監測與控制。發酵間隔6～12 d，混合補水，共進行3次混合。混合補水前取樣后，經空氣干燥進行后續分析，各樣品見表1。

表1 傳統與數控發酵樣品

1.2.2 茶葉化學成分測定

1.2.2.1 水浸出物、茶多酚、茶多糖、茶色素的測定

按2015版國標測定茶樣水浸出物[12]，應用酒石酸鐵比色法、茚三酮比色法、硫酸蒽酮法和萃取比色法，測定茶葉茶多酚[13]、茶多糖[14]和茶色素[15](茶黃素、茶褐素和茶紅素)的含量。

1.2.2.2 兒茶素類、咖啡堿的測定

應用實驗室建立的高效液相色譜法測定茶葉兒茶素、沒食子酸、咖啡堿的含量，主要方法如下：

(1)樣品提?。悍Q取1.0 g茶葉磨碎樣品，加入2%磷酸10 mL，再加入10 mL甲醇，混合靜置1 h，過濾于50 mL容量瓶，重復提取2次，定容至50 mL，測定前經0.2 μm過濾，待測。

(2)高效液相色譜：使用TSKgel ODS-80TM色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，日本TOSOH)分離；流動相A為0.261%磷酸，5%乙腈；流動相B為0.261%磷酸，80%乙腈；洗脫梯度程序為0～21 min B液從10%線性梯度增加至20%；21～22 min，B液從20%線性梯度增加至100%；22～26 min，B液100%保持不變；26～26.5 min，B液由100%線性梯度降低至10%B；27 min程序停止；以10%B液后運行平衡5 min；流速為1.0 mL/min；柱溫為40 ℃；檢測波長280 nm；根據保留時間確定化合物，使用外標法根據峰面積定量。

1.2.3 茶葉香氣分析

1.2.3.1 樣品制備

每個茶樣稱取1 g干茶放進150 mL三角瓶中，加入50 mL沸水沖泡5 min，過濾，濾液靜止45min冷卻待測。每個茶樣重復制備3個樣品，重復3次測定。

1.2.3.2 測定與分析

采用德國Airsens公司PEN3便攜式電子鼻(Portable Electronic Nose)進行檢測，利用Airsense公司編制的電子鼻配套軟件WinMaster實現電子鼻工作過程控制及數據分析。對兩種方式發酵樣品茶水的電子鼻響應值生成的初始特征向量進行主成分分析。儀器設定測定60 s，清洗通道120 s，平衡45 s，取響應信號區間48～52 s進行分析。

1.2.4 感官審評

根據國家標準[16]中各類茶葉品質特征的描述和要求對實物標準樣進行審評。

1.2.5 體外抗氧化活性研究

采用紫外-可見分光光度法+抗氧劑提取液方法測定清除DPPH(二苯代苦味酰自由基)自由基能力[17]，采用鄰苯三酚自氧化法測定清除超氧陰離子的能力[18]。使用南京建成生物工程研究所的抗氧化能力(T-AOC)和羥自由基能力測試試劑盒測定總抗氧化能力(T-AOC)和抑制羥自由基能力。綜合以上實驗結果評價比較樣品的體外抗氧化活性。

1.2.6 數據分析

每次翻堆收集2份樣品，每份重復提取2次，每個提取液重復測定2次，以 mean±SD表示平均值。利用單因素方差分析處理實驗數據，組間采用最小顯著差數法進行兩兩比較，P<0.05 為差異顯著。本論文中的統計分析和數據處理應用軟件IBM spss statistics 22(SPSSInc., Chicago, IL)進行。

2 結果與討論

2.1 普洱茶發酵

分別采用傳統方法與數控發酵系統發酵普洱茶，記錄發酵茶葉溫度與發酵室溫度，見圖1。由圖可知，傳統發酵中，發酵室溫度不可控制，其溫度主要與當地氣候相關。另外，傳統發酵如果發酵堆太小，可能導致茶堆溫度不能上升，存在所謂“冷發酵”問題，降低發酵品質。而數控系統可以通過監測與加溫控制發酵室溫度，即使小框發酵(每框30 kg)，茶葉溫度也可以快速上升，并在24 h內達到40 ℃，達到傳統普洱茶發酵的茶葉溫度。發酵過程中的茶葉取樣監控發現，數控發酵茶葉(色澤、滋味)變化更快，33 d左右已達到傳統發酵的出堆標準，即停止發酵。為了比較本研究中的2種發酵方式，傳統發酵也隨即停止。2種發酵均進行了3次翻堆，加上原料與出堆樣品，各5份發酵樣品。

圖2 傳統與數控發酵茶葉與發酵室溫度Fig.2 The temperature of tea mass and fermentation room in traditional and numerical control fermentation

2.2 普洱茶發酵過程化學成分變化

測定原料與發酵樣品的水浸出物、茶多酚、游離氨基酸、多糖、茶色素、兒茶素、咖啡堿、沒食子酸等化學成分(表2和圖3)，部分測定液相色譜圖見圖3。

圖3(a)發酵過程水浸出物、茶多酚、多糖和咖啡堿的變化；(b)發酵過程兒茶素的變化Fig.3 (a) the changes of water extraction, tea polyphenols, caffeine and soluble sugar during Pu-erh tea fermentation；(b) the changes of catechins during Pu-erh tea fermentation

化學成分原料傳統一翻傳統二翻傳統三翻傳統出堆數控一翻數控二翻數控三翻數控出堆水浸出物/%45.68±0.80bc45.02±1.45b47.92±1.98ab48.19±1.13a43.18±1.33d45.52±1.41ab41.62±0.74cd42.90±0.38c39.78±1.02de茶多酚/%33.66±1.41a32.01±0.97ab31.67±1.08b25.62±1.56c18.59±0.32e25.07±1.95b18.12±1.92c16.50±1.10cd14.22±1.46d可溶性糖/%3.83±0.18e4.90±0.22b3.76±0.31ef4.37±0.38cd4.42±0.20c4.01±0.14b4.51±0.27a3.81±0.27bc3.61±0.05cd咖啡堿/%2.96±0.03ef3.09±0.02cd3.13±0.02cd3.24±0.02ab3.31±0.02a3.20±0.02cd3.39±0.01c3.63±0.02ab3.64±0.03a茶黃素/%0.18±0.01f0.37±0.09a0.30±0.05bc0.33±0.02ab0.26±0.02de0.23±0.01a0.19±0.02cd0.20±0.01b0.19±0.01bc茶紅素/%7.07±0.16ab7.44±0.30a6.49±0.15c6.00±0.21d4.92±0.26f6.33±0.26b3.31±0.35c2.99±0.15cd2.88±0.61de茶褐素/%2.89±0.12f3.64±0.16de3.96±0.70d5.38±0.21c9.32±0.37a3.96±0.13d5.60±0.30c10.13±0.20b11.96±0.37aC/(mg·g-1)5.29±0.51a4.86±0.39bc4.96±0.36b4.39±0.88cd3.17±1.46ef4.89±0.31bc3.77±0.91b4.70±0.36cd4.07±0.56dEC/(mg·g-1)12.33±1.20cd21.21±1.61a19.28±1.31b12.53±2.07c1.36±0.36e18.07±1.03c11.32±1.41d12.09±0.81bc8.80±0.76eEGC/(mg·g-1)38.59±3.46c55.57±4.33a44.54±3.04b30.73±4.43d22.55±2.95e49.00±2.84a28.49±3.24c26.24±2.01cd18.45±4.49eECG/(mg·g-1)38.60±5.33a10.14±0.96b4.45±0.75c2.66±0.80cd2.00±0.85ef15.16±2.55b8.45±2.20c3.58±0.54d2.04±0.76deEGCG/(mg·g-1)98.10±6.90a22.86±1.63b9.38±1.69c3.32±0.80ef7.25±0.48cd34.15±1.57b17.45±1.44c6.50±0.25d3.11±0.22ef兒茶素總量190.42±12.44a114.63±8.37b82.61±5.64c53.63±8.91d36.33±2.34ef121.27±10.77b69.47±11.80c53.11±4.15d36.60±7.22e

由表2和圖3a、圖3b可知，原料經2種方式發酵后，化學物質變化規律基本相同，茶多酚、兒茶素組成及總量降低；咖啡堿含量增加，由原料的2.96%分別增加至傳統的3.31%和數控的3.64%；茶紅素含量降低，而茶褐素增加。2種方式普洱茶發酵的主要化學成分變化符合羅龍新[19]等人的研究。

數控發酵與傳統發酵在發酵過程中，成分含量變化基本一致，數控發酵變化趨勢較大，可縮短發酵時間，提高效率。通過PLC系統控制發酵條件達到化學成分因子可控化，提高普洱茶品質。通過對設備的不斷完善，可精確、快速地控制發酵條件，從而更好地提高普洱茶品質。

圖4 茶樣兒茶素、咖啡堿測定的HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatog rams for determination of catechins and caffeine in tea samples

2.5 香氣分析

應用電子鼻以及PCA對茶湯測定分析發現，發酵樣品與原料香氣顯著不同，在PCA上聚成不同的簇。數控與傳統發酵各階段樣品在PCA上也呈現不同的聚簇，表明其香氣組成不同。感官審評發現，傳統發酵的“堆味”更明顯，而數控發酵樣品“堆味”不顯著，推測這可能是PCA上聚簇分開的主要因素。數控發酵“堆味”不顯的原因可能是因為采用小框發酵堆味產生少、散發快，另外發酵室通風通氣也可能是“堆味”弱的重要原因。傳統茶葉發酵的堆味可能需要1～3年的貯存才能散發，而數控發酵的堆味弱，則可縮短儲存周期，提高產品生產效率與資金周轉率。

圖5 數控與傳統發酵階段樣品茶湯香氣的PCA分析Fig.5 PCA analysis of aroma of tea brew of fermented tea leaves collected in traditional and numerical control fermentation

2.6 感官審評

為了進一步評價2種發酵模式樣品的品質，采用國家標準法對茶葉樣品進行了感官審評，結果見表3、圖6。隨著發酵進行，傳統發酵樣品干茶色澤由原料的墨綠變為紅褐，葉底由黃綠變為紅褐柔軟，湯色由黃綠變為紅亮較濃，滋味由濃醇回甘變為醇和稍澀，發酵一翻、二翻樣品茶湯顯酸味，香氣由清香變為堆味明顯、略帶陳香。數控發酵樣品干茶色澤由原料的墨綠變為紅褐，葉底由黃綠變為紅褐柔軟，湯色由黃綠變為褐紅明亮，滋味由濃醇回甘變為醇厚，香氣由清香變為陳香顯。比較2種發酵方式可以發現，數控發酵樣品變化更快，這與化學成分測定結果相符。

表3 傳統與數控發酵樣品審評結果

2.5 體外抗氧化能力測定

為了進一步比較2種發酵方式，課題組測定了出堆樣品的體外抗氧化活性(表5)。由表可知，2種發酵出堆樣品均具有抗氧化活性，比較可知傳統發酵樣品的總抗氧化活性、超氧陰離子清除活性高于數控發酵樣品(P<0.05)，而羥自由基清除活性低于數控發酵樣品(P<0.05)，傳統發酵樣品與數控發酵樣品之間的DPPH自由基清除活性沒有顯著性差異(P>0.05)。不同自由基清除能力不同，可能與茶葉樣品化學成分不同有關。

表5 傳統發酵數控發酵出堆樣的抗氧化活性比較

注： “對應Vc濃度”是指按GB/T 8312—2002 中11.1 的規定制備茶湯試液。3 g茶的浸提換算為1 g茶167 mL浸提后的抗氧化活性在Vc標準曲線中對應的濃度。其中DPPH自由基清除活性，羥自由基活性茶湯稀釋10倍，即1 g茶溶于1 670 mL水的浸提。*表示2種發酵模式出堆樣品活性有顯著差異(P<0.05)

3 結論

測定發現該數控普洱茶控制系統發酵茶葉的化學成分變化規律與傳統類似，且變化速度更快。感官審評與香氣分析認為數控發酵樣品“堆味”更弱，可縮短后期的陳化時間。傳統與數控發酵出堆樣品都具有一定的抗氧化活性。通過對發酵室溫度、濕度的控制，數控發酵系統可穩定普洱茶品質；由于采用小型發酵框，可實現機械翻堆，為云南普洱茶的清潔化及自動化生產提供了設備基礎。

[1] 蔡新.地理標志產品普洱茶國家標準：GB/T22111—2008[S].北京：中國標準出版社,2008.

[2] 趙龍飛,周紅杰,安文杰.云南普洱茶保健功效的研究[J].食品研究與開發,2005,26(2):114-117.

[3] 趙明,周玲,李家華,等.普洱茶英文科技論文研究概述[J].中國農學通報, 2013,29(35):400-408.

[4] 孫楊鋒,黃云戰,郝強,等.普洱茶發酵潮水機械的設計與應用研究[J].云南農業大學學報(自然科學), 2014,29(1):106-111.

[5] 吳曉強,黃云戰,周紅杰,等.PLC在普洱熟茶生產車間溫濕度控制中的應用[J].廣東農業科學,2014(21):168-171.

[6] 吳曉強,黃云戰,周紅杰,等. PLC在普洱茶渥堆生產自動化中的應用[J].內蒙古民族大學學報(自然科學版),2012,27(3):288-292.

[7] 劉晗.數字化普洱茶發酵系統研究[D].長春：長春理工大學,2013.

[8] 趙永潔,黃云戰,周紅杰,等.普洱茶發酵車間測控系統的設計與實現[J].食品與機械, 2012,28(2):98-101.

[9] 馬振綱,黃云戰, 周紅杰,等.普洱茶發酵清潔化車間的設計及環境濕度的控制[J].云南農業大學學報(自然科學版),2011,26(3):395-399.

[10] 吳紹帥,李亞莉,黃云戰,等.普洱茶發酵自動化生產專利技術的研發[J]. 食品與機械,2011,27(6):183-185.

[11] 馬振綱,黃云戰,劉大鵬,等.基于PLC在普洱茶發酵車間的應用分析與研究[J]. 安徽農業科學,2010,38(19):10 276-10 278.

[12] 周衛龍.GB《茶 水浸出物測定》的測定方法研究[J].中國茶葉加工, 1999(2):36-38.

[13] 張妙芬.茶葉中茶多酚含量測定方法的研究[J].化學工程與裝備,2012(5)152-155.

[14] 傅博強,謝明勇,聶少平,等.茶葉中多糖含量的測定[J].食品科學, 2001,22(11):69-73.

[15] 譚和平,葉善蓉,陳麗,等.茶葉中色素的測試方法概述[J].中國測試,2009,35(2):78-82.

[16] GB/T 23776—2009 茶葉感官審評方法[S].北京：中國標準出版社，2009.

[17] 胡喜蘭,韓照祥,陶瑩,等.DPPH·法測定17種植物的抗氧化活性[J].食品科技,2006(10):264-268.

[18] 韓少華,朱靖博,王妍妍.鄰苯三酚自氧化法測定抗氧化活性的方法研究[J].中國釀造, 2009(6):155-157.

[19] 羅龍新,吳小崇,鄧余良,等.云南普洱茶渥堆過程中生化成分的變化及其與品質形成的關系[J].茶葉科學,1998,18(1):53-60.

Comparison on chemical compounds and antioxidant activity of Pu-erh Tea fermented by numerical control and traditional methods

WANG Xing-hua1， NIAN Bo2， DUAN Shuang-mei2， YAN Liang3， YANG Rui-juan3，CUI Ting-hong1， JIANG Xun1， ZHENG Wen-zhong1， ZHAO Ming2， LUO Chao-guang1*

1( Pu-er Tea Varity Multiplication Farm of Yunnan, Puer 665000,China)2(College of Long Run Pu-erhTea, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201,China)3(Pu′er Institute of Pu-er Tea，Puer 665000,China)

Two fermentations of Pu-erh tea were developed by numerical control and traditional methods, respectively. The chemical compounds of tea leaves were detected by high-performance liquid chromatography (HPLC) and spectrophotometric methods. The quality was compared by electronic nose test and sensory evaluation. Theinvitroantioxidant activity of final fermented tea leaves was also determined and compared. The results showed that the contents of water extraction, tea polyphenols, theabrownin (TB), theaflavin (TF), and catechins were decreased; the contents of thearubigin (TR), caffeine and soluble sugar were increased. However the speed of chemical change in numerical control fermentation was faster than that in traditional fermentation; and the “pile aroma” was lower than that in traditional fermentation. The total antioxidant and superoxide anion radical scavenging activity of final fermented tea leaves in numerical control fermentation were lower than that in traditional fermentation; and hydrogen donating scavenging capacity of final fermented tea leaves in numerical control fermentation was higher than that in traditional fermentation. The DPPH scavenging capacity had no significant difference. In brief, the chemical change rule in numerical control and traditional fermentation was same; and compared to traditional fermentation, the fermentation speed was faster and the flavor was better in numerical control fermentation.

Pu-erh tea fermentation; numerical control; chemical compounds; antioxidant activity; electronic nose

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201705022

農藝師(羅朝光高級農藝師為通訊作者，E-mail：wangxh9733@163.com)。

2016年農業生產發展專項資金-茶葉數字化加工技術研究與推廣項目

2016-12-06，改回日期：2016-12-26